NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 4. 1994 ORIGINALES Respuesta contráctil glomerular en un modelo de nefropatía diabética experimental E. Saiz*, A. Benito*, M. González Rubio***, M. P. Ruiz Torres***, J. Lucio***, R. Martos*** y D. Rodríguez PuyoI** *Servicio de Medicina Interna y **Sección de Nefrología, Hospital Universitario Principe de Asturias. "`Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Alcalá de Henares. Alcalá de Henares. Madrid. RESUMEN La nefropatía diabética, en sus estadios iniciales, se caracteriza por un síndrome de hiperfiltración y proteinuria. Los mecanismos subyacentes a esta hiperfiltración no se conocen con precisión en el momento actual, pero es posible que sea debida, al menos parcialmente, a una respuesta disminuida de las estructuras glomerulares a determinados estímulos vasoconstrictores. Por otra parte, se ha sugerido que el captopril podría disminuir la proteinuria relacionada con la diabetes, m e j o r a n d o la hiperfiltración. En los presentes experimentos se evaluó la respuesfa contráctil de los glomérulos aislados procedentes de ratas controles, diabéticas y diabéticas tratadas con captopril, en presencia de diferentes agonistas vasoconst r i c t o r e s (angiotensina II, factor activador de las plaquetas y factor de crecimiento epidérmico), así como con un estimulador directo de la proteína kinasa C (acetato miristato de forbol). En todos los casos se observó una respuesta contráctil disminuida de los glomérulos de rata diabética con respecfo a los controles. En los animales tratados con captopril se observó una tendencia a la reversión de esta hipor e s p u e s t a , si bien las diferencias no alcanzaron significación estadistica. En resumen, el análisis de nuestros resultados indica que existe una respuesta confrácti/ defectuosa de los glomérulos de rata diabética a diferentes vasoconstrictores, que parece depender de una alteración en los mecanismos intracelulares de contracción, y que podría relacionarse con la hiperfiltración caracteristica de los estadios iniciales de la diabetes. El efecto beneficioso del captopril en estas circunstancias podría radicar en una mejoría parcial de este defecto, aspecto que habrá que evaluar cuidadosamente en estudios adicionales. Palabras clave: Diabetes, hiperfiltración, proteinuria, glomérulos, vasoconstricción. Correspondencia: Dr. Diego Rodríguez Puyol. Jefe de Sección de Nefrología. Hospital Universitario Príncipe de Asturias. Ctra. Alcalá-Meco, s/n. Alcalá de Henares. 28806 Madrid. Recibido: 13-VII-93. En versión definitiva: 14-III-94. Aceptado: 17-111-94. 465 E. SAIZ y cols. CONTRACTIL GLOMERULAR RESPONSE IN EXPERIMENTAL DIABETIC NEPHROPATHY SUMMARY Diabetic nephropaty, in the initial stages, is characterized by hyperfiltration and proteinuria. The mechanism underlying this hyperfiltration is not fully understood, but it is possible that it could be due, at least partially, to a decreased response of glomerular structures to some vasoconstrictor mediators. It has been suggested that captopril can decrease the diabetes-related proteinuria by lowering the hyperfiltration. In our experiments, we tried to assess the contractile response of glomeruli from control rats, diabetic rats and diabetic rats receiving captopril, in the presente of some vasoconstrictor agonists (Angiotensin II, Platelet Activating Factor, Epidermal Cell Growth Factor and Phorbol Myristate Acetate). In all cases we observed a smaller contractile response in diabetic glomeruli than in controls. Likewise, we saw a trend of captopril treatment to normalize this smaller response, but differences did not reach statistical significance in all cases. In summary, our results show that the smaller contractile response of diabetic glomeruli, seems to be due to an alteration in the intracellular mechanisms of contraction. At least partially, the beneficial effect of captopril under these circumstances, could lie in a partial improvement of this defect. Key words: Diabetes, hyperfiltration, proteinuria, glomeruli, vasoconstriction. Introducción La nefropatía diabética es una patología que se caracteriza por un cuadro clínico bien definido: comienza por una fase inicial de hiperfiltración de duración incierta, seguida de una fase prolongada de microalbuminuria y proteinuria persistente subclínica hasta llegar a una etapa final de síndrome nefrótico y progresión a insuficiencia renal terminal 1. Si bien no está demostrado de forma contundente, la hiperfiltración podría ser una de las alteraciones precoces de los pacientes diabéticos, que a la larga podría condicionar la aparición de daños funcionales y estructurales severos 2 . Los mecanismos de hiperfiltración en la diabetes no se conocen adecuadamente. Se piensa que la hiperglucemia, en sí misma, puede ser un factor fundamental, ya que la hiperfiltración mejora con un control glucémico estricto 3. No obstante, no parece ser la única responsable de la filtración excesiva, habiéndose propuesto también un papel significativo para las hormonas contrainsulares, algunas de las cuales aumentan directamente el filtrado glomerular 4. Por otra parte, existen una serie de evidencias experimentales, en absoluto definitivas, que apuntan la posibilidad de que la hiperfiltración se deba a un exceso de metabolitos vasodilatadores o a un defecto de 466 v a s o c o n s t r i c t o r e s en el entorno periglomerular 5,6, produciendo así una filtración incrementada. No se conocen terapéuticas eficaces para modificar la hiperfiltración, salvo el estricto control glucémic o 3. No obstante, la utilización de inhibidores del enzima de conversión de la angiotensina (IECA), en particular el captopril, ha demostrado su utilidad para reducir la proteinuria de algunos pacientes diabético s 7 y para prevenir el desarrollo de la glomerulop a t í a diabética en animales de experimentación 8. Esto hace pensar que, entre otros posibles mecanismos, la inhibición del enzima de conversión de la angiotensina, a través de una disminución de la presión hidrostática intraglomerular 8, podría mejorar la p r o t e i n u r i a y, a largo plazo, enlentecer el curso de progresión de la nefropatía diabética. El presente trabajo se diseñó para evaluar la hipótesis de que la hiperfiltración, uno de los mecanismos patogénicos más importantes de la nefropatía diabética, podría ser debida, al menos parcialmente, a una cierta insensibilidad de los elementos contráctiles intraglomerulares a los efectos de las posibles sustancias vasoconstrictoras normalmente existentes en el medio que los baña. Por otra parte, el papel de los inhibidores del enzima conversor de angiotensina (IECA) en la mejoría de la hiperfiltración podría residir en la reversión de este posible defecto. CONTRACTILIDAD GLOMERULAR Y DIABETES Material y metodos Animales de experimentación y recogida de muestras Se utilizaron ratas Wistar macho de 200-300 g de peso. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar de luz, temperatura y dieta, con libre acceso al agua. Además del sodio contenido en la dieta, recibieron diariamente 2 mmol/día de CINa en el agua de bebida. La diabetes se indujo mediante la inyección intraperitoneal (65 mg/kg de peso) de estreptorotocina (Sigma, St. Louis, MO, USA) 9 . A los siete días de la inyección se determinó la glucemia de todos los animales tratados en una muestra de sangre de la cola, según procedimientos reflectométricos habituales (Glucometer ll, Miles Inc., Elkhart, IN, USA), desechándose aquellos animales con glucemias inferiores a 300 mg/dl. Como controles se utilizaron ratas de las mismas características, tratadas con el vehículo de la estreptozotocina (ácido cítrico, 0,1 M; CLNa, 0,145 M; pH, 4,5). Inmediatamente después de la determinación de la glucemia en sangre periférica, parte de los animales diabéticos comenzaron a ser tratados con captopril (15 mg/kg/día) en el agua de bebida, tratamiento que continuó durante todo el período experimental. A las cuatro semanas despues de la inyección intraperitoneal se procedió a pesar y sacrificar a los animales, tras haber recogido la orina de las 24 últimas horas y obteniendo muestras de sangre (punción aórtica) para las determinaciones bioquímicas. El número final de animales incluidos en cada grupo fue el siguiente: 25 animales controles (C), 25 animales diabéticos sin tratamiento (D) y 25 animales diabéticos tratados con captopril (DC). Aislamiento de glomérulos El método empleado ha sido el de Misra con ligeras modificaciones 11. Tras la anestesia y exanguinación de los animales, se extrajeron los riñones y se decapsularon, se separó la corteza de la médula mediante disección macroscópica, sometiéndose la primera a un tamizado diferencial (105 y 75 Pm de diámetro de poro). Tanto la recogida como el lavado de los riñones, así como el aislamiento de los glomérulos, se realizó en frío con Tampón Tris-CIH conteniendo glucosa (TG) (Tris 20 mM, CINa 130 mM, CLK 5 mM, acetato sódico 10 mM, glucosa 5 mM, pH 7,4). Experimentos de microfotografía En cada experimento, los glomérulos fueron resuspendidos en 1 ml de TG con cloruro cálcico (2,5 10 mM), manteniéndose a temperatura ambiente durante 15 minutos. Pasado este tiempo, se tomó una alícuota de 100 bl de la suspensión, que se depositó en un porta excavado, realizándose la primera microfotografía (tiempo 0). En ese instante se añadía el agonista vasoconstrictor al resto de los glomérulos en suspensión mantenidos a temperatura ambiente. Al cabo de 30 minutos se tomó una segunda alícuota de 100 pl y se realizó una nueva microfotografía (tiempo 30). Como agonistas vasoconstrictores se utilizaron angiotensina II (All 100 nM), factor activador de las plaquetas (PAF 1 ,uM), factor de crecimiento epidérmico (EGF 5 nM) y acetato miristato de forbol (PMA 300 nM). Todos los productos fueron adquiridos a Sigma (St. Louis Mo., USA). En todos los casos se introdujeron como control glomérulos incubados con el tampón de trabajo (TG) y con las diferentes sustancias utilizadas como vehículo de los agonistas (agua bidestilada o etanol a una concentración final de 0,01 %). Tras revelar las fotografías se procedió a efectuar una medida computarizada de las áreas de sección glomerular (ASG), eligiendo campos conteniendo entre 25 y 40 glomérulos 11,12 Métodos estadísticos Todos los resultados se expresan como media f error estándar de la media (X + e.e.m.). Cuando se compararon dos medias de los mismos elementos experimentales en dos momentos diferentes, se utilizó la t de Student para datos pareados. Cuando se compararon varias distribuciones de valores, se utilizó un análisis de varianza, seguido de una prueba de comparación múltiple de medias (Scheffé). Se consideró como estadísticamente significativa una p < 0,05. Resultados En la tabla I se muestran los principales parámetros bioquímicos evaluados en sangre y orina en los tres grupos de estudio. No se objetivaron diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los valores sanguíneos entre los distintos grupos experimentales, a excepción de la glucosa, que experimentó un considerable aumento en el grupo de animales diabéticos, cuantitativamente similar en los tratados y no tratados con captopril. Con respecto a los parámetros urinarios, se observó un incremento estadísticamente significativo en la glucosuria, proteinuria y aclaramiento de creatinina, sin modificaciones en la natriuresis, de los animales diabéticos con respecto a los controles. El tratamiento de los animales diabéticos con captopril indujo una discreta reducción del filtrado glomerular, que no alcanzó diferencias estadísti467 E. SAIZ y cols. Tabla I. Parámetros séricos y urinarios en los distintos grupos experimentales C Glucosa P. ímc?/dl) Creatinina P .