INTRODUCCIÓN

Esta revisión analiza la información existente sobre un método diagnóstico comercial que determina in vitro la producción intracelular de adenosina 5’-trifosfato (ATP) en células T CD4+, denominado ImmuKnow®, que emplea sangre completa del paciente y que tiene como objetivo proporcionar una medida global de la respuesta inmunitaria celular de cada individuo. El método fue diseñado originalmente como biomarcador clínico del grado de inmunosupresión farmacológica en trasplante. En concreto, se han investigado tres usos clínicos: reducción del riesgo de infección causada por una excesiva inmunosupresión, sin aumentar el riesgo de rechazo celular; disminución de toxicidad o efectos adversos indeseados de los fármacos inmunosupresores; e individualización de la inmunosupresión.

El éxito del trasplante renal reside en gran medida en el empleo de inmunosupresores potentes que limitan la capacidad del sistema inmunitario de rechazar el aloinjerto. Durante el periodo postrasplante temprano, los receptores reciben habitualmente los fármacos a dosis basadas en mg/kg de peso hasta que se alcanzan los niveles sanguíneos objetivo, los cuales muestran una gran variabilidad interindividual1. En la práctica clínica se debe conseguir el difícil equilibrio entre la sobreinmunosupresión con sus efectos adversos y la infrainmunosupresión y el riesgo de rechazo2. La tasa de supervivencia del injerto a largo plazo no ha cambiado de forma significativa en los últimos 20 años, principalmente debido al empleo de por vida de los inmunosupresores3,4. La posibilidad de minimizar y monitorizar el tratamiento inmunosupresor de forma individualizada en cada paciente permitiría mejorar el pronóstico a largo plazo del trasplante renal y reducir los costes asociados.

MONITORIZACIÓN INMUNOLÓGICA

Resulta imposible controlar en la clínica el estado total de inmunosupresión de un paciente mediante la medición de un único parámetro2. Hasta la fecha, los biomarcadores más empleados en la clínica han sido los farmacocinéticos. Sin embargo, son los biomarcadores relacionados con los efectos farmacodinámicos de los inmunosupresores los que están adquiriendo mayor importancia5. En teoría, el estudio rutinario de un(os) biomarcador(es) ideal(es) identificaría aquellos pacientes con riesgo de sufrir un rechazo agudo, infección o cáncer, y aquellos pacientes susceptibles de minimizar la inmunosupresión. Además, serviría de herramienta fundamental en la monitorización individual de los pacientes con infra o sobreinmunización y podría llegar a complementar y/o sustituir a la monitorización farmacocinética. Dado que el sistema inmunitario responde rápidamente y cambia continuamente, la monitorización de forma regular y repetida al paciente parece fundamental para entender cualquier respuesta inmunitaria.

FUNDAMENTO DE IMMUKNOW®

El uso del ensayo fue aprobado en 2010 por la Food and Drug Administration (FDA) para la detección de la respuesta inmunitaria celular en pacientes sometidos a trasplante de órganos que recibían tratamiento inmunosupresor6,7. Recientemente, el ensayo también ha superado los requerimientos de la directiva europea para diagnóstico in vitro. De forma específica, mide la capacidad de las células T CD4+ de una muestra de sangre completa de reaccionar frente al estímulo policlonal con el mitógeno fitohemaglutinina (PHA) (figura 1). Al igual que los inmunosupresores que se emplean en clínica, la PHA no es específica de ninguna célula T, por lo que refleja la capacidad de cualquiera de sus subtipos para responder. El método cuantifica la cantidad de ATP producido por las células T CD4+ después de toda una noche de incubación con PHA8. La producción de ATP es un fenómeno temprano en el proceso de activación celular y es reflejo de la respuesta al estímulo mitogénico9.

En el caso del trasplante de órganos sólidos, el rechazo agudo cursa fundamentalmente con una activación celular, aunque hay cada día más evidencias acerca de la importancia del rechazo mediado por anticuerpos10. Las células T helper (Th) CD4+ dirigen la respuesta inmunitaria hacia un tipo de respuesta celular (Th1, Th2, Th17, Tregs, etc.) mediante la síntesis y secreción de diversas combinaciones de citocinas según el tipo de antígeno que encuentra. Aunque no es objetivo de la presente revisión tratar los múltiples mecanismos inmunológicos implicados en el rechazo agudo, no se debe olvidar que en todos ellos participan las células T CD4+. La importancia del ensayo es que proporciona una medida funcional global de las células Th y no solo la medida de un metabolito, una célula o el nivel de un fármaco.

Por otro lado, es un método reproducible que minimiza la variabilidad que existe con otros ensayos celulares, la detección mediante citometría de flujo de la producción intracelular de citocinas o la proliferación celular medida por la incorporación de timidina tritiada11,12. Esto lo consigue porque ajusta los controles al volumen de sangre y no al número de células en el ensayo. Se considera que esto reproduce más fehacientemente la situación en el torrente circulatorio que el empleo de un número fijo y artificial de células. La variabilidad esperada de los valores de ATP intracelular producido entre receptores de trasplante es 11,7 %8. La figura 2 A muestra las diferencias en la concentración de ATP producida basada en un volumen de sangre según el número de células CD4+/ul de sangre en un grupo de receptores de trasplante renal sometidos a tratamiento de inducción con timoglobulina seguido de triple inmunosupresión de mantenimiento estándar13. La figura 2 B muestra, además, la falta de correlación entre los valores de ATP del ensayo y los niveles valle de tacrolimus13. Es decir, los resultados de ImmuKnow® no guardan relación ni con el número de células T CD4+ ni con los niveles sanguíneos de los inmunosupresores. Además, la inmunidad celular es específica de cada paciente y, por lo tanto, los cambios que se producen en el tiempo proporcionan un perfil inmunitario individualizado que puede ser pronóstico de fenómenos mediados por la inmunidad celular con relación a una inmunosupresión excesiva o deficiente2,5,14.

IMMUKNOW® Y ASOCIACIÓN CON EVENTOS CLÍNICOS

Un estudio retrospectivo multicéntrico que englobaba a 10 hospitales americanos comparó los valores de ImmuKnow® con la situación clínica de más de 500 receptores de trasplantes de órganos sólidos (riñón, hígado, intestino y corazón). En la tabla 1 se comprueba como los receptores con valores de ImmuKnow® entre 130 y 450 ng/ml de ATP tenían un menor riesgo de sufrir infección o rechazo que los receptores con valores por debajo o encima, respectivamente, de ese rango15. Los receptores con una producción de 280 ng/ml de ATP tenían un valor predictivo negativo del 96 % tanto para infección como para rechazo.

Estos datos se han replicado en otros estudios unicéntricos en trasplantados renales13,16-22. Las áreas bajo la curva ROC oscilaban entre 0,671 y 0,845 para valores de ATP de 180 ng/ml. El estudio realizado por Berglund et al.22 en trasplantados renales, renopancreáticos o hepáticos mostró que las infecciones graves y la mortalidad aumentaba con valores de ATP inferiores a 175 ng/ml. Los valores absolutos del ensayo son específicos de cada centro y dependen de las características específicas de los pacientes y de la carga de tratamiento inmunosupresor suministrado por cada centro. La correlación entre la producción intracelular de ATP y los episodios clínicos que demuestran la mayoría de los estudios reside en que estos se realizaban al diagnóstico o alrededor de unos 30 días tras el episodio. La significación estadística de las correlaciones se pierde cuando el ensayo se realiza 90 días antes del episodio23.

Cada tipo de aloinjerto tiene sus propias características en cuanto a la respuesta inmunitaria que induce. El trasplante renal en particular tiene el riesgo principal de infección por el virus BK23,24. Este virus infecta de forma latente al 95 % de los riñones adultos, pero puede conducir al desarrollo de la nefropatía BK en pacientes inmunocomprometidos. Se ha estimado que el 20-40 % de los trasplantados desarrollan viruria con solo el 12 % de viremia23. Muchos centros monitorizan periódicamente la presencia de viruria y viremia BK mediante Proteína C Reactiva  (PCR)5,26. Una vez que se detecta el virus BK en la sangre, la inmunosupresión se reduce de forma empírica o se eliminan uno o más inmunosupresores.  El riesgo de rechazo aumenta si la inmunosupresión se reduce bruscamente o no se restaura a tiempo27.

El estudio de Batal et al.20 mostró como la medición con ImmuKnow® en trasplantados renales identificaba aquellos pacientes con mayor riesgo de nefropatía por BK. Los pacientes con viremia BK mostraron niveles de ATP medios de 103 ng/ml, mientras que aquellos con viruria o negativos tenían cifras de ATP más elevadas. Dentro del grupo con viruria, aquellos pacientes con niveles de ImmuKnow® más bajos se asociaban con una mayor carga viral en orina y, además, estos niveles bajos se correlacionaban con replicación viral que desembocaba finalmente en el desarrollo de viremia. En el estudio mencionado, de los tres pacientes que desarrollaron nefropatía BK, dos tenían niveles de ATP bajos (50 y 178 ng/ml) 3 y 5 semanas antes del desarrollo de la nefropatía, respectivamente. El tercer paciente fue en principio negativo para BK con cifras de 206 ng/ml de ATP. Diez semanas después, los valores cayeron a 106 ng/ml y el paciente desarrolló viremia BK.

La utilidad de reducir el riesgo de infección monitorizando la inmunosupresión con ImmuKnow® se ha descrito también en la enfermedad linfoproliferativa postrasplante causada por el virus de Epstein Barr y la infección por citomegalovirus (CMV)19,28-30. Una serie de 12 receptores de trasplante renal ingresados por infecciones tenían niveles muy bajos de ATP (rango: 3-178 ng/ml)29. Los pacientes estaban tratados con distintas pautas de inmunosupresión de mantenimiento en el momento de la infección. El tratamiento consistió en reducir o eliminar uno o más de los inmunosupresores que recibían, junto con el empleo de antivirales en algunos casos. Los valores de ATP en las semanas posteriores a ese tratamiento aumentaron al tiempo que las cargas virales desaparecieron o se redujeron a niveles aceptables. No hubo ningún episodio de rechazo. Estos resultados sugieren que la titulación con ImmuKnow® podría servir para monitorizar un aumento de la inmunosupresión con objeto de prevenir el rechazo, una vez que la infección se resuelve.

Un estudio prospectivo observacional con 49 trasplantados renales, que recibieron terapia de inducción con basiliximab y de mantenimiento con tacrolimus, micofenolato mofetilo (MMF) y esteroides, sin criterios de selección, determinó la producción de ATP mediante ImmuKnow® a los 7, 14, 21 y 42 días, y a los 3, 6 y 12 meses postrasplante19. Diecisiete (34,6 %) receptores tuvieron infecciones que incluyeron: 11 con infección por CMV, 2 con enfermedad invasiva del estómago y colitis, 2 con viruria y viremia por BK y dos con infección bacteriana. Todos los episodios infecciosos se acompañaron de cifras bajas de ATP. La replicación del CMV se predijo a partir de los valores bajos de ATP en el 57,1 % antes de la aparición de manifestaciones clínicas. La reducción de la inmunosupresión redujo significativamente la replicación del BK. Tres trasplantados mostraron signos clínicos y de laboratorio característicos de rechazo que se confirmaron mediante biopsia, pero solo uno mostró cifras elevadas de ATP. Por lo tanto, el estudio demostró la utilidad de ImmuKnow® para detectar infecciones y modificar la inmunosupresión, sin suponer un riesgo de rechazo celular. La utilidad de ImmuKnow® para predecir el riesgo de infección se ha demostrado recientemente en dos metanálisis en trasplante renal31 y hepático32, y se esquematiza en la figura 3.

Al igual que ayuda a predecir el riesgo de infección asociado a un exceso de inmunosupresión, ImmuKnow® también se ha evaluado como método de intervención para evitar toxicidades asociadas a la inmunosupresión en el paciente trasplantado, como ocurre con los corticosteroides, que pueden ocasionar una elevada morbilidad33-37. Los protocolos experimentales diseñados para reducir, evitar o eliminar el uso de esteroides en trasplante han incorporado como herramienta de monitorización el ensayo ImmuKnow®. Así, un ensayo clínico que incluyó 57 trasplantados renales, de los que 27 fueron aleatorizados para reducir de forma rápida la dosis de corticosteroides, evaluó la utilidad de ImmuKnow®38. Durante el ensayo, 53 % de los pacientes controles fueron diagnosticados de infección y 56 % de estos, además, tuvieron varias infecciones. En cambio, solo el 22 % de los pacientes aleatorizados desarrollaron infecciones y ninguno tuvo infecciones repetidas (p < 0,05). No hubo diferencias en la tasa de rechazo entre ambos grupos. En este ensayo, el empleo de ImmuKnow® para monitorizar la respuesta inmunitaria facilitó la reducción de los episodios de infección, su duración y la eliminación de los esteroides.

En trasplante renal, pero también en otros trasplantes de órganos sólidos, puede ser útil reducir, limitar o eliminar la inmunosupresión con fármacos anticalcineurínicos (ACN)36,39-42. Dos macrólidos, sirolimus y everolimus, inhibidores del mammalian target of rapamycin (mTOR) se emplean como alternativa a los ACN en el tratamiento inmunosupresor de mantenimiento. Un estudio comparó los niveles de ATP en trasplantados renales estables mantenidos con monoterapia de sirolimus con sujetos controles sanos y mostró como el tratamiento con sirolimus indujo unas cifras significativamente más bajas de ATP, junto con un mayor grado de inhibición de la proliferación en cultivo mixto linfocitario y menor producción de interleucina 10 (IL-10)43. Otros trabajos también han demostrado que unos valores muy bajos de ATP se acompañaban de menor producción de IL-10 y un mayor riesgo de infección bacteriana44. Estos resultados son similares a los de otro estudio en 18 trasplantados renales que analizó las cifras de células T reguladoras y la producción de ATP tras la conversión a inhibidores de mTOR desde ACN41. El número de células T reguladoras aumentó en más del 80 % de los pacientes convertidos y se correlacionó directamente con un descenso de producción de ATP desde 328 a 248 ng/ml de media.

Un ensayo de dos ramas con 25 trasplantados renopancreáticos convertidos desde un tratamiento de mantenimiento con sirolimus, ciclosporina y corticosteroides a otro con sirolimus y ácido micofenólico (MPA) empleó ImmuKnow® para monitorizar prospectivamente la respuesta inmunitaria37,40. Las cifras de ATP caían ligeramente y de forma progresiva en los 6 meses de la conversión. Posteriormente, las cifras se estabilizaban de forma gradual durante el resto del año de seguimiento posconversión. En este ensayo, dos pacientes mostraron valores de ATP permanentes por debajo de 100 ng/ml y uno de ellos desarrolló enfermedad por CMV. En estos pacientes, se redujo la dosis de MPA a la mitad aproximadamente y los valores de ATP aumentaron.

Un ensayo multicéntrico de eliminación de esteroides, aleatorizado en 3 ramas con 126 trasplantados renales, evaluó ImmuKnow® como biomarcador de la inmunidad celular junto con otros métodos, como EliSpot, citometría de flujo, anticuerpos específicos de donante y compatibilidad HLA38. Las tres ramas recibieron timoglobulina y prednisona como tratamiento de inducción hasta el día 5 postrasplante. Los niveles de ATP se cuantificaron antes y después de este tratamiento de inducción. De media, los valores de ATP disminuyeron de 322 a 172 ng/ml de ATP antes de la aleatorización. El análisis multivariante de los datos mostró que una cifra de ATP > 375 ng/ml fue la única variable que se correlacionó (p = 0,04) con rechazo agudo celular y con cifras de creatinina inestables postrasplante.

Nuestro grupo21 ha analizado prospectivamente InmuKnow® en trasplantados renales en distintas situaciones clínicas. El ensayo se empleó para identificar pacientes con riesgo de rechazo o infección y la información obtenida se mostró útil para monitorizar la inmunosupresión. El trabajo concluyó que, en trasplantados renales estables o infectados con valores bajos de ATP, la dosis de inmunosupresión puede reducirse de forma segura sin incrementar el riesgo de rechazo. En pacientes estables o con rechazo y cifras de ATP elevadas, la dosis de inmunosupresión puede incrementarse o añadirse otros inmunosupresores para evitar el daño inmunológico al injerto, aunque parece aportar más información útil en casos de niveles bajos de ATP, sobreinmunosupresión, que en el caso contrario.

Otro estudio retrospectivo monitorizó la producción de ATP antes y después del trasplante renal en 64 receptores16 y lo comparó con el tipo de inmunosupresión, dosis y niveles sanguíneos, concentración sérica de creatinina, cifras de leucocitos, tipaje HLA, anticuerpos preformados, efectos adversos, infecciones y rechazos. No hubo asociación del ensayo con ningún tipo de test clínico, pero sí se observaron cifras elevadas de ATP pretrasplante en aquellos con más episodios de rechazo (8/10), mientras que los pacientes con bajas cifras de ATP tenían más infecciones (6/10; p < 0,001). Los pacientes que recibieron tratamiento para el rechazo mostraron un descenso de las cifras de ATP medidas a los 5 días de inicio del tratamiento (p = 0,002).

El manejo de la inmunosupresión ha adquirido un factor más de complejidad con la aparición de los preparados genéricos de ACN y MMF. La estrecha ventana terapéutica de estos fármacos y el elevado grado de variabilidad entre pacientes aumenta la dificultad, puesto que no se trata solo de cambiar de un fármaco comercial innovador a la fórmula genérica. Es probable que el empleo del ensayo revisado aquí antes y durante el cambio al preparado genérico (de forma similar a los estudios desde ACN a imTOR) pueda servir como herramienta de seguridad para el clínico y tener resultados en términos de acción global sobre la inmunidad celular en relación con los cambios en los inmunosupresores.

En la tabla 2 se resumen las situaciones clínicas en trasplante renal donde la medición de la producción intracelular de ATP podría resultar de interés.  Debe considerarse que InmuKnow® es un método de laboratorio caro, en gran medida por ser novedoso y no estar implantado aún en el mercado. No obstante, el precio del método es equiparable a muchas de las pruebas genéticas disponibles en la clínica e inferior a muchas de las pruebas de imagen (tomografía axial computarizada, resonancia magnética nuclear, etc.) que se solicitan diariamente en un hospital. En todo caso, no debe considerarse una prueba abierta del catálogo, sino que su petición deberá estar bien demostrada y tener una clara implicación en el manejo del trasplantado renal, lo cual mejorará la eficiencia de la prueba.

Agradecimientos

Queremos agradecer las sugerencias y comentarios aportados por el Dr. Kowalski en la redacción del manuscrito.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés potenciales relacionados con los contenidos de este artículo.

Conceptos clave

Tabla 1. Resumen del número de rechazos e infecciones por órgano trasplantado y su relación con los niveles de ATP detectados

Figura 1. Esquema explicativo del ensayo para medir in vitro la función global de las células T CD4+ sanguíneas

Tabla 2. Posibles indicaciones de la medición de ATP intracelular en trasplantados renales

Figura 2. Efecto del número de células T CD4+ en sangre y de los niveles sanguíneos de tacrolimus en la producción de ATP intracelular.

Figura 3. Propuesta de los rangos de niveles de producción de ATP intracelular asociados con riesgo de infección en trasplante renal de acuerdo a la bibliografía publicada hasta el momento