La nefropatía diabética es la causa más común de enfermedad renal crónica terminal. La modulación terapéutica de la angiotensina II retarda, pero no evita, su progresión. La muerte celular contribuye a la pérdida de masa renal en las nefropatías crónicas. Un consorcio europeo empleó la transcriptómica en biopsias renales para identificar nuevos mediadores implicados en la muerte de la célula renal durante la nefropatía diabética. Un 25% de los genes relacionados con la muerte celular estaban expresados diferencialmente en la nefropatía diabética. TRAIL y osteoprotegerina fueron los genes más sobreexpresados, y también estaba aumentado CD74. Las células tubulares y podocitos expresan TRAIL bajo la regulación de citocinas proinflamatorias (MIF vía CD74, TNF). La hiperglucemia sensibiliza a las células renales a la apoptosis inducida por TRAIL, mientras que la osteoprotegerina protege. Estos resultados sugieren que, además de la glucemia, la inflamación y TRAIL pueden ser objetivos terapéuticos en la nefropatía diabética.
Diabetic nephropathy is the most common cause of endstage renal disease. Approaches targeting angiotensin II significantly delay its progression. However, many patients still need renal replacement therapy. High throughput techniques such as unbiased gene expression profiling and proteomics may identify new therapeutic targets. Cell death is thought to contribute to progressive renal cell depletion in chronic nephropathies. A European collaborative effort recently applied renal biopsy transcriptomics to identify novel mediators of renal cell death in diabetic nephropathy. Twenty-five percent of cell death regulatory genes were upor downregulated in diabetic kidneys. TNF-related apoptosisinducing ligand (TRAIL) and osteoprotegerin had the highest level of expression. In diabetic nephropathy, tubular cells and podocytes express TRAIL. Inflammatory cytokines, including MIF via CD74, upregulate TRAIL. A high glucose environment sensitized renal cells to the lethal effect of TRAIL, while osteoprotegerin is protective. These results suggest that, in addition to glucose levels, inflammation and TRAIL are therapeutic targets in diabetic nephropathy.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad renal crónica se caracteriza por una pérdida gradual de la función renal hasta requerir su sustitución por diálisis o trasplante. La insuficiencia renal reduce la esperanza de vida y tiene elevados costes personales, sociales y económicos. El sustrato patológico de la enfermedad renal crónica es una pérdida progresiva de células renales parenquimatosas glomerulares y tubulares. La apoptosis contribuye a la pérdida de células renales1,2, y se asocia con inflamación crónica y con fibrosis. La angiotensina II es un mediador clave de la nefropatía diabética. Los estudios preclínicos mostraron que los efectos pleiotrópicos de la angiotensina promueven el daño tisular más allá de su acción sobre la tensión arterial3. El efecto renoprotector de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (iECAs), y de los antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II) en la nefropatía diabética han sido confirmados en ensayos clínicos4. A pesar de estos avances, la nefropatía diabética es todavía la causa más frecuente de enfermedad renal crónica terminal en los países desarrollados. Solo un conocimiento completo del proceso patogénico que inicia y mantiene el daño renal permitirá el abordaje desde nuevas estrategias terapéuticas con éxito.
Búsqueda de biomarcadores y de dianas terapéuticas mediante técnicas de alto rendimiento
Tradicionalmente, la búsqueda de mediadores de daño tisular entraña una revisión cuidadosa de la literatura a la búsqueda de moléculas con características que pudieran hacerlas relevantes en la lesión renal. Con este abordaje teórico se identifican moléculas de interés potencial y se estudia su expresión en la lesión. Si existen diferencias entre el tejido normal y el dañado, se procede a un análisis funcional en células cultivadas y en modelos animales. El proceso es poco eficaz y consume muchos recursos. La nueva disponibilidad de técnicas de alto rendimiento como la transcriptómica (estudio simultáneo de niveles de expresión de mRNA de miles de genes) o la proteómica (estudio simultáneo de niveles de expresión de múltiples proteínas) permite la identificación de cientos de genes o proteínas en base a su expresión diferencial en la patología. Estos patrones de expresión pueden usarse con fines diagnósticos o pronósticos. Los algoritmos bioinformáticos permiten gestionar la gran cantidad de datos generados, y buscar asociaciones estadísticas con la presencia o progresión de la enfermedad. Recientemente, un panel de 65 biomarcadores proteicos urinarios permitió identificar la nefropatía diabética con una sensibilidad y especificidad del 97%. Además, este panel de biomarcadores identificó a los pacientes con microalbuminuria y diabetes que progresaron a nefropatía establecida en 3 años5. Para identificar nuevos biomarcadores no es necesaria una función patogénica de la molécula. Además, podemos identificar nuevas dianas terapéuticas. La bioinformática permite dar prioridad a las moléculas con mayor o menor nivel de expresión, identificar las moléculas relacionadas con los procesos que participan en la patogenia de la enfermedad, e identificar las relaciones entre las moléculas reguladas diferencialmente. Esto ayuda a reducir el ámbito de las moléculas candidatas a unas cuantas, cuya expresión diferencial puede ser confirmada por RT-PCR a nivel de mRNA y por inmunohistoquímica a nivel de proteína (Figura 1). La inmunohistoquímica identifica las células que expresan la molécula y guía en la elección de modelos funcionales experimentales. Un criterio adicional para elegir una molécula a estudiar en profundidad puede ser la expresión diferencial simultánea de varias moléculas pertenecientes a la misma vía funcional. Este fue el caso de moléculas de la vía de la citoquina TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sobreexpresadas en la nefropatía diabética humana6.
Transcriptómica en riñones diabéticos
El banco europeo de cDNA renal (ERCB), inicialmente financiado por la Unión Europea, se encuentra actualmente en la Universidad de Zurich (http://www.portailderecherche.ch/unizh/p9291.htm). Fragmentos de biopsias renales recogidos en toda Europa fueron clasificados por diagnóstico, se separaron los compartimentos glomerular y túbulo-intersticial, y se extrajo y retrotranscribió ARN total de cada compartimento. Mediante arrays transcriptómicos se estudió la expresión de 22.283 genes y se usó esta información para profundizar en el conocimiento de la patogenia de la nefropatía diabética. A modo de ejemplo, parte del consorcio se centró en la activación de la vía de NFkB. El análisis de este factor de transcripción mostró un aumento de la expresión de 54 de sus 138 dianas conocidas y permitió diferenciar entre nefropatía diabética grave y leve, y a ambas nefropatías de las muestras control7.
Expresión de genes reguladores de la apoptosis en la nefropatía diabética humana
Estudios histológicos sugieren que la muerte celular por apoptosis podría contribuir a la progresiva pérdida de masa renal en la nefropatía diabética1,8. Un 25% de los genes relacionados con apoptosis están regulados diferencialmente en biopsias renales de pacientes con nefropatía diabética6. La figura 2 muestra los genes con más de un 50% de cambio en su expresión frente a riñones sanos. Estos genes codifican diversas proteínas, algunas de ellas implicadas en las interacciones entre citoquinas y receptores de muerte celular, como Fas, TRAIL y OPG (osteoprotegerina). Estos datos son coherentes con el aumento de expresión de Fas descrito previamente en nefropatía diabética9. Las citoquinas que pertenecen a la superfamilia del TNF regulan la supervivencia celular, la inflamación y la fibrosis. Entre ellas, se ha establecido con claridad el papel de TNFa , FasL y TWEAK en la patogénesis del daño renal10-15. Sin embargo, no existía información sobre la relación de TRAIL u OPG con el daño renal.
TRAIL
TRAIL (APO2L/TNFSF10) es un miembro poco usual de la superfamilia del TNF, ya que tiene un complejo sistema de receptores16-18. Dependiendo de los niveles relativos de estos receptores, TRAIL puede ejercer diferentes funciones, como muerte, supervivencia, proliferación o maduración celular19. TRAIL es una proteína transmembrana de tipo II con un peso molecular de 33-35KD, que puede ser liberada de la membrana, conservando el potencial apoptótico. TRAIL se expresa de forma basal en numerosos tejidos, como en hígado, corazón, riñón, pulmón o testículo, lo que sugiere que en condiciones fisiológicas debe tener algún papel no apoptótico sobre células parenquimatosas20. TRAIL induce apoptosis en células cancerosas humanas, y en tumores primarios, pero muestra una mínima toxicidad en células normales. En estos momentos están en marcha ensayos clínicos en los que se emplea TRAIL o agonistas de sus receptores, como terapias anticancerígenas21. No obstante, datos obtenidos a partir de ratones knock out sugieren que TRAIL podría inducir apoptosis en células parenquimatosas normales cuando están inmersas en un contexto inflamatorio22. Hay muy poca información hasta el momento sobre TRAIL en la diabetes y toda ella se refiere a su papel en la regulación de la respuesta inmune23.
Receptores de TRAIL (TRAIL-Rs)
TRAIL tiene un complejo sistema de receptores formado por 4 receptores de membrana y un receptor soluble en humanos. En ratón existen algunas diferencias (sólo existe un receptor letal), aunque el sistema es muy similar24. TRAIL-R1 (DR4/TNFRSF10A) y TRAIL-R2 (DR5/TRICK2/KILLER/TNFSFR10B) contienen un dominio citoplásmico de muerte (DD) necesario para inducir apoptosis18. TRAIL-R3 (TRID/DcR1/TNFRSF10C) y TRAIL-R4 (DcR2/TNFRSF10D) no activan la apoptosis, y se comportan como antagonistas de los receptores letales25 TRAIL-R3 esta anclado a la membrana mediante una unión glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), y carece de dominio intracelular. TRAIL -R4 tiene un DD truncado y no funcional. Actualmente se esta estudiando el papel de estos dos receptores en vías de señalización no apoptóticas. Además, hay un quinto receptor para TRAIL, que carece de dominio citoplasmático y trans-membrana, el receptor soluble-señuelo osteoprotegerina (OPG, TNFRSF11B)26. OPG fue inicialmente descrito como un regulador de la osteoclastogenesis, que se une a la citoquina de la superfamilia del TNF, RANKL (Ligando del Receptor Activador de NFkB)27. La unión de RANKL a su receptor RANK induce la diferenciación, activación y supervivencia de los osteoclastos. OPG actúa como un inhibidor soluble de la interacción RANKL/RANK. El hecho de que OPG actúe como un señuelo para TRAIL y RANKL abre la puerta a un posible cruce entre las acciones de TRAIL, RANKL y OPG. De hecho, la unión de OPG a TRAIL inhibe la asociación entre TRAIL y sus receptores, y por lo tanto, la inducción de apoptosis, y puede bloquear la función de OPG17. Los niveles séricos de OPG están aumentados en pacientes con disfunción renal, incluyendo la nefropatía diabética, y se han relacionado con la calcificación de la arteria coronaria y de la aorta28-30. La afinidad de TRAIL por OPG es menor que frente a sus otros receptores, pero existen datos que apoyan la relevancia biológica de esta interacción20. Los ratones que carecen de OPG tienen calcificaciones de la aorta y de arterias renales, sugiriendo que, además de su bien conocida función en la homeostasis ósea, la regulación de OPG puede desempeñar un papel en la calcificación vascular26.
TRAIL y sus receptores en el riñón
En el riñón sano se expresan tanto TRAIL como TRAIL-R1 y -R2. TRAIL se expresa en túbulos pero no en los glomérulos. TRAIL-R1 tiene un patrón similar de expresión, mientras que TRAIL-R2 se expresa, además, en el asa de Henle. No se ha observado expresión basal de TRAIL-R3 en el riñón sano31 y no hay informes sobre expresión de TRAIL-R4. Los ratones carentes de TRAIL no tienen patología renal, lo que sugiere que no debe ser esencial para el desarrollo y fisiología del riñón.
Interacción entre hiperglucemia y la inflamación en el daño renal por diabetes
Los hallazgos transcriptómicos de una mayor expresión de TRAIL y OPG en la nefropatía diabética humana fueron confirmados por RT-PCR y se correlacionaron con datos clínicos de gravedad de la afectación renal6. En una cohorte independiente, la inmunohistoquímica confirmó la alta expresión de TRAIL. El principal lugar de expresión renal de TRAIL fueron las células tubulares. Además, en la nefropatía diabética se observó expresión de TRAIL de novo en podocitos6,32. La tinción para TRAIL se correlacionó con el grado de atrofia tubular, fibrosis intersticial e inflamación intersticial, lo que sugiere un papel patogénico de TRAIL. Puesto que en la nefropatía diabética está aumentada la expresión de TRAIL y de OPG, dos moléculas potencialmente antagónicas, exploramos su función en células tubulares humanas cultivadas (Figura 3).
Primero estudiamos los factores que regulan la expresión de TRAIL. La hiperglucemia per se no modula la expresión TRAIL. Sin embargo, citoquinas proinflamatorias presentes en las lesiones renales crónicas, incluida la nefropatía diabética15,33, como IFNg y TNFa, aumentan la expresión tubular de TRAIL. Además, la activación de CD74, un receptor para MIF sobreexpresado en la nefropatía diabética (Figura 2) aumentó la expresión de TRAIL en podocitos y células tubulares32.
A continuación abordamos las posibles funciones de TRAIL en células renales. Por si mismo, TRAIL induce apoptosis en las células tubulares de un forma débil, dependiente de la dosis6. Esto es coherente con la lenta progresión de la nefropatía diabética. El microambiente moduló la sensibilidad de las células tubulares a la apoptosis inducida por TRAIL. La combinación de un microambiente con altos niveles de glucosa, y la presencia de citoquinas proinflamatorias, aumentó la susceptibilidad de las células tubulares a la apoptosis inducida por TRAIL. La hiperglucemia puede inducir o facilitar la apoptosis8,34,35. El ambiente inflamatorio o la hiperglucemia producen cambios en la expresión génica de las células tubulares que pueden modificar su sensibilidad a la apoptosis. Entre ellos encontramos una mayor expresión de receptores (Fas, Fn14) y moléculas intracelulares (Bax, Smac/Diablo, FADD) letales, así como una menor expresión de moléculas antiapoptóticas (Bcl2, BclxL)11,14,36-38. TRAIL también induce apoptosis en podocitos humanos cultivados, especialmente en presencia de hiperglucemia32. En la actualidad estamos estudiando el papel de nuevas moléculas, no previamente relacionadas con la apoptosis, que han sido identificadas combinando la genómica funcional con la transcriptómica de riñones diabéticos32,39.
TRAIL activa NFkB, lo que supone la activación de un mecanismo de protección frente a la apoptosis6. En esto TRAIL actúa de forma similar a TNF, que también activa simultáneamente señales de muerte y de supervivencia. El bloqueo de las señales de supervivencia activadas por NFkB provoca un incremento en la tasa de muerte celular. En nuestro sistema, OPG protege de la apoptosis inducida por TRAIL, al comportarse como un receptor señuelo. Si bien OPG pudiera tener otras funciones en la nefropatía diabética, hipotetizamos que el resultado final de la interacción entre los altos niveles locales de TRAIL y de OPG dependerá de la molécula que predomine en un momento dado. Si predomina TRAIL, el resultado será lesión tisular. Si predomina OPG, las células quedarán protegidas de la acción letal de TRAIL.
La expresión de TRAIL y de sus receptores ha sido estudiada en otras enfermedades renales inflamatorias. En túbulos renal proximales y distales de riñones rechazados se demostró un aumento en la expresión de TRAIL, TRAIL-R1 y -R240.
Nuevas preguntas
En medicina cada respuesta genera nuevas preguntas. TRAIL es el gen que codifica proteínas proapoptóticas más sobreexpresado en la nefropatía diabética humana. Todavía debemos explorar que factores adicionales regulan su expresión y la de sus receptores en células renales, así como los mecanismos moleculares de la sensibilización a su efecto letal por la glucosa. Asimismo, es preciso desarrollar estudios preclínicos con intervenciones terapéuticas sobre TRAIL y definir su posible papel como biomarcador.
Conceptos clave
- La creación de perfiles de expresión génica imparciales puede identificar nuevas moléculas con un papel clave en el daño tisular.
- TRAIL y su receptor señuelo osteoprotegerina están sobreexpresados en riñones diabéticos.
- Las citoquinas inflamatorias aumentan la expresión de TRAIL en células renales.
- TRAIL induce apoptosis en células renales en un microambiente con altas concentraciones de glucosa.
- La inflamación y TRAIL pueden ser nuevas dianas terapéuticas en la nefropatía diabética.
AGRADECIMIENTOS
Soporte financiero: FIS 06/0046, ISCIII-RETICS REDINREN RD 06/0016, MEC (SAF 03/884), Sociedad Española de Nefrología. ABM y AS: FIS, MDSN: MEC, ACU, MCI y BS: Fundación Conchita Rabago. AO: Programa de Intensificación de la Actividad Investigadora en el Sistema Nacional de Salud, Instituto de Salud Carlos III y Agencia "Pedro Lain Entralgo", Comunidad de Madrid y CIFRA S-BIO 0283/2006. Miembros del European Renal cDNA Bank-Kroener Fresenius Bank en el momento del estudio: J.P. Rougier, P. Ronco, Paris; M. P. Rastaldi, G. D'Amico, Milano; F. Mampaso, Madrid; P. Doran, H. R. Brady, Dublin; D. Mönks, C. Wanner, Würzburg; A. J. Rees, Aberdeen; F. Strutz, G. Müller, Göttingen; P. Mertens, J. Floege, Aachen; T. Risler, Tübingen; L. Gesualdo, F. P. Schena, Bari; J. Gerth, U. Ott, G. Wolf, Jena; R. Oberbauer, D. Kerjaschki, Vienna; B. Banas, B. Krämer, Regensburg; W. Samtleben, Munich; H. Peters, H. H. Neumayer, Berlin; K Ivens, B. Grabensee, Düsseldorf; M. Zeier, H. J. Gröne, Heidelberg; M. Merta, V. Tesar, Prague; C. D. Cohen, M. Kretzler, D. Schlöndorff, Munich
