Se recogieron las muestras de orina de 25 pacientes varones afectos de DD1 con diagnóstico genético confirmado y de 10 donantes sanos de la misma edad y sexo en diferentes hospitales de España para su procesamiento en el Hospital Universitari Vall d’Hebrón (Barcelona, España) (fig. 1A). El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Vall d’Hebron (PR(AG)149/2020/ 314/C/2020). La tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) se calculó utilizando la fórmula CKD-EPI13.

Figura 1.

Obtención de las muestras y aislamiento de uEV. A) Mapa de España con la distribución geográfica de los centros que participaron en este estudio. B) Representación gráfica del protocolo de extracción de uEV de la orina de pacientes o controles.

uEV: vesículas similares a exosomas urinarios.

(0.28MB).

El aislamiento de uEV se realizó de acuerdo con el protocolo previamente descrito por nuestro grupo14. Este proceso se muestra en el esquema de la figura 1B.

La cuantificación y distribución de la medida de los uEV se analizó mediante la técnica de nanoparticle tracking analysis (NTA) (NanoSight NS300, Malvern Instruments, Reino Unido). Dicho equipo utiliza la dispersión de la luz y el movimiento browniano para obtener la medida y la concentración de las partículas en suspensión15,16. Dichos parámetros se registraron con una cámara de alta sensibilidad y las imágenes obtenidas se analizaron con el programa NTA v3.1 (NanoSight Ltd., Malvern Instruments, Reino Unido) en el Institut de Ciència de Materials de Barcelona (ICMAB-CSIC), en la Universitat Autònoma de Barcelona (España).

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM) se realizó en el Centro de Microscopía de la Universitat Autònoma de Barcelona. Se aplicaron 10μl de uEV diluidos en PBS 1x en rejillas Formvar-Carbon EM y se congelaron en etanol líquido enfriado a –179°C. Las muestras se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM 2011 a un voltaje de aceleración de 200kV.

Los uEV en suspensión se incubaron con tampón de lisis 1:1 (Tris-HCl 100mM pH 7,5, EDTA 2mM, pH 8, NaCl 300 mM, SDS 0,2%, NP-40 2%, desoxicolato de sodio 0,5%, PIC 1:200, NaF 1 mM, Na 3VO 1 mM) a 4°C en rotación constante durante 1h. A continuación, las muestras se sonicaron a máxima amplitud durante 5 ciclos de 5 segundos y, luego, se centrifugaron a 13.000 xg durante 15 min a 4°C. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a –20°C. Los lisados de uEV se procesaron y analizaron por western blot.

Para la extracción del ARN de los lisados de uEV previamente caracterizados se utilizó el kit miRNeasy Mini (Qiagen). La cuantificación de los niveles de ARN se realizó utilizando el BioAnalyzer 2100 en combinación con el kit ARN 6000 Pico LabChip.

Los resultados se presentan como media±error estándar de la media (SEM). La prueba t de Student (2 colas) fue utilizada para el análisis estadístico. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado para indicar diferencias estadísticamente significantes. Los análisis estadísticos se hicieron con programa comercial (GraphPad Prism, versión 9 para MacOS, GraphPad Software, La Jolla California, EE. UU.).

La DD1 es una enfermedad ultrarrara con un bajo número de pacientes diagnosticados. Por ello, para conseguir un número suficiente de pacientes para este estudio, se hizo una convocatoria nacional a través de la Sociedad Española de Nefrología (SEN) y la Sociedad Española de Nefrología Pediátrica (AENP). Un total de 25 pacientes con mutaciones confirmadas en el gen CLCN5 procedentes de 14 hospitales de España participaron en este estudio, de los que se recogieron muestras y datos clínicos (fig. 1A). También se incluyó a 10 controles sanos emparejados por edad y raza (todos los individuos estudiados eran varones). Los datos demográficos y clínicos de los pacientes confirmaron que no había diferencias significativas en la edad entre los 2grupos (p=0,67), pero mostraron que el 44% de ellos (p=0,012) presentaban una función renal reducida (TFGe <90ml/min/1,73 m2) y el 52%, nefrocalcinosis (p=0,0052) (tabla 1). No había diferencias significativas en el resto de los parámetros estudiados entre pacientes y controles.

Caracterización de los vesículas extracelulares urinarias

Las orinas de los pacientes y controles se procesaron para obtener los uEV como nuestro grupo ya ha descrito (fig. 1B)14. Los uEV enriquecidos en exosomas obtenidos de pacientes y controles se caracterizaron morfológicamente utilizando la técnica de cryo-TEM, que permite una visualización directa de las vesículas sin la adición de metales pesados ni fijadores, que podrían causar artefactos. Nuestros resultados revelaron vesículas de una, 2o varias capas, así como uEV de diferentes tamaños sin impurezas evidentes (fig. 2A).

Figura 2.

Caracterización morfológica de los uEV de pacientes y controles. A) Micrografías de una muestra representativa con diferentes escalas (500nm, 200nm y 100nm de izquierda a derecha) que muestran vesículas simples (flecha blanca), dobles (flecha negra continua) o multicapa (flecha negra discontinua). B) Cuantificación de la concentración de uEV por ml de orina en controles (círculos negros) o pacientes (círculos grises). Cada punto representa un sujeto. En la gráfica también se muestra la media±SEM. C) Cuantificación del diámetro de los uEV de controles (círculos negros) y pacientes (círculos grises). Cada punto representa la media del diámetro de los uEV para un único sujeto. La gráfica también muestra la media±SEM.

CD81: grupo de diferenciación 81; GRP78: proteína reguladora de glucosa 78; HepG2: línea celular de carcinoma hepatocelular G2; uEV: vesículas similares a exosomas urinarios; SN: sobrenadante.

** p<0,01.

***p<0,001.

(0.38MB).

La distribución de tamaño y la concentración relativa de uEV se evaluaron mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) en muestras seleccionadas al azar (n=12 pacientes, n=5 controles)15,16. Fue muy interesante observar que la concentración relativa de uEV/ml era significativamente menor en pacientes que en controles (0,26±0,04×1016 vs. 1,19±0,27×1016 uEV/ml; p=0,0004) (fig. 2B). Como se ve en la figura 2C, la mayoría de las vesículas detectadas tenían menos de 200nm de diámetro, como se espera para los exosomas. Cabe señalar como curiosidad que los exosomas de los pacientes eran significativamente más grandes que los de los sujetos control (diámetro medio 187,8±4,053 vs. 143,6±2,994nm, respectivamente; p<0,0001) (fig. 2C).

Por último, se evaluó la expresión de 2marcadores asociados con exosomas (ALIX y CD81)17 mediante la técnica de western blot para confirmar la presencia de exosomas urinarios (fig. 3A). Ambos marcadores se detectaron en todas las muestras de exosomas (tanto en pacientes como en controles) y estuvieron ausentes en el sobrenadante de esas mismas muestras, que se utilizaron como control negativo para confirmar la ausencia de contaminación por restos celulares. Además, utilizamos un marcador de retículo endoplásmico (GRP78) para demostrar la ausencia de estructuras intracelulares en las suspensiones de exosomas.

Figura 3.

ARN y proteína obtenidos de los uEV. A) Los niveles de Alix y CD81 (marcadores de exosomas) fueron analizados por western blot en muestras de pacientes y controles. El lisado de la línea celular HepG2 se utilizó como control positivo para la detección de Grp78, un marcador de retículo. B) Concentración de ARN (ng/μl) en muestras de controles (círculos negros) y pacientes (círculos grises). Cada punto representa un único sujeto. La gráfica también muestra la media±SEM. C) Electroferograma representativo que muestra una buena integridad del ARN obtenido de los uEV. En la gráfica se marcan los picos correspondientes al ARN ribosomal 18S o 28S.

FU: unidades arbitrarias de fluorescencia; nt: nucleótidos.

(0.15MB).

Las muestras de orina procedentes de pacientes de toda la geografía española fueron congeladas, tras una primera centrifugación, hasta su procesamiento. Aunque algunos autores han señalado que la congelación directa a –80°C podría conservar mejor los exosomas21, otros han demostrado que los exosomas y sus cargos son estables en la orina en diferentes condiciones de almacenamiento, al obtener resultados comparables con muestras recién procesadas o después de ciclos repetidos de congelación-descongelación22. Para el aislamiento de uEV, se prefirió el método de centrifugación diferencial a otras técnicas23. No se han publicado datos previos sobre uEV en pacientes con DD1 y, por lo tanto, se desconocía la eficiencia del aislamiento de exosomas por muestra de orina en estos pacientes poliúricos, que, además, tienen la endocitosis y la vía endolisosomal afectadas (las cuales están involucradas en la formación de exosomas).

Esta técnica ha sido muy utilizada en nuestro laboratorio y ya ha demostrado su eficacia en el aislamiento de exosomas para estudiar otra tubulopatía rara renal que cursa con poliuria14.

La cuantificación de los uEV mediante la técnica de NTA mostró una concentración sustancial de ellos, aunque muy variable entre muestras individuales. Esta variación fue independiente del filtrado glomerular o del grado de proteinuria, pero otros factores podrían desempeñar un papel, como la cantidad de proteína Tamm Horsfall. Es interesante constatar que se observó que los pacientes tenían casi 5veces menos concentración de uEV/ml de orina que los controles. Este hecho puede estar relacionado con la poliuria con la que cursan los sujetos afectos por DD1.

No obstante, también se observaron diferencias significativas en el tamaño de los exosomas de los pacientes en comparación con los de los controles, como ya ha sido comentado. Una posible hipótesis sería que algunos defectos en la vía endolisosomal, resultado de la disfunción de ClC-5, produjeran, por algún mecanismo aún desconocido, la liberación de vesículas de mayor tamaño en pacientes con DD1 que en controles. De hecho, este cambio en el tamaño también podría explicar la reducción en el número de partículas entre pacientes y controles: se libera menos cantidad de exosomas, pero estos son más grandes.

La disfunción tubular que se produce en la enfermedad de Dent podría tener impacto en la producción y liberación de exosomas, ya que su biogénesis comienza en el sistema endosomal, donde los endosomas tempranos maduran a endosomas tardíos o a cuerpos multivesiculares24. El antiportador electrogénico (2Cl-/H+) ClC-5 se localiza en los endosomas tempranos y tiene un papel muy relevante en el tráfico de vesículas y el transporte intracelular4,5, que se altera cuando se producen mutaciones en el gen CLCN5, como ocurre en la enfermedad de Dent. Asimismo, se ha señalado que el destino de los cuerpos multivesiculares, ya sea su degradación o la secreción de exosomas, depende de la homeostasis celular, probablemente alterada en pacientes con enfermedad de Dent. Los cuerpos multivesiculares pueden dirigirse a los lisosomas, donde su contenido es degradado, o transportados a la membrana plasmática para la liberación de exosomas25. Poco se sabe sobre los mecanismos moleculares y celulares que regulan este equilibrio y el rol de ClC-5 en estos procesos está por determinar.

En otras enfermedades, como las demencias neurodegenerativas, se ha visto también una reducción en la concentración de vesículas extracelulares en el plasma, con un incremento de su tamaño26. Sin embargo, aún no se ha reportado en la literatura ningún mecanismo que explique este cambio. Por otro lado, Paulaitis et al. han caracterizado las distribuciones de tamaño de exosomas basándose en la escala dinámica del crecimiento de cuerpos multivesiculares en la vía de biogénesis de exosomas27. Estos autores encuentran diferencias estadísticamente significativas en los exponentes de escala que caracterizan las distribuciones de tamaño de exosomas en muestras de suero de pacientes con cáncer comparados con los de donantes sanos. Estos autores consideran que tales cambios podrían reflejar alteraciones en la composición de la membrana de los exosomas y proponen que se podría considerar el exponente de escala como un biomarcador biofísico comparable a los biomarcadores bioquímicos de exosomas y complementario a ellos, en particular, las proteínas de membrana específicas, como las tetraspaninas.