NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 4. 1994 Anomalías de la bomba de calcio en la hipertensión arterial Introducción El aumento de las resistencias periféricas vasculares que caracteriza a la fase establecida de la hipertensión arterial esencial depende, fundamentalmente, del tono contráctil de la fibra muscular lisa de la pared vascular. Los avances en el conocimiento de la fisiología celular han puesto de manifiesto el papel central del calcio en la regulación de dicho tono contráctil 1. La contracción de las células del músculo liso se inicia por la apertura de canales de calcio dependientes de diferencias de potencial eléctrico o de receptores para agonistas específicos, situados en la membrana celular y en el retículo sarcoplásmico, lo que resulta en un incremento de la concentración de Ca2+ libre citosólico. Dicho aumento es capaz de actuar sobre las proteínas contráctiles del músculo liso (actina y miosina), que cambian su conformación espacial interaccionando entre sí para dar lugar a la contracción celular. La relajación de la célula muscular es consecuencia directa de la disminución de la concentración de Ca2+ libre citosólico, lo que tiene lugar a través de la activación de unos sistemas de transporte activo de calcio capaces de extruir dicho catión al espacio extracelular y a la luz del retículo sarcoplásmico contra su gradiente electroquímico. Se conoce hasta el momento la existencia de dos mecanismos capaces de extraer Ca2+ al exterior de la célula. Por una parte, existe un sistema de intercambio Na+-Ca2+ especialmente desarrollado en las células excitables, como las de la musculatura miocárdica, que utiliza la entrada de tres moléculas de Na+ desde el exterior, a favor de gradiente, para extraer una molécula de Ca2+. Por otra, una ATPasa Ca2+-dependiente, que utiliza la energía producida por la hidrólisis del ATP para la extrusión de calcio en contra de su gradiente electroquímico. Dicho sistema de transporte es asimismo el responsable del secuestro de calcio en la luz del retículo sarcoplásmico que da lugar a la relajación de la célula contráctil. Desde las primeras observaciones de Postnov y cols. 2 , 3 que demostraron un defecto en la captación de calcio por las membranas celulares de animales de experimentación y pacientes afectos de hipertensión arterial primaria, la evidencia acumulada sugiere la existencia, en dichas situaciones, de algún trastorno en el funcionamiento de la ATPasa Ca2+-dependiente. Si bien la naturaleza intrínseca de esta anomalía no es suficientemente conocida, sí parece plausible que pudiera ser la responsable, al menos en parte, del aumento del calcio libre citosólico que presentan los pacientes afectos de HTA esencial 4,5. El objeto de este capítulo es la revisión del mecanismo de funcionamiento de la ATPasa Ca2+-dependiente de la membrana celular y las alteraciones que hasta el momento han sido descritas en la hipertensión arterial. La ATPasa Ca2+-dependiente. La bomba de calcio. Aspectos básicos Estructura y función de la bomba de calcio La ATPasa Ca2+-dependiente es uno de los siete u ocho mecanismos de transporte existentes en las membranas celulares que movilizan el calcio entre el interior y el exterior de la célula. Junto con el contratransporte Na+-Ca2+ es el principal mecanismo para la extrusión de calcio del citoplasma celular y está presente en la práctica totalidad de las membranas celulares. En general, la ATPasa predomina en las celulas no excitables y el contratransporte en las excitables. Ello es debido a que estas últimas requieren un sistema de alta capacidad de transporte, aunque sea en detrimento de la afinidad para el calcio, condiciones que se hallan presentes en el intercambiador Na+Ca2+. Por el contrario, la ATPasa Ca2+-dependiente 454 TRANSPORTE DE CALCIO Y HTA presenta una alta afinidad para el Ca2+ y una menor capacidad de transporte y es, por tanto, la responsable del mantenimiento constante del bajo contenido de calcio existente en el interior celular. La demostración en 1966 de que los eritrocitos eran capaces de destruir Ca 2 + gracias a una ATPasa específica7 originó un vasto número de trabajos, realizados principalmente en este modelo celular, encaminados a conseguir la caracterización de esta enzima. Se trata de una clásica E1-E2-ATPasa con una alta afinidad para el Ca2+ ( < 1 PM), que se inhibe específicamente por bajas concentraciones de vanadato (K1/2 < 1 PM). Gracias a esta alta afinidad está cualificada + para extraer Ca 2+ continuamente de la célula, por lo que juega el papel más importante en el mantenimiento del gradiente de Ca2+ entre las células y el medio extracelular. La ATPasa Ca2+-dependiente es un polipéptido con un peso molecular de 1 3 8 . 0 0 0 daltons en su forma monomérica, aunque funciona en la membrana celular como un dímero 8-10. Su representación en el total de proteínas membranarias es baja, con sólo un 0,10,2% del total de las mismas, que a su vez constituyen únicamente alrededor del 0,5% del peso celular. En presencia de la enzima reguladora calmodulina, las propiedades de la ATPasa eritrocitaria, aquella que ha podido ser mejor estudiada, son relativamente bien conocidas. La bomba transporta, aparentemente, el equivalente al influjo pasivo de Ca2+, que se cifra en unos 50 pmol/l céI/h a una conc e n t r a c i ó n interna de Ca2+ inferior a los 30 nmol/l céls 11 Si tenemos en cuenta que la concentración extracelular de Ca2+ se halla alrededor de 1,3 mmol/l, p u e d e establecerse un gradiente en contra de 40.000. De este modo puede afirmarse que únicam e n t e una pequeña parte de la capacidad de la bomba se utiliza habitualmente. Si la concentración de calcio intracelular se satura (10 pmol/l céls), la velocidad de transporte puede alcanzar los 20 mmol/l céls/h, lo que corresponde a varios miles de unidades por minuto. La afinidad para el calcio es alta en el interior (inferior a 1 PM) y baja en el exterior de la membrana (10 mM)12 El sistema hidroliza ATP a la misma velocidad a la que se transporta el calcio (1 átomo de calcio transportado por molécula de ATP hidrolizado)13 Existen dos sitios o locus de fijación del ATP. El locus enzimático propiamente dicho presenta una afinidad de 2-3 PM, operando aisladamente a una décima parte de su capacidad. Además, existe otro locus regulador para el ATP con una afinidad entre 200 y 300 PM, que cuando está ocupado permite el funcionamiento a velocidad máxima 1 4 . Es importante destacar que el sistema requiere la presencia del ion Mg 2 + para su operatividad. La afini- dad para el Mg2+ en el interior de la membrana es de 15 pM15, lo que no implica que el sistema transporte este catión. De hecho, la especificidad de la bomba para el calcio es altamente selectiva, permitiendo únicamente el Sr2+ y, posiblemente, el Pb 2 + como alternativa al transporte de Ca 2 + 16. Está claramente establecido que la bomba de calcio no contratransporta ningún otro catión al interior celular, aunque inicialmente se había postulado su intercambio por Na+, K+ o Mg2+, ni es intercambiado por un ningún anión17 . No obstante, evidencias experimentales recientes sugieren la posibilidad de un intercambio por protones, es decir, que el sitio móvil de fijación del Ca2+ volvería al interior celular unido a un H+ 18. Ello viene apoyado por el hecho de que cuando se bloquea el transportador de aniones con DIDS, aquellos aniones que pasan la membrana en forma no disociada, como el acetato, estimulan el transporte de calcio, mientras que los que la atraviesan en forma ionizada, como el tiocianato, no presentan esta propiedad. El ciclo de reacción de la bomba de calcio (fig. 1) es similar al de otras ATPasas como la bomba de sodio. Básicamente, la hidrólisis del ATP fosforila la proteína en presencia de calcio. La proteína fosforilada cambia su conformación de E1-P a E2-P, cambio que se ve favorecido por la presencia de Mg 2+ 19 Durante este cambio de conformación el Ca 2 + es extruido al exterior para posteriormente desfosforilarse la proteína y volver a su conformación inicial. La interación de la bomba de calcio con la calmodulina Una importante característica de la ATPasa Ca2+dependiente es su capacidad de estimulación por la acción de la c a I m o d u I i n a 2 0 , 21, proteína soluble intracelular con cuatro locus de fijación para el Ca2+ que se halla presente en el interior de todas las células y es la encargada de mediar en varias de las acciones en las que el Ca 2 + actúa como segundo mensajero. La c a l m o d u l i n a estimula la bomba de calcio cuando varios de sus locus de fijación para este catión son o c u p a d o s . Esta reacción provoca una interacción calmodulina-bomba de calcio que resulta en un incremento de hasta 30 veces de la afinidad de esta última para el Ca2+ 22 Para algunos autores23, la ATPasa . Ca2+-dependiente tendría dos configuraciones: una forma asociada a la calmodulina y otra disociada de ésta. La forma disociada representaría un estado de baja afinidad donde la actividad máxima se consigue por una concentración de calcio libre comprendida entre 100 y 300 PM, presentando un solo locus de fijación para el calcio. Por el contrario, en su forma 455 A. DE LA SIERRA Ca ATP+El ä E1-P+ADP Mg II Mg-ATP E2 PO4 ;o E1 Y E2 representan las dos conformaciones de Ia proteína y E1-P y E2-P las formas fosforiladas. El Ca2+ atraviesa la membrana celular durante la reacción II. Dicha reacción requiere la presencia de Mg2+, mientras que la III necesita altas concentraciones de ATP. Va E2P F i g 1 . - Ciclo de reacción de la ATPasa Ca2+-dependiente. El ciclo comienza en el extremo superior izquierdo y sigue el sentido horario. asociada a la calmodulina la bomba de calcio se convierte en una enzima de alta afinidad que alcanza su máxima actividad para una concentración de calcio libre citosólico de 10 a 50 PM y donde el número de locus de fijación para el calcio es de tres. El papel fisiológico de la regulación de la bomba de c a l c i o por la calmodulina no está suficientemente aclarado. Para algunos autores, la ATPasa Ca2+ dependiente en su estado basal estaría disociada de la calmodulina y sería el aumento del calcio intracelular el que provocaría, a través de la ocupación de los loci especifícos de la calmodulina, la asociación a la ATPasa Ca2+-dependiente y el consiguiente aumento de su afinidad para el Ca2+ y de su velocidad máxima. Ello obtendría el resultado deseado, es decir, el restablecimiento de la concentración basal de calcio y, alcanzado dicho objetivo, la calmodulina se disociaría de nuevo de la bomba. Este fenómeno tiene implicaciones reguladoras, pues la calmodulina actuaría como un activador capaz de modificar la conformación de la enzima desde un estado de baja afinidad para el Ca2+ y baja velocidad de bombeo a un estado de características diametralmente opuestas. No obstante, otros autores ponen en duda esta hipótesis 24 y sugieren que en su estado basal el 98% de las unidades de la bomba de calcio estarían unidas a la calmodulina, con lo que el papel regulador de esta proteína intracelular sería prácticamente nulo. 456 Regulación de la bomba de calcio Dejando aparte la regulación de la bomba de calcio por la calmodulina, que actúa como un mecanismo de feed-back negativo ante los aumentos del calcio libre citosólico, las características funcionales de la ATPasa de la membrana plasmática dependen en gran medida del ambiente lipídico en el que se halla inmersa25. Los fosfolípidos, ya sean neutros o con carga negativa, son esenciales para su funcionamiento enzimático en condiciones basales26 Si se reconstruye la ATPasa con un fosfolípido neutro como la fosfatidilcolina, la adición de otros fosfolípidos con carga negativa como la fosfatidilserina, el fosfatidilinositolmonofosfato o el fosfatidilinositolbifosfato son capaces de estimular de forma adicional la actividad de la ATPasa 27. Si bien no está probado que esta regulación tenga algún papel fisiológico, sí parece factible que el fosfatidilinositolmonofosfato sea un regulador del transporte de Ca 2 + por la bomba de la membrana celular. Se ha descrito que el GMP cíclico ejerce un efecto estimulador sobre el transporte transmembranario de calcio y que dicho efecto se produce mediante una fosforilación directa de la enzima 28. N o o b s t a n t e , otros autores 29 han demostrado que dicha enzima fosforilada no tiene las características de la bomba de calcio y que, probablemente, se trata de la kinasa de la cadena ligera de la miosina. Esta kinasa depen- TRANSPORTE DE CALCIO Y HTA diente del GMPc sí es capaz de estimular el transporte de calcio por la bomba, probablemente a través de l a formación de fosfatidilinositolmonofosfato. De igual manera, aquellos agentes capaces de estimular la síntesis de GMPc, tales como el factor relajante dependiente del endotelio, el factor natriurético auricular o los compuestos de óxido nitroso, pueden descender el calcio libre citosólico a través de una estimulación indirecta de la actividad de la bomba de c a l c i o 29. Dependiendo del modelo celular existen diversas sustancias que pueden modular la actividad de esta enzima. La insulina es capaz de inhibir el transporte de calcio por la ATPasa30 en la membrana de los adipocitos, mientras que en las células intestinales la 1,25-hidroxivitamina D3 es capaz de activarlo31 En las células del miometrio, la oxitocina tiene funciones inhibitorias 32 mientras que en los eritrocitos las I hormonas tiroideas son estimuladoras33. Asimismo, se ha postulado recientemente que el efecto tóxico del cadmio sería debido a una inhibición de la bomba de calcio de la membrana celular 34 las proteínas G y del fosfatidilinositol, como el factor natriurético auricular, el factor relajante dependiente del endotelio o incluso los betabloqueantes, pueden ejercer su efecto de relajación por esta vía29. Anomal ías de la b o m b a de calcio en la hipertensión arterial Alteraciones de la fijación de calcio por las membranas celulares En 1979, Postnov y cols.8 demostraron una dismin u c i ó n de la fijación del calcio por parte de las m e m b r a n a s eritrocitarias de pacientes afectos de HTA esencial y ratas hipertensas espontáneas. Trabajos posteriores en vesículas constituidas por fragmentos de membrana pusieron de manifiesto que este defecto afectaba únicamente a la superficie interna de la membrana citopIasmática 40,41, conclusión confirmada en otros experimentos en los que se utilizaron ionóforos de Ca2+ 42 Este defecto en la fijación del Ca2+ no parece estar limitado a las membranas eritrocitarias. Estudios realizados en ratas hipertensas espontáneas han demostrado las mismas alteraciones en células del músculo l i s o vascuIar 4 0 , 4 3 , 4 4 , miocardio 4 0 , 4 5 , hepatocitos46, adip o c i t o s 4 7 y sinaptosomas46. Dichas alteraciones pueden ser debidas a una disminución del número de lugares de fijación para el calcio o a un descenso de la afinidad para este catión46 . Entre los posibles grupos membranarios de fijación para el calcio cabe considerar a aminoácidos tales como los ácidos glutámico y aspártico, los grupos c a r b o x í l i c o s y los fosfolípidos con carga negativa como el fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidilet a n o l a m i n a 4 8 , 49. De hecho, el 20% del calcio membranario se halla unido a dichos fosfolípidos. No obstante, por lo que respecta a la composición lipídica de las membranas eritrocitarias, no parecen existir diferencias entre individuos o animales normotensos y pacientes hipertensos esenciales o ratas hipertensas espontáneas, aunque resulta difícil extrapolar estos datos a otros modelos celulares50 Aparte de los grupos membranarios de fijación para el calcio, el citoplasma celular contiene varias sustancias capaces de unirse a dicho catión. No obstant e , la mayoría de ellas se caracteriza por poseer valores de constante de disociación para el calcio del orden de 2 ó 3 magnitudes superiores a los posibles cambios de la concentración de calcio en condiciones fisiológicas. En este contexto, únicamente las proteínas de fijación altamente selectivas, tales como la troponina, parvalbúmina o la calmodulina pueden tener un cierto papel regulador50 . 457 La bomba de calcio del retículo sarcoplásmico En el retículo sarcoplásmico, la enzima responsable de introducir el Ca2+ libre citosólico en su interior es una ATPasa del mismo tipo que la de la membrana plasmática, que interacciona con el Ca2+ con una alta afinidad ( < 0,5 ,I_IM) y con una estoiquiometría para el ATP de 2:1. Puesto que esta ATPasa es muy abundante en la membrana del retículo sarcoplásmic o , superior al 90% d el total de las proteínas de membrana en algunos músculos esqueléticos, la organela puede captar rápidamente grandes cantidades del Ca2+ citosólico (de 20 a 40 nmol por miligramo de proteína de membrana y por segundo). La ATPasa Ca2+-dependiente del retículo sarcoplásmico ha sido purificada y se trata de un polipéptido con un peso molecular de 115.000 daltons35. Es capaz de estimularse también por la calmodulina, pero a diferencia de la ATPasa de la membrana celular, en que la estimulación es debida a la interacción directa del activador con la bomba, en el retículo sarcoplásmico esta activación está mediada por una kinasa calmodulina-dependiente. La regulación de la ATPasa Ca2+dependiente del retículo sarcoplásmico se lleva a cabo por el fosfolomban, proteína presente tanto en el músculo cardíaco como en el músculo liso o esquelético36-38. El fosfolomban ejerce su acción a través de la fosforilación mediada por diversas kinasas, ya sean d e p e n d i e n t e s de AMPc, de la calmodulina o d e l GMPc 38, 39 . De este modo, y al igual que sucedía con la bomba de calcio de la membrana citoplásmica, aquellas sustancias capaces de estimular el ciclo de A. DE LA SIERRA n - e' .. p.."" . ..o _*__~____.............................--.----- El Fig. 2.-Acumulación de Ca2+ por preparados de vesículas "insideou t" de membranas eritrocitarias en función de la concentración d e Ca2+ en el medio de incubación. Las Iíneas continuas rep r e s e n t a n el estado basal y las de puntos el transporte tras la adición de calmodulina (2 pdml). Los círculos y cuadrados vacíos s e refieren a las ratas normotensas (Wistar-Kyoto), y los llenos a l a s ratas hipertensas espontáneas. (Tomado de Orlov y cols. P f l u g e r s Arch 397:54-56, 1983). Los estudios realizados hasta el momento no han puesto de manifiesto diferencias en la concentración citoplasmática, propiedades o distribución de la calmodulina entre hipertensos y normotensos51, aunque, como se discutirá posteriormente, parece existir un defecto en la estimulación por parte de la calmodulina del transporte de calcio mediado por la ATPasa Ca2+-dependiente52-54 El fallo en la demostración de que las propiedades físico-químicas de la membrana celular sean responsables del defecto de fijación del calcio obliga a asumir que la alteración debe residir en el transporte activo de dicho catión. Si tenemos en cuenta que el principal responsable del mantenimiento de la baja concentración de calcio libre citosólico lo constituye la bomba de calcio de la membrana celular y del retículo sarcoplásmico, parece lógico pensar que un defecto en dicho sistema de transporte pueda jugar un papel relevante en la hipertensión arterial primaria. Alteraciones de la bomba de calcio en la hipertensión arterial experimental Los primeros trabajos que estudiaron el transporte activo de Ca2+ fueron publicados en 1983 por el grupo de Postnov53 y se efectuaron sobre preparados de membranas eritrocitarias formando vesículas, en las 458 que la superficie interna de la membrana se hallaba expuesta al medio extracelular, las llamadas «insideout vesicles». En estos experimentos, los autores demostraron una disminución del transporte activo de Ca2+ estimulado por la calmodulina en las ratas hipertensas espontáneas53 . Si bien la velocidad de acumulación de calcio en condiciones basales no presentaba diferencias significativas entre las especies de ratas hipertensas y normotensas, la adición de calmoldulina al medio extracelular provocaba una estimulación máxima del transporte activo de Ca2+ significativamente mayor en las ratas normotensas que en sus homónimas hipertensas (fig. 2). Los autores sugerían que el incremento en el contenido intracelular de calcio observado en la HTA podía ser consecuencia de este déficit de estimulación, bien por un fallo en la interacción de las moléculas de la calmodulina y de la ATPasa Ca2+-dependiente, bien por una alteración en el medio fosfolipídico de la membrana en el que la bomba se halla inmersa. La extrapolación de estos resultados a otros modelos celulares fue realizada por los mismos autores al estudiar sinaptosomas cerebrales de ratas hipertensas espontáneass54 y por otros al estudiar membranas de , células miocárdicas de la misma especie55. No obstante, en este último trabajo se pudo observar que la actividad basal de la ATPasa Ca2+-dependiente en membranas desprovistas de calmodulina era mayor en las ratas hipertensas que en las normotensas. Otros modelos de animal de experimentación con HTA de origen genético parecen poseer las mismas características por lo que respecta al transporte de Ca2+. Así, Vezzoli y cols. 56 publicaron un estudio en 1985 en el que se estudiaba el transporte activo de Ca2+ en preparados de membranas eritrocitarias de ratas hipertensas de la cepa de Milán. Esta estirpe de animales se caracteriza por desarrollar HTA de forma genética, aunque difiere de las ratas hipertensas espontáneas clásicas en el funcionamiento de sus sistemas de transporte y en su homeostasis iónica. Así, las ratas hipertensas espontáneas clásicas presentan una inhibición del cotransporte Na+-K+-Cl 57 y una tendencia a incrementar el contenido intracelular de Na+ cuando son sometidas a una sobrecarga salina. Este incremento del Na+ intracelular podría condicionar, en otras células diferentes a los eritrocitos, una disminución del transporte de Ca2+ y un aumento del Ca2+ libre citosólico a través de una inhibición del contratransporte Na+-Ca2+ 58 . Sin embargo, las ratas hipertensas milanesas poseen un cotransporte Na+-K+-Cl hiperactivo y una disminución del Na+ intracelular59, por lo que no podría aducirse este mecanismo para la inhibición del transporte de Ca2+. En el grupo de ratas hipertensas milanesas estudiadas por Vezzoli y cols.56, la actividad basal de la ATPasa Ca2+-dependiente en ausencia TRANSPORTE DE CALCIO Y HTA de calmodulina se encontró ligeramente aumentada, si bien las diferencias con las ratas normotensas no eran estadísticamente significativas. Por el contrario, la adición al medio extracelular de calmodulina estimulaba de forma significativamente superior el transporte activo de Ca2+ en las ratas normotensas. El anál i s i s cinético de dicho transporte mostraba una reducción del 30% en la rata hipertensa milanesa por lo que respecta a la velocidad máxima, sin diferencias en la afinidad para el calcio entre ambas especies. Similares resultados fueron referidos posteriorm e n t e por Cirillo y cols. 60 en el mismo modelo experimental, así como por otros autores, estudiando el músculo liso de las ratas Dahl sal-sensibles en condiciones de sobrecarga salina61. Una de las principales críticas que se pueden aducir a estos trabajos es la utilización de preparados de membrana en un medio artificial. Si bien los estudios r e a l i z a d o s hasta el momento muestran resultados prácticamente superponibles, no es menos cierto que l a s condiciones metodológicas empleadas reflejan escasamente la fisiología celular 62.Teóricamente, las condiciones idóneas para la medida de la actividad de la bomba de calcio deberían realizarse en células intactas. Por lo que respecta a la medida de esta actividad en la hipertensión experimental, caben destacar dos trabajos publicados hasta el momento. Dagher y cols.63 desarrollaron en 1987 una nueva ' metodología para el estudio de las propiedades cinéticas de la ATPasa Ca 2+- d e p e n d i e n t e en hematíes intactos. Los hematíes eran expuestos a la presencia del ionóforo A23187, capaz de aumentar la permeabilidad pasiva de la membrana celular para los cationes divalentes y promover una acumulación intracel u l a r de Ca 2 +. La adición al medio de cloruro de cobalto bloquea de manera inmediata todos los movimientos de calcio a través del ionóforo A23187, sin afectar la extrusión activa de calcio a través de la bomba. La aplicación de dicha metodología al estudio de la hipertensión experimental no fue capaz de poner de manifiesto diferencias significativas en la afinidad para el calcio o en la velocidad máxima de transporte en las ratas hipertensas espontáneas, tal como puede observarse en la tabla I. Finalmente, Orlov y cols.64, utilizando una tecnología diferente, en la que los eritrocitos son cargados con el quelante de calcio Quin-2 y la ATPasa bloqueada por la adición de Na3V04, no consiguieron d e m o s t r a r diferencias significativas en la actividad basal de la bomba de calcio en dos tipos de ratas con hipertensión genética, las ratas hipertensas espontáneas y las ratas hipertensas milanesas. Asimismo, la adición de R24571, un inhibidor de las acciones mediadas por la calmodulina, no provocaba diferencias en la concentración intracelular de Ca2+, por lo que dichos autores concluían que, al contrario de lo que Tabla I. Velocidad máxima de flujo (Vmax en mmol/l céls/h) y concentración intracelular de Ca 2 + requerida para alcanzar el 50% de la veloc i d a d máxima ( K 0 . 5, en ~moI/I céls) en los controles normotensos, hipertensos esenciales, ratas normotensas Wistar-Kyoto y ratas hipertensas espontáneas. Tomado de D a g h e r y cols. Biochim Biophys Acta 903:218-228, 1987. Controles normotensos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ratas Wistar- Kyoto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hipertensos esenciales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ratas hipertensas espontáneas.. ........ 16,9 Z!I 3,1 25,1 I!z 12,1 15,6 f 6,6 30,0 k 12,9 1 6,2z!I 7,9 12,1 + 4,9 21 ,o I?I 11,2* 11,7 & 5,3 * p < 0,1 al comparar con los controles normotensos. sucedía en los preparados de membrana, la calmodulina no jugaba un papel significativo en el transporte de calcio en las células intactas. Por otra parte, estos mismos autores sugerían que el aumento del calcio intracelular en la hipertensión arterial podría ser debido a un incremento en el influjo pasivo de este ion. A conclusiones parecidas llegaban Oshima y cols. 65 al estudiar plaquetas de ratas con HTA primaria. En resumen, de los estudios llevados a cabo en la hipertensión experimental puede deducirse que, si bien parece existir un defecto en la interacción entre la calmodulina y la bomba de calcio que condiciona una disminución de la extrusión de este catión cuando se utilizan preparados de membrana plasmática, este defecto no se reproduce al estudiar células intactas, donde el papel que juega la calmodulina en la activación de la ATPasa Ca2+-dependiente no está bien definido. Alteraciones de la bomba de calcio en la hipertensión arterial esencial La investigación de la actividad de la ATPasa Ca 2 + dependiente en la HTA esencial ha corrido pareja a la de la HTA experimental. La diferencia básica es que prácticamente todos los trabajos se han realizado en células circulantes por razones obvias. Nuevamente fue el grupo de Postnov 51, 54 el que demostró una disminución del transporte activo de Ca2+ estimulado por la calmodulina en membranas eritrocitarias de pacientes afectos de HTA esencial. Los resultados obtenidos fueron superponibles a los hallados en las ratas hipertensas espontáneas. En prepar a d o s de membrana sometidos a depleción de calmodulina no se observaron diferencias en el transporte activo de calcio, ni en la afinidad de la ATPasa , para el Ca 2 + ni en la velocidad máxima de transporte. Por el contrario, la adición de calmodulina (2 459 A. DE LA SIERRA I / HYPERTENSlVE WITH ABNORMAL Ca+ PUMP * `i 1. I I \,\ & 7 I 2.5 l INTERNAL Sr2+ CONTENT (mmol/l. cells) INTERNAL Caz+ CONTENT (mmol/l. cells) Fig. 3-Estimulación del flujo de Sr2+ por el aumento en la concentración intracelular de Sr2+ (izquierda) e inhibición por el aumento en la concentración de Ca2+ (derecha). Un ejemplo de un paciente hipertenso Ca2+ bomba (-) se compara con la media obtenida en 20 controles normotensos. Puede observarse que en este paciente la curva de estimulación del flujo de Sr2+ se halla desplazada a la derecha, r e f l e j a n d o un au m e n t o de la constante de disociación para el Sr2+ intracelular (KSr), alcanza mayores valores de velocidad máxima (Vmax) y la curva de inhibición por el Ca2+ intracelular se halla asimismo desplazada a la derecha, lo que indica un aumento en la constante de disociación para el Ca2+ intracelular (KCa ) . (Tomado de De la Sierra y cols. J Hypertens 8:285-29.3, 1990). @mI), independientemente de su origen, provocaba un aumento tanto de la afinidad para el Ca2+ como de la velocidad máxima, que era claramente superior en los individuos normotensos respecto a los hipertensos esenciales. Mientras que en los pacientes afectos de HTA esencial la adición de calmodulina duplicaba la velocidad máxima de transporte y triplicaba la afinidad para el Ca 2 + ambos parámetros se multipli, caban por 5 en los preparados de membranas eritrocitarias de los individuos normotensos. La conclusión final fue que debía existir un defecto en la interacción de la calmodulina con la bomba de calcio de las membranas eritrocitarias. La extrapolación de este defecto a otros modelos celulares presuntamente implicados en la HTA esencial venía dada por los resultados obtenidos en ratas hipertensas espontáneas, ya discutidos previamente. Estos resultados fueron confirmados posteriormente por otros autores. Así, Olorunsogo y cols. 66 corroboraban que los eritrocitos de los pacientes hipertensos esenciales presentaban una estimulación del 460 transporte activo de Ca2+ q u e representaba el 50% de la obtenida e n l o s i n d i v i d u o s n o r m o t e n s o s . Igualmente, Resinck y cols. 67, al estudiar plaquetas de pacientes con HTA esencial, encontraron una disminución de la estimulación del transporte de Ca2+ por la calmodulina, si bien la actividad basal de la ATPasa se encontraba aumentada en estos pacientes. Contrariamente a estos resultados, Vincenzi y cols.68 , al estudiar un grupo de 36 hipertensos esenciales, detectaron una disminución de la actividad basal de la ATPasa asumida como la actividad resistente a la inhibición por la trifluoperazina, conocido inhibidor de las acciones de la calmodulina69. Por el contrario, en ausencia de dicho inhibidor y asumiendo que estas condiciones representaban la actividad máxima de la ATPasa, no se encontraron diferencias entre normotensos e hipertensos. En un trabajo ya comentado anteriormente, Dagher y cols. 63, en el primer estudio utilizando el hematíe intacto de ratas hipertensas espontáneas y pacientes hipertensos esenciales, concluían que no existían alte- * TRANSPORTE DE CALCIO Y HTA Tabla II. Parámetros cinéticos de la bomba de calcio eritrocitaria en la HTA esencial Hipertensos Controles normotensos (N = 20) esenciales (N = 22) V IlI.l\ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K ,, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 NORMOTENSIVE CONTROL'& (n = 20) K(, ,............................. ti,0 _+ 0,2 394 + 23 SS k 3 5,7 f 0,4 480 f hl 7.3 f7" a 6 V _: veloc~iddcl ni,íxini,1 tld flujo tlc S r " . K,,: ~~onst~~nt~~ tIe tlisoc i