*Unidad de Investigación, ¿Servicio de Nefrología, ¿Servicio de Radiodiagnóstico. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

Las Palmas de Gran Canaria.

Correspondencia: Dr. José Carlos Rodríguez Pérez

Unidad de Investigación

Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín

Barranco de la Ballena s/n

35010 Las Palmas de Gran Canaria

E-mail: jrodperd@gobiernodecanarias.org

La poliquistosis renal autosómica dominante es una enfermedad hereditaria responsable del 6% de los casos de insuficiencia renal terminal en España. En la década de los 90 se identificaron los dos únicos genes relacionados con la enfermedad hasta el momento, en los cromosomas 16 y 4 (PKD1 y PKD2). El diagnóstico de esta enfermedad de desarrollo dependiente de la edad puede realizarse fácilmente mediante ecografía, pero el diagnóstico molecular mediante el análisis de ligamiento ofrece la ventaja de la detección precoz de individuos asintomáticos portadores del defecto genético, con vistas al seguimiento preventivo de estos individuos y al consejo genético.

En este trabajo presentamos los resultados del análisis molecular de 30 familias con poliquistosis renal de la provincia de Las Palmas, realizado mediante análisis de ligamiento con dos series de marcadores polimórficos localizados en las inmediaciones de los genes PKD1 (D16S521, KG8, AC2.5, CW2, SM7) y PKD2 (D4S1538, D4S1534, D4S423, D4S414). Los objetivos del trabajo fueron: primero, comprobar el grado de informatividad y, por tanto, la utilidad de estos microsatélites para los estudios familiares de la PQRAD en nuestra población; y segundo, determinar la sensibilidad y especificidad del análisis genético en nuestra población.

La mayoría de los marcadores mostró una alta heterocigosidad, comparable a la de otros estudios. Considerar los alelos de los distintos marcadores presentes en un mismo cromosoma conjuntamente, como un haplotipo, aumentó la informatividad de los marcadores y permitió la identificación inequívoca de los datos genéticos en el 97.7% de los pacientes y en el 88.7% de los individuos sanos. La sensibilidad y especificidad del análisis genético fueron del 90.7% (IC 95%: 85.7-95.7) y 86.8% (IC 95%: 80.6-93.0), respectivamente.

Palabras clave: poliquistosis, diagnóstico precoz, consejo genético, microsatélites.

Adult Dominant Polycystic Kidney Disease is an hereditary condition responsible for 6% of end-stage renal failure in Spain. Two genes were localized in chromosomes 16 and 4 as related to this age-dependent disease in the 90s (PKD1 and PKD2). The diagnosis can be easily achieved by sonographic study, but molecular analysis by means of linkage analysis has the advantage of an early diagnosis in asymptomatic genetic carriers, with a view to the preventive follow-up of these subjects and genetic counselling.

In this paper we present the results of molecular analysis of 30 families with Adult Dominant Polycystic Kidney Disease (all from the province of Las Palmas, Spain), undertaken by linkage analysis with two series of microsatellite markers located within or in the vicinity of PKD1 (D16S521, KG8, AC2.5, CW2, SM7) and PKD2 (D4S1538, D4S1534, D4S423, D4S414) genes. The objectives of the study were: first, to verify the informativeness, and therefore, the usefulness of these markers for family studies in our population; and second, to assess the sensitivity and specificity of the genetic analysis in our population.

Most of the markers showed a high heterozigosity, comparable to data in other studies. Considering the alleles of the different markers together in a chromosome as an haplotype increased the informativeness of the markers, and allowed the unequivocal identification of genetic data in 97.7% of patients and 88.7% of healthy subjects. The sensitivity and specificity of the genetic analysis were 90.7% (CI 95%=85.7-95.7) and 86.8% (CI 95%=80.6-93.0), respectively.

Key words: polycystic disease, early diagnosis, genetic counselling, microsatellite markers.

La poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD) es una enfermedad hereditaria responsable del 6% de los casos de insuficiencia renal terminal en España1. Se trata de una de las enfermedades hereditarias más frecuentes, con una prevalencia que varía entre uno de cada 400 a uno de cada 1000 individuos en población blanca2, y un patrón de herencia dominante. Se caracteriza por la formación de múltiples quistes en los riñones, que van deteriorando progresivamente la función renal hasta llegar a la insuficiencia renal terminal. Igualmente, se originan quistes en otros órganos como el hígado, el bazo o el páncreas. Las complicaciones extrarrenales incluyen trastornos gastrointestinales y/o cardiovasculares, siendo las más graves las anomalías de las válvulas cardíacas, la disección de la aorta torácica y el aneurisma intracraneal. Los pacientes ven muy deteriorada su calidad de vida debido a las múltiples complicaciones de la enfermedad. La hipertensión arterial (HTA) afecta al 60% de los pacientes antes de que aparezca la insuficiencia renal2.

En 1994, el Consorcio Europeo de la Poliquistosis Renal identificó el primer gen relacionado con la PQRAD, denominado PKD1 y localizado en el cromosoma 163. Un segundo gen (PKD2) fue localizado posteriormente en el cromosoma 44,5. En el 85-90% de las familias afectadas la enfermedad está asociada con el gen PKD1, mientras que el 10-15% restante se asocia con el PKD26,7. A pesar de que la enfermedad de los individuos PKD1 y PKD2 presenta los mismos rasgos clínicos generales, existen diferencias en la progresión de la enfermedad y la mortalidad, siendo la enfermedad asociada a PKD1 la más grave y la que comienza a manifestarse antes.

Las proteínas codificadas por los genes PKD1 y PKD2 se denominan poliquistina-1 y -2, respectivamente. A día de hoy se sabe que son proteínas de membrana implicadas en la recepción y transducción de señales intracelulares 8-10 en procesos como la proliferación o la apoptosis. Las mutaciones en los genes que codifican a las poliquistinas originan proteínas funcionalmente defectuosas que alteran los procesos mencionados, además de las propiedades de polarización y transporte transcelular de las células epiteliales renales11. Esto tiene como resultado el crecimiento incontrolado del tejido y la acumulación de líquido en los quistes que caracteriza a la enfermedad poliquística.

El diagnóstico de la PQRAD se realiza habitualmente mediante ecografía. Sin embargo, las pruebas genéticas pueden ser utilizadas si los resultados ecográficos no son concluyentes, como prueba complementaria, o si se requiere un diagnóstico definitivo en una persona menor de 30 años. El diagnóstico molecular no puede predecir el momento de comienzo, la severidad, el tipo de síntomas o el grado de progresión de la enfermedad. Sin embargo, permite una intervención precoz en cuanto al seguimiento y tratamiento de la HTA, infecciones y litiasis, que puede retrasar la aparición de la insuficiencia renal12. Otra aplicación importante del diagnóstico molecular es el consejo genético familiar, consistente en informar al individuo afecto sobre la enfermedad, su modo de herencia y los riesgos de transmitirla a su descendencia. La probabilidad de que un individuo poliquístico transmita el gen causante de la enfermedad a un hijo es del 50%.

El diagnóstico genético puede realizarse por búsqueda directa de la mutación o de forma indirecta, mediante análisis de ligamiento. El análisis mutacional presenta dificultades debido al gran tamaño y complejidad del gen PKD1, y a la gran cantidad de mutaciones y polimorfismos descritos en dicho gen, que hace difícil distinguir los cambios patogénicos de los neutrales. Con el análisis de ligamiento se estudia la transmisión de padres a hijos de una serie de marcadores polimórficos localizados en el gen de interés o en sus proximidades, lo que permite la identificación de individuos portadores antes de que aparezcan síntomas de la enfermedad.

En este trabajo presentamos los resultados del análisis molecular de 30 familias con PQRAD de la provincia de Las Palmas, realizado mediante análisis de ligamiento con marcadores de las regiones cromosómicas donde se localizan los genes PKD1 y PKD2. Los objetivos del trabajo fueron: primero, comprobar el grado de informatividad y, por tanto, la utilidad de estos microsatélites para los estudios familiares de la PQRAD en nuestra población; y segundo determinar la sensibilidad y especificidad del análisis genético con dichos marcadores en nuestra población.

Material y métodos

Se incluyeron en el estudio 30 familias seleccionadas a partir de pacientes con diagnóstico de PQRAD, procedentes del Servicio de Nefrología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín (24 familias) y de la Unidad de Genética del Complejo Hospitalario Materno-Insular (6 familias), siendo estos dos hospitales los centros de referencia para la enfermedad en la provincia de Las Palmas. Estas familias aportaron un total de 248 individuos al estudio, de los cuales 116 tenían un diagnóstico previo de PQRAD. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes en el estudio antes de su inclusión en el mismo.

Estudio ecográfico

Los criterios de diagnóstico ecográfico consistieron en la existencia de al menos dos quistes (considerando los dos riñones en conjunto) en individuos de menos de 30 años, dos quistes en cada riñón en individuos entre los 30 y los 59 años y cuatro quistes en cada uno en individuos de edad igual o superior a los 60 años13. Los sujetos que cumplían estos criterios fueron clasificados como pacientes. Estos criterios han sido acordados por los laboratorios europeos y tienen una sensibilidad de prácticamente el 100% para los pacientes mayores de 30 años o para pacientes más jóvenes con mutaciones en PKD1, y del 67% para pacientes menores de 30 años con mutaciones en PKD214. Todas las ecografías fueron realizadas en la Sección de Ecografía del Servicio de Radiodiagnóstico del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín por un único ecografista (CRHS), con un ecógrafo doppler color de alta gama, modelo Aplio 80 ¿SSA-770A¿ (Toshiba, Tokio, Japón) con transductor sectorial convex de 3.75 MHz.

De cada individuo se obtuvo una muestra de 10 ml de sangre periférica de la que se extrajo el ADN mediante precipitación salina15. Para el análisis genético se utilizaron cinco marcadores PKD1 (D16S521, KG8, AC2.5, CW2, SM7) y cuatro PKD2 (D4S1538, D4S1534, D4S423, D4S414), analizándose los nueve marcadores en todas las familias. Los marcadores fueron amplificados, utilizando cebadores descritos previamente16-18 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un volumen final de 15 µl, con 50 ng de DNA, MgCl2 1.5 mM (0.5 mM para KG8), dNTPs 200 µM, 4 pmoles de cada cebador y 0.5 U de polimerasa EcoTaq (Ecogen, Barcelona, España). El protocolo de amplificación se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems, Foster City, EEUU), y consistió en una desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, seguida de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC. Se realizó un paso de extensión final a 72ºC durante 20 minutos.

Los amplificados de los distintos marcadores fueron mezclados con el fin de obtener una sola muestra por paciente. A 1 µl de cada una de estas mezclas se añadieron 0.2 µl del marcador de peso molecular GeneScan-500-ROX (Applied Biosystems) y 20 µl de formamida desionizada. Las muestras así preparadas fueron desnaturalizadas a 95ºC durante 2 minutos y enfriadas rápidamente en hielo antes de ser analizadas por electroforesis capilar en un secuenciador ABI PRISMTM 310 (Applied Biosystems).

Análisis de los resultados

Se calculó el porcentaje de individuos heterocigotos en una muestra de 74 individuos no relacionados, constituida por los cónyuges y un paciente por familia (caso índice). Este porcentaje es considerado como una de las medidas del grado de informatividad de marcadores polimórficos19.

Para el análisis de ligamiento, de dos puntos, se utilizó el programa MLINK del paquete LINKAGE (PC DOS v5.2, Columbia University, Nueva York). En los cálculos del lod score20 se consideró una frecuencia de 0.001 para PKD1 y 0.0001 para PKD2. Se definieron 3 clases de penetrancia, con valores de 0.64 (individuos <20 años), 0.92 (20-30 años) y 1 (>30 años) para PKD1, y valores de 0.50, 0.85 y 0.95, respectivamente, para PKD221. Para aumentar la potencia del análisis de ligamiento se definió un nuevo marcador consistente en el conjunto de los alelos de los distintos microsatélites en cada uno de los cromosomas (haplotipo). Mediante el análisis de los árboles genealógicos se identificó el haplotipo responsable de la transmisión de la enfermedad en cada familia (haplotipo transmisor). Se consideró como orden de los marcadores en los respectivos cromosomas el publicado en estudios anteriores16-18, 22, 23 y en la base de datos de la Fundación Jean Dausset-Centre d¿Etude du Polymorphisme Humain (http://www.cephb.fr).

Para la comparación de edades medias se utilizó el test de la t de Student.

Resultados

De los 248 individuos a los que se realizó el análisis genético, 129 presentaban quistes cumpliendo los criterios ecográficos para ser considerados pacientes, y 115 fueron clasificados como sanos. Las edades medias de ambos grupos, la distribución de sexos y la clasificación genética se muestran en la tabla I. A cuatro individuos no se les pudo realizar la ecografía, por lo que no fueron incluidos en ninguno de los dos grupos. De ellos, dos no eran portadores del haplotipo transmisor, uno sí, y el último fue clasificado como indeterminado desde el punto de vista genético por falta de informatividad de los marcadores. De los pacientes, 13 son nuevos diagnósticos.

De las 30 familias analizadas, los haplotipos PKD1 fueron identificados con claridad en 29 de ellas, y en 28 familias en el caso de los haplotipos PKD2. En las familias en las que no pudo establecerse el haplotipo (familia nº13 para PKD1 y familias nº15 y 23 para PKD2), debido a la escasa informatividad de los marcadores y al pequeño tamaño de las familias en cuestión, no se realizó el análisis de ligamiento (tabla II). Veintiocho familias mostraron datos genéticos compatibles con el ligamiento a PKD1, y en una de ellas (nº15) se excluía dicho ligamiento. En la tabla II se muestra la distribución de pacientes e individuos sanos por familias y los valores de lod score obtenidos en el análisis de ligamiento para los marcadores PKD1 y PKD2. La sensibilidad y especificidad del análisis genético fueron del 90.7% (IC 95%: 85.7-95.7) y 86.8% (IC 95%: 80.6-93.0), respectivamente.

En las 21 familias con resultado claro de ligamiento a PKD1 (familias 1-8, 10-12, 19, 20, 22, 23 y 25-30) se encontraron 15 haplotipos transmisores distintos. Uno de los tres haplotipos que se repetían estaba presente en cuatro familias, otro en tres, y el tercero aparecía en dos familias. El número de haplotipos PKD1 no transmisores distintos fue de 110 de un total de 125. Se detectaron quince eventos de recombinación entre los marcadores PKD1, seis de los cuales implicaban al cromosoma identificado como transmisor. En el caso de los marcadores PKD2, se detectaron trece eventos de recombinación. El rango de tamaño de los alelos y los porcentajes de heterocigotos encontrados para cada marcador se muestran en la tabla III.

En cuanto a las características clínicas de los pacientes pertenecientes a las 21 familias con ligamiento a PKD1, la causa de diagnóstico más frecuente fue la historia familiar (tabla IV). No se observan diferencias significativas entre hombres y mujeres con respecto a la edad media al diagnóstico de la enfermedad, la hipertensión o el comienzo del tratamiento renal sustitutivo (TRS) (tabla V). El número de pacientes en TRS, así como la prevalencia de hipertensión y patología vásculo-cerebral, coronaria y vascular periférica se muestran en la tabla VI.

La poliquistosis renal es la cuarta causa de insuficiencia renal crónica en Canarias, y representa el 8% del total de enfermos en diálisis en nuestra comunidad (Registro de Enfermos Renales, Sociedad Canaria de Nefrología, 2004). El análisis genético en familias con antecedentes de PQRAD es importante por varias razones. En primer lugar, hace posible el consejo genético. En segundo lugar, facilita el seguimiento preventivo de los individuos portadores del haplotipo transmisor. Y, por último, la exclusión inequívoca de la enfermedad en familiares de pacientes les permite vivir sin la incertidumbre de padecer la enfermedad en el futuro, y servir como donantes de riñón llegado el caso.

Los valores de sensibilidad y especificidad obtenidos (90.7 y 86.8%, respectivamente) confirman la validez del análisis genético con los marcadores escogidos para este estudio en nuestra población. La mayoría de los marcadores se encuentra en heterocigosis en un porcentaje de individuos que varía entre el 68.9 y el 78.4% (tabla III), rango considerado de alta informatividad24. Sólo los marcadores KG8 y SM7 (PKD1) presentan porcentajes menores, que no suponen una gran desventaja para el análisis debido al empleo conjunto de los otros tres marcadores. Los porcentajes de individuos heterocigotos encontrados son similares a los de otros trabajos16,21 y a los publicados en la base de datos Human Genome Database (tabla III). Este grado de informatividad se traduce en una identificación inequívoca de los haplotipos PKD1 en un 96.7% de las familias de nuestro estudio, y de los PKD2 en un 93.3% de las mismas. Considerando los individuos, los datos genéticos fueron claramente interpretables (tabla I: genética (+), (¿) o recombinante) en un 97.7% de los pacientes, y en un 88.7% de los individuos sin quistes.

En el análisis de ligamiento de dos puntos, 18 de las familias obtuvieron un valor de lod score próximo o superior a 1 para PKD1 (tabla II). En la familia nº15, en la que el valor es mucho menor que ¿2.00, se excluye el ligamiento a PKD1. Este posible ligamiento a PKD2 no pudo ser confirmado por falta de informatividad de los marcadores. En el resto de los casos en los que el lod score es claramente inferior a 1 (valores £ 0.60), el ligamiento a PKD2 queda excluido en 3 de las familias (nº 12, 19 y 30). En las demás, los valores de lod score se encuentran en el rango de ¿1.02 a 0.58, tratándose de familias con 5 o menos miembros en la mayoría de los casos, en las que además los individuos con riesgo de haber heredado el haplotipo transmisor tienen menos de 30 años, lo que disminuye la potencia del análisis. Estas familias seguirán siendo objeto de seguimiento en los próximos años, procurando incorporar al estudio más miembros, con el fin de obtener resultados concluyentes en el diagnóstico genético.

Con respecto a las características clínicas de los pacientes PKD1 de nuestro estudio hay que señalar que la primera causa de diagnóstico de la enfermedad es la historia familiar, seguida de la HTA (tabla IV), al igual que se encontró en otros trabajos realizados en población española25, 26. Las edades en el momento del diagnóstico de la enfermedad y la hipertensión, y el inicio del TRS de nuestros pacientes PKD1 (tabla V) son similares a las del estudio de Torra y cols.26. Los porcentajes de pacientes en TRS y con hipertensión son, sin embargo, superiores en nuestro estudio (tabla VI), aunque estos datos podrían resultar modificados si se dispusiera de esta información en todos los casos.

Los resultados de este estudio no parecen apuntar hacia la existencia de un efecto fundador de las mutaciones PKD1 en nuestra población, como se ha podido observar en un trabajo realizado en las islas Seychelles27, e incluso en población canaria en el caso de la hiperoxaluria primaria tipo 128, ya que sólo un pequeño número de haplotipos transmisores se repite en familias distintas. Sin embargo, para comprobar esto sería necesario hacer el análisis de mutaciones, ya que muchos de los haplotipos distintos difieren sólo en uno o dos marcadores, y podrían ser producto de una recombinación que conservara la mutación. Como se menciona en los resultados, se detectaron 6 haplotipos PKD1 transmisores recombinados, pero no se puede descartar la presencia de otros que no hayan podido ser detectados por haberse producido en una generación anterior a la primera estudiada. No obstante, hay que tener en cuenta que las Islas Canarias han recibido en los últimos cinco siglos un flujo continuo de población foránea de origen europeo y africano, principalmente, por lo que no se consideraría como una población aislada a pesar del carácter insular de su territorio.

Nuestro estudio no ha identificado a ningún portador del haplotipo transmisor asintomático (tabla I: sanos con genética (+)). Sin embargo, hay que tener en cuenta que en 13 individuos sin quistes los marcadores no mostraron informatividad suficiente como para clasificarlos inequívocamente como portadores o no portadores (genética indeterminada). De ellos, 4 tienen menos de 30 años, por lo que es posible que entre estos sujetos haya portadores que hubieran sido detectados si la informatividad de los marcadores en esas familias concretas hubiese sido mayor.

A la luz de los resultados de este y otros trabajos14, la ecografía sigue mostrándose como una técnica muy sensible y asequible para el diagnóstico presintomático de la PQRAD. Dada la relativa poca utilidad del diagnóstico a edad temprana, debido a la falta de tratamiento en la actualidad, el análisis de ligamiento estaría indicado sobre todo cuando se demanda consejo genético. Sin embargo, esto podría cambiar en el futuro, gracias a los avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la enfermedad y genes modificadores, que podrían llevar, si bien no a curarla, sí al desarrollo de fármacos que frenaran su progresión29, 30.

En resumen, a pesar de sus limitaciones, derivadas de la necesidad de que participe en los estudios familiares un número suficiente de individuos afectos y sanos, de la edad de los individuos con diagnóstico ecográfico negativo y de la informatividad de los marcadores para cada familia concreta, el análisis de ligamiento con dos series de marcadores polimórficos localizados en las inmediaciones de los genes PKD1 y PKD2 se ha mostrado como una herramienta útil para el diagnóstico genético de la PQRAD en nuestra población.

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