NEFROLOGÍA. Vol. XXIV. Número 3. 2004 FORMACIÓN CONTINUADA Estrategia del gen candidato en la hipertensión arterial: Estudios de ligamiento y asociación F. Rodríguez Esparragón, J. C. Rodríguez Pérez, A. Macías y Y. Hernández Trujillo Unidad de Investigación, Servicio de Nefrología, Hospital de Gran Canaria Doctor Negrín Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Un objetivo de radical importancia en genética humana es avanzar en el conocimiento de cómo los factores genéticos y ambientales se combinan para dar lugar a una enfermedad. El conocimiento del genoma humano, la creación de bancos de muestras de DNA y datos clínicos en muchos países de nuestro entorno, generan un optimismo que a juicio de los autores debe transmitirse a toda la comunidad científica. La búsqueda de genes que influencian rasgos y/o enfermedades ha centrado la investigación en los últimos años en biomedicina. Cuando se reconoce que un gen contribuye a una enfermedad que puede modificarse, el conocimiento de la estructura, función y manipulación del gen puede conducir a grandes progresos en el conocimiento de la enfermedad, predecirla, diagnosticarla y poner las armas necesarias para su prevención y tratamiento. El propósito de este artículo es ahondar en las aportaciones hasta ahora realizadas por los estudios de ligamiento y asociación de algunos genes implicados en la génesis de la hipertensión arterial (HTA) y su posible utilidad futura ante un campo, la epidemiología molecular, en constante evolución. En los estudios de ligamiento, en los que las familias forman el núcleo de investigación se estudia la relación entre presión arterial heredada (cifras/ser o no hipertenso) y los marcadores moleculares heredados. Se precisa para ello, familiares emparen- Correspondencia: Dr. José Carlos Rodríguez Pérez Unidad de Investigación ­ Servicio de Nefrología Hospital de Gran Canaria Doctor Negrín 35010 Las Palmas de Gran Canaria e-mail: jrodperd@gobiernodecanarias.org tados afectos y no afectos. Las regiones cromosómicas o génicas que están influenciando las cifras de presión arterial son aquéllas en donde la identidad molecular compartida se asocia en semejanza con la presión arterial, mayor que la que podría ser esperada como la establecida al azar1. Los estudios de asociación son esencialmente estudios casos-controles, donde el núcleo de la investigación es la población2. La frecuencia de un determinado marcador difiere significativamente entre casos y controles. Al contrario que en los estudios de ligamiento, la mayor facilidad metodológica con la cual este tipo de trabajos pueden ser abordados y la pléyade de estudios, de asociación positiva o de falta de asociación publicados, sus correspondientes replicaciones en poblaciones dispares y los problemas derivados ­tamaño de muestra insuficiente, caracterización inadecuada de los fenotipos, estratificación de las poblaciones, entre otros­ contribuye a que estén cada vez más en tela de juicio. Algunos críticos son demoledores y apuntan incluso a una excesiva simplificación del razonamiento que lleva a asociar un determinado gen candidato con la enfermedad3. Empero, un estudio de asociación cuidadosamente realizado y una elección adecuada de los marcadores en estudio puede, a nuestro modo de entender, revelar importantes aportaciones, no sólo en la aproximación clásica de creación de perfiles de riesgo o de evolución de la enfermedad, sino en la propia participación de los genes en estudio a la enfermedad. A modo de ejemplo, estudios recientes muestran que la herencia de las variaciones de un único nucleótido (SNP) no es independiente; por el contrario, un conjunto determinado de alelos de determinados SNP se heredan en bloque; es decir, constituirían un patrón específico o haplotipo. Lo 202 GEN CANDIDATO EN HTA más impactante es que sets particulares de SNP se transmiten a lo largo de generaciones sin recombinación flanqueando, eso sí, puntos calientes de recombinación. De todo ello se deduce que se hace necesario crear nuevas herramientas de trabajo, tanto de biología molecular que permitan por un lado una mayor facilidad en el genotipado y una mayor cantidad de variantes analizadas, como estadísiticas que permitan procesar esta cada vez mayor cantidad de información e integrar la información que se obtiene. SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINAALDOSTERONA ·Gen de la renina (REN) Estudios de ligamiento Al contrario de lo que ocurre con otros genes del sistema renina-angiotensina (RAS), el gen REN ha sido poco estudiado en la etiología hipertensiva. A través del análisis de parejas de hermanos afectos se ha intentado determinar el ligamiento entre el gen REN y la HTA sin resultados positivos. El abordaje metodológico en estos estudios consistió en la determinación de haplotipos utilizando marcadores polimórficos dialélicos en el locus REN, distinguibles mediante enzimas de restricción: TaqI, HinfI, HindIII, Bgl I y Bgl II4-6. Fornage y cols.7, realizaron un análisis de ligamiento mediante componentes de la varianza, utilizando un marcador previamente caracterizado8, consistente en una repetición de cuatro nucleótidos localizada en el intrón 7 del gen REN sin resultado positivo. Estudios de asociación Excluyendo la forma mutacional (Arg387ter) que cursa con hiperproreninemia, junto a los marcadores dialélicos citados5 han de incluirse otros que se han caracterizado y utilizado posteriormente en distintos estudios de asociación9,10; por ejemplo, BgII se asoció de forma significativa con HTA en población de los Emiratos Árabes y en población caucasiana con hipercolesterolemia. Por el contrario, Hind III pero BglI no se encontró asociado a la HTA en población china12,13. ·Gen del angiotensinógeno (AGT) Estudios de ligamiento Kitelevset y cols.14 caracterizaron un polimorfismo por repetición de dos nucleótidos que fue posteriormente utilizado en el excelente trabajo pu- blicado en 1992, en el cual Jeunemaitre y cols.15 describieron por vez primera el ligamiento entre el locus génico AGT y la HTA en una muestra de hipertensos procedentes de Francia y EE.UU. Caufield y cols.16 demostraron gualmente la existencia de dicho ligamiento. Estudios posteriores realizados en población europea y australiana no han podido establecer la existencia de dicho ligamiento a pesar de utilizar un tamaño muestral mayor17,18. En este sentido, los propios autores y otros muestran una serie de limitaciones que pudieran ser responsables de la ausencia de ligamiento mostrada en estos trabajos. Al margen de la metodología empleada, la caracterización adecuada del fenotipo de la enfermedad constituye una premisa fundamental en este tipo de estudios. Fornage y cols.7 analizaron la contribución del locus AGT a la variación en las cifras tensionales en población joven normotensa sin obtener una contribución significativa. Estudios más recientes difieren en los resultados obtenidos mostrando una asociación positiva de determinados haplotipos con la HTA o con las variaciones en las cifras de AGT y efectos presumiblemente epistáticos con otras variantes alélicas del SRAA19-21. Estudios de asociación En el trabajo realizado por Jeunemaitre y cols.15 se identificaron 15 variantes alélicas en el gen AGT. De entre los distintos polimorfismos caracterizados, las sustituciones M235T y T174M asociaron significativamente con HTA. Desde entonces hasta el momento actual son numerosos los trabajos en los que, en diferentes poblaciones, se ha intentado establecer, especialmente de la sustitución M235T, su posible asociación con HTA, variación en las cifras tensionales y niveles plasmáticos de AGT. La mayoría de estos trabajos de asociación con HTA y su análisis a través de metaanálisis22 muestra una modesta asociación entre la variante M235T y la HTA. Diferencias en las frecuencias alélicas entre las poblaciones estudiadas23 e incluso entre diferentes localizaciones dentro de una población relativamente homogénea y la propia herogeneidad del fenotipo hipertensivo parece modular el riesgo de la variante M235T24. La posible asociación del polimorfismo pudiera depender además de la sensibilidad al sodio. Esta última relación se ha puesto de manifiesto en algunos trabajos realizados fundamentalmente en población joven sometida a dietas de restricción sódica25, pero no ha sido determinada por otros autores26-28. Se ha descrito un porcentaje de variación en la concentración de AGT plasmático asociado a M235T. Sin embargo, la sustitución, localizada en 203 F. RODRÍGUEZ ESPARRAGÓN y cols. Fig. 1.--Representación esquemática de algunas variaciones alélicas en los genes del Sistema Renina Angiotensina-Bradiquinina y su resolución tradicional en geles. La existencia de interacciones entre los diferentes alelos y la posibilidad de coheredabilidad entre conjuntos de alelos acomplejan el análisis futuro en estudios de asociación. el exón 2 no está presente en el producto final de la cascada RAS. Entre los diferentes alelos en la zona promotora del gen AGT, la variación A(-6)G se encuentra en desequilibrio de ligamiento absoluto con M235T29. A través de estudios de funcionalidad, este polimorfismo parece ser responsable de una mayor tasa de transcripción y de parte de las variaciones plasmáticas de AGT29,30, e incluso se ha publicado una asociación entre la variante A(-6)G y una mayor concentración plasmática de aldosterona31. Se han descrito distintas variantes en el promotor del gen AGT, entre éstas, quizá sean especialmente importantes C(-20)A, puesto que se ha demostrado que afecta a la tasa de transcripción in vitro32 y se ha asociado a HTA33, y el polimorfismo C(-18)T, que de igual forma se ha asociado a HTA34 y a una diferente actividad transcripcional32. La variante T+31C localizada en el primer intrón del gen se encuentra a su vez en desequiilibrio de ligamiento con M235T y A(-6)G. La existencia, por tanto, de determinados haplotipos que se encuentran de forma preferente en sujetos hiper204 tensos apoya la hipótesis de que se trata de una mutación ancestral que constituía una ventaja selectiva en dietas pobres en sodio (Fig. 1). ·Gen de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) Estudios de ligamiento Jeunemaitre y cols.35 observaron una ausencia de ligamiento entre el locus génico ECA y HTA utilizando una repetición de tetranucleótidos/dinucleótidos. O'Donnell y cols.36 realizaron un análisis de ligamiento del locus ECA y la HTA en la población del Framinghan Heart Study, que resultó significativo en hombres, pero no en mujeres. De forma similar, Fornage y cols.7 desarrollaron un estudio de ligamiento mediante el análisis de componentes de la varianza utilizando marcadores polimórficos de los genes RAS. El estudio determinó la contribución de cada locus a la variabilidad de las cifras tensionales (presión arte- GEN CANDIDATO EN HTA rial diastólica, sistólica y media) en sujetos normotensos. Este análisis mostró una contribución significativa de la región ECA a la variación en las cifras de presión arterial en hombres, pero no en mujeres. Un estudio de ligamiento y de asociación en familias nigerianas con 13 marcadores polimórficos en el gen ECA fue realizado por Zhu y cols.37. En él, no se encontró ligamiento positivo, pero la asociación con la variación de cifras tensionales resultó significativa. Estudios de asociación El polimorfismo de inserción (I)/deleción (D) en el gen de la enzima convertidora se ha asociado significativamente con enfermedad isquémica coronaria, hipertrofia cardiaca, reestenosis coronaria, enfermedad renal y progresión hacia la insuficiencia renal en distintas formas de glomerulopatías. Yoshida y cols.38 sugirieron que la secuencia de la inserción de 287bp en el intrón 16 del gen ECA actuaría por semejanza como una secuencia silenciadora. Este hecho justificaría, parcialmente, la variación en las cifras plasmáticas de ECA en función del polimorfismo encontradas en algunas trabajos. Por otro lado, Mizuiri y cols.39 demostraron variaciones intrarenales de mRNA de la ECA en función del polimormismo I/D. A pesar de estos importantes aportes, los diferentes estudios en los que se ha analizado la asociación entre los genotipos del polimorfismo ECA (I/D) y la HTA en población caucasiana no son concluyentes24,36,37. ·Gen del receptor 1 de la angiotensina II (AT1R) Estudios de ligamiento Bonardeaux y cols.40 abordaron la caracterización de variantes alélicas en la región 3' no traducida del gen AT1R. Identificaron cinco polimorfismos distintos, las variantes +573, +1062, +1166, +1517 y +1878 en el exón 5. Además, realizaron un primer análisis de ligamiento que no resultó positivo, sin embargo, algunos trabajos recientes muestran un ligamiento entre el locus AT1R y la HTA en población caucasiana y china41, 42. Estudios de asociación En el trabajo de Bonardeaux y cols.40 la variante A1166C se asociaba con un mayor riesgo hipertensivo. Tras la caracterización inicial, se han identificado otras variantes polimórficas en el gen AT1R, concretamente en la región 5'-UTR y en el exón 443-45. El análisis de la posible asociación del polimorfismo A1166C en población caucasiana muestra resultados contradictorios40, 42, 44, 46-48. Chaves y cols.49 han analizado los polimorfismos A1166C y C573T en sujetos hipertensos y han encontrado una correlación entre el logaritmo de la excreción urinaria de albúmina y los genotipos C573T. Recientemente, Takahashi y cols.50 han caracterizado, mediante PCR-DGGE y posterior secuenciación, nuevas variantes alélicas en la región 5' del gen AT1R. La frecuencia del alelo ­535T se encontró significativamente aumentada en la población hipertensa analizada. Particular interés ha generado el poder establecer la existencia de una respuesta diferente mediada por el receptor AT1R a la angiotensina II (ANG II) en función de los genotipos A1166C y si, de igual forma, la respuesta a tratamientos antihipertensivos se modifica en función del polimorfismo A1166C51, 52. Aunque existen resultados que parecen indicar una mayor eficacia en la respuesta a las terapias antihipertensivas y una mayor sensibilidad a la ANG II en los sujetos portadores del alelo C51, 53-55, probablemente el polimorfismo constituye a su vez un marcador de otra u otras variantes. ·Gen de la aldosterona sintasa Estudios de ligamiento Las mutaciones en el gen CYP11B1 que cataliza el último paso en la síntesis de cortisol y mutaciones en el gen CYP11B2 que cataliza el último paso en la síntesis de aldosterona son las responsables de la hiperplasia adrenal congénita y de la deficiencia en aldosterona, formas monogénicas que cursan con hipertensión e hipotensión arterial respectivamente. La recombinación anómala entre ambos genes crea un gen híbrido responsable del hiperaldosteronismo remediable por glucocorticoides. Dada la importancia de ambos genes en las distintas formas de hipertensión monogénica, parecería plausible determinar si las distintas variantes alélicas de los genes CYP11B2 y CYP11B1 pudieran estar ligadas al desarrollo de HTA esencial. En el trabajo de Brand y cols.56 se analizó esta posibilidad de ligamiento con el gen CYP11B1. Se utilizó la estrategia de parejas de hermanos afectos y un polimorfismo de repetición de dinucleótidos (CA)n, un microsatélite caracterizado por los propios autores. No se obtuvieron evidencias estadísticas de ligamiento. Estudios de asociación White y cols.57 describieron distintos polimorfismos en el gen CYP11B2. De especial interés resultó la caracterización en la región promotora del gen CYP11B2 de la variante (-344C/T) puesto que determina parte de la actividad transcripcional a través de la unión a la proteína reguladora SF-1. Esta actividad resulta cuatro veces mayor para el alelo -344C que para el alelo -344T57. En el trabajo ya citado previa205 F. RODRÍGUEZ ESPARRAGÓN y cols. mente, Brand y cols.56 determinaron una asociación positiva entre la HTA y la variante alélica -344T. Distintos trabajos han mostrado la utilidad del polimorfismo-344C/T como marcador de riesgo hipertensivo, tanto en población europea hipertensa definida según los criterios que se siguen habitualmente en la clínica, como en población hipertensa asociada a renina baja58. Existen resultados dispares en población japonesa59. Un aspecto interesante en este sentido es la reciente aparición de publicaciones en las que se muestra la posible existencia de efectos epistáticos entre otros genes RAS y el polimorfismo -344C/T. Fardella y cols.60 analizaron en población chilena el polimorfismo Lys173Arg y encontraron el alelo Arg173 significativamente aumentado en los hipertensos con actividad renina plasmática baja. ·Genes sistema calicreína-quinina El gen del quininógeno (KNG) genera, por splicing alternativo, las formas de alto y bajo peso molecular61-63. Las quininas son polipéptidos que contienen la secuencia de la bradiquinina y la lis-bradiquinina en su estructura. Bradiquinina y lis-bradiquinina se generan por acción proteolítica sobre el precursor quininógeno de alto peso molecular de las enzimas quininogenasas o calicreínas de las que existen formas tisulares y una forma plasmática codificadas por una amplia familia genica. La plasmática difiere de las tisulares en que se sintetiza en el hígado como precalicreína y es convertida en el plasma en calicreína64. En cualquier caso, las calicreínas son serín-proteasas que poseen diferente especificidad de sustrato. Los estudios realizados sobre variantes alélicas en el sistema calicreína-quinina son escasos y se han centrado sólo en algunos de estos genes. Hasta ahora se han identificado distintos genes que codifican formas con patrones de expresión tisular, todos localizados en el comosoma 19. El gen KLKB1, localizado en 4q34-35 codifica para la calicreína plasmática. ·Gen calicreína 1 (KLK1) Estudios de ligamiento En 1996, Yu y cols.65 publicaron un estudio de ligamiento que resultó negativo entre diversos marcadores de genes del sistema RAS y KLD1 y la enfermedad renal terminal en población afroamericana. No se han realizado análisis de ligamiento específicos para HTA o variaciones en las cifras tensionales. Realizando una caracterización más amplia de todo el locus localizado en 19q13.3, en el que se localizan distintos genes calicreínas. Yousef y cols.69 identifican 206 un minisatélite polimórfico de utilidad para futuros análisis genéticos. Estudios de asociación Los estudios en modelos de ratas hipertensas y en humanos muestran una relación inversa entre la excreción urinaria de calicreína y la presión arterial. Esta relación resulta particularmente importante en afroamericanos. Berge y cols.67, 68 analizaron la posible asociación entre un polimorfimso detectable con el enzima de restricción TaqI en el gen KLK1 y la variación en las cifras tensionales sin evidencias estadísticas de asociación. En 1997 Berge y cols.69 describen nuevos polimorfismos en el gen KLK1 y analizaron su posible asociación con la variación en las cifras tensionales sin obtener resultados positivos. Tampoco los obtuvieron Friend y cols.70, empleando microsatélites en el gen de la calicreína renal. Yu y cols.71, sin embargo, analizaron e identificaron nuevas variantes en la región promotora del gen KLK1. Los ensayos de transfección realizados mostraron diferencias en la actividad transcripcional en función de algunas de estas variantes. ·Gen calicreína 1 [(KLKB1), KLK3]. Forma plasmática Estudios de ligamiento Yu y cols.71 efectuaron un análisis de ligamiento KLK1 y enfermedad renal terminal (ESRD). En la misma población se había analizado previamente el ligamiento génico con KLKB1 (KLK3) tras caracterizar nuevos marcadores: KLK3b y KLKc64. Evaluaron 142 parejas de afectos de 121 familias afroamericanas. No se obtuvo un ligamiento significativo. Estudios de asociación Éstos fueron realizados por el grupo de Yu y cols.65 con la enfermedad renal terminal exclusivamente. Se han caracterizado nuevas variantes alélicas72. ·Genes de los receptores B1 (inducible) y B2 (constitutivo) de las quininas (B1R y B2R) Estudios de asociación Los genes de los receptores 1 y 2 de la bradiquinina poseen la estructura típica de un receptor acoplado a proteína G con siete dominios transmembrana. Si bien existen importantes diferencias funcionales y de regulación, ambos receptores están implicados en la etiología hipertensiva, como se demuestra en numerosos estudios realizados en animales y humanos63. Se han descrito muchas variantes alélicas tanto en la F. RODRÍGUEZ ESPARRAGÓN y cols. Fig. 2.--Representación esquemática de las variaciones más estudiadas en el gen eNOS y su resolución tradicional en geles. región codificante como promotora del gen B2R73-77, de entre las cuales la variante por deleción de 9 pb (+/-) en el exón 1 se ha asociado con variaciones en las cifras de presión arterial e hipertrofia ventricular izquierda y mayor expresión del mensajero78, 79. De igual forma el polimorfismo C(181)T se ha asociado con HTA80 y la transición C58T con HTA en población afroamericana y japonesa76-81. Bachvarov y cols.82 caracterizaron dos sitios polimórficos en el gen B1R. Probablemente, el más importante consiste en la sustitución G­>C en 699 en la región promotora. Mostraron que el alelo C se encontraba con menor frecuencia en pacientes con ESRD. La sustitución determina una actividad promotora incrementada82. Su posible contribución al riesgo hipertensivo no ha sido suficientemente evaluada, si bien Dhamrait y cols.78, en un estudio prospectivo, muestran una contribución significativa al riesgo cardiovascular atribuible a incrementos en la PAS. ·Gen de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) Estudios de ligamiento La identificación y caracterización del gen de la óxido nítrico sintasa endotelial permitió a su vez detectar numerosos marcadores altamente informativos para posteriores estudios de ligamiento83-85. Bonnardeaux y cols.83 publicaron los resultados de un estudio de ligamiento y/o asociación y ambos con resultados negativos. Utilizaron marcadores previamente descritos. Este trabajo fue seguido por el realizado por Hunto y cols.86, resultando también en una ausencia de ligamiento. Takami y cols.87 realizaron un estudio de ligamiento en población general con cinco marcadores polimórficos, entre el locus eNOS y variaciones en las cifras de PAS, PAD y PAM que también resultó en ausencia de ligamiento (Fig. 2). Nakayama y cols.88 encuentran en población japonesa un estudio de asociación positivo utilizando el marcador previamente identificado en el intrón 13, en pacientes hipertensos con hipertrofia ventricular izquierda. Estudios de asociación Se han descrito numerosas variantes alélicas en el gen eNOS84,85. En relación con la hipertensión arterial se han analizado las variantes en el promotor T-786C, en el exón 7 G874T, responsable a su vez del cambio Glu298Asp, el polimorfismo consistente en la repetición cuatro veces (alelo a) o cinco veces (alelo b) de una secuencia de 27bp y una variante por repetición CA, todos con resultados dispares dependiendo de la población analizada88-98. Otras dos variantes localizadas en los intrones 18 (Ala27Cys) y 23 (Gly10Thr) no pa- F. RODRÍGUEZ ESPARRAGÓN y cols. recen asociarse a HTA83, 99, 100. Es interesante señalar que, de entre los polimorfismos señalados, Glu298Asp se ha estudiado como principal candidato asociado a cambios funcionales in vivo101, 102. Las evidencias experimentales muestran, sin embargo, que la actividad enzimática no se modifica103. Por el contrario, el polimorfismo 4a/b, localizado en el intrón 4 del gen, parece constituir una variante funcional y se ha asociado a diferencias en actividad enzimática y niveles de mensajero100. Wang y cols.100 encontraron menores niveles de mensajero en sujetos heterocigóticos respecto a homocigóticos para el alelo b. Sin embargo, la actividad enzimática se encontraba incrementada en los heterocigóticos, pero no en los homocigóticos. Dos aspectos parecen tener especial relevancia en el análisis de las variantes eNOS: primero, la importancia de determinados condicionantes ambientales y segundo, la posible existencia de efectos apistáticos94, 100, 104, 105. ·Genes del canda de sodio epitelial (ENaC) Estudios de ligamiento Las mutaciones caracterizadas en las subunidades (gen SCNN1B) y (gen SCNN1G) del ENaC responsables del síndrome de Liddle y del pseudohipoaldosteronismo de tipo I hacen pensar que las variaciones alélicas no mutacionales en este gen pudieran ser importantes en la etiología de la HTA esencial. Se han realizado diversos estudios que muestran un ligamiento significativo de los genes SCNN1B y SCNN1G con variaciones en las cifras de PAS en población caucasiana106. En otro tipo de poblaciones (afrocaribeña y china) no se ha establecido un ligamiento significativo107, 108. Estudios de asociación Su y cols.109 en 1996 y Persu y cols.110 en 1998 acometieron la búsqueda y caracterización de numerosas variantes alélicas en el gen (SCNN1B). Entre los distintos polimorfismos carcterizados, las variantes -T594M109 y -G442V110 revisten particular interés. A pesar de la ausencia de ligamiento entre los genes SCNN1B y SCNN1G y la HTA en población no caucasiana, las variantes descritas parecen asociarse significativamente con la HTA en población africana. Su y cols.109 describen que la sustitución T594M se presentaba en afroamericanos, pero no en caucasianos. Baker y cols.111, analizando la distribución de genotipos -594M en población negra, asigna a la variante las diferencias en prevalencia de hipertensión y en la mayor se- Fig. 3.--(A) Comparación de medias de PAS, PAD y PAM mediante el test de Mann-Whitney para sujetos portadores del alelo a versus homozigóticos b/b del polimorfismo eNOS (4a/b). P=0.001 (PAS); P=0.206 (PAD); P=0.014 (PAM). (B) Análisis similar para los sujetos ProPro versus portadores del alelo Ala del polimorfismo Prol2Ala del gen PPARy. P=0.068 (PAS); P=0.007 (PAD); P=0.007 (PAM). (C) Test de Kruskal-Wallis para las comparaciones por grupos. P=0.002 (PAS); P=0.035 (PAD); P=0.005 (PAM). Figura no publicada, perteneciente al estudio 97. 208 GEN CANDIDATO EN HTA veridad de la misma. Éste y otros trabajos más recientes confirman la importancia de -T594M112. Otras variantes alélicas caracterizadas en el gen SCNN1B, si bien no se han asociado con la HTA, sí muestran una frecuencia significativamente incrementada en población de origen africano, destacando la importancia decisiva de la población y de su homogeneidad en las enfermedades poligénicas (Fig. 3). También se han identificado numerosas variantes alélicas en el gen SCNN1G, aunque no parece existir diferencias importantes en la distribución genotípica entre sujetos normotensos e hipertensos113-116. Iwai y cols.117 en población japonesa caracterizan varios polimorfismos en la región promotora del gen SCNN1G. La variante G(-173)A se asoció significativamente con mayores cifras de PAS. En ensayos de transfección el alelo G(-173) incrementaba la actividad promotora del gen. De igual forma, la variante T474C localizada en el tercer exón del gen se asoció con mayores cifras tensionales. ·Gen de la -adducina (ADD1) Estudios de ligamiento Cusi y cols.118 publicaron el primer análisis de ligamiento entre el locus génico ADD1 y la HTA e identificaron un polimorfismo en el exón 10 (Gly640Trp) que permitió además realizar un estudio de casos y controles. El análisis de ligamiento y el estudio de asociación fueron posteriores a la obtención de evidencias en la estirpe de ratas hipertensas (cepa Milán), de que un polimorfismo del gen de la ADD1 se asociaba en estos animales con una importante variación en las cifras tensionales119. En humanos se han realizado otros estudios de ligamiento con resultados cont ra d i c t o r i o s 1 0 8 . Busjham y cols.120 realizaron, en gemelos normotensos, un análisis de ligamiento y un estudio de asociación entre el locus ADD1, polimorfismos génicos y la variación de las cifras tensionales. El resultado mostró un ligamiento significativo entre el locus del gen ADD1 y la variación en las cifras de PAS. Otros estudios fallan en la obtención de ligamiento significativo121. Estudios de asociación Cusi y cols.118 describieron el polimorfismo Gly640Trp en el gen ADD1. Los primeros estudios casos-controles mostraron una asociación significativa de la variante génica y la HTA en población francesa e italiana122. Estudios posteriores y en otras poblaciones resultareon en ausencia de asociación123, 124. Sin embargo, numerosas evidencias sugieren un papel importante de los genotipos Gly640Trp en la homeostasis del sodio125. Por ello, se ha intentado establecer relaciones con otros genes involucrados de forma general en la homeostasis vascular. En este sentido, el trabajo de Clark y cols.126 trató de determinar los efectos epistáticos con otros polimorfismos previamente analizados por los autores sin asociación positiva. La heterogeneidad obtenida en los diferentes estudios de casos y controles realizados parece depender, como en otras variantes alélicas polimórficas, de la población analizada. De los trabajos tanto experimentales como clínicas se destaca el papel relevante de Gly460Trp en la hipertensión118. Los portadores del alelo 460Trp poseeen una reabsorción tubular de sodio incrementada, una menor actividad de renina plasmática y, lo que es más importante, una mayor afinidad hacia la ATPasa Na, K122, 125. ·Gen de la subunidad 3 de las proteínas G heterotriméricas (GNB3) Estudios de asociación Siffert y cols.127 describieron una sustitucion C/T en la posición 825 del exón 10 del gen GNB3. El alelo T se asoció significativamente con HTA. La sustitución genera un splicing alternativo que, a su vez, produce una proteína delecionada en 41 aminoácidos por pérdida de los nucleótidos 498-620 en el exón 9. Tras la caracterización inicial, algunos trabajos han mostrado una asociación significativa con HTA128, pero no sus replicaciones129, 130. ·Gen PPAR- Estudios de asociación La resistencia insulínica, la obesidad y la HTA constituyen un conjunto de anomalías que suelen presentarse conjuntamente en un alto porcentaje de población131, 132. El gen PPAR codifica para un factor de transcripción dependiente del ligando133. Se han caracterizado tres isoformas, aunque sólo dos difieren funcionalmente133, 134. La isoforma PPAR2 se expresa de forma preferente en tejido adiposo; sin embargo, distintos factores controlan sus niveles de expresión en tejidos no adiposos135. Recientemente, hemos observado que la variante polimórfica Pro12Ala136 en el gen PPAR2 se asociaba con el riesgo hipertensivo en nuestra población97. Estudios clínicos previos mostraban que las 209 F. RODRÍGUEZ ESPARRAGÓN y cols. tiazolidinedionas, drogas cuya diana es precisamente PPAR, ejercercen efectos adicionales reduciendo las cifras tensionales137, 138. Estudios en ratas hipertensas139 y diferentes trabajos in vitro137, 139 han mostrado efectos directos de la activación de PPAR en la regulación de genes de importancia vascular. Es más, en nuestro trabajo observamos que el riesgo hipertensivo caracterizado se manifestaba de forma preferente en sujetos con niveles de homocisteína dentro del rango de normalidad (normocisteinemia) y quedaba enmascarado en aquellos sujetos con niveles de homocisteína moderados e intermedios. Estos hechos justificaban observaciones previas que mostraban una relación inversa entre niveles de homocisteína y expresión de PPAR140. Dado que la expresión de la isoforma PPAR2 se produce de forma preferencial en tejido adiposo es probable que la variante Pro12A la constituya un marcador de la expresión de PPAR1 u otros genes de mayor importancia en terriorio vascular97. Durante las etapas finales de la elaboración de este manuscrito, detectamos un artículo publicado por E. Pamies Andreu y cols. (Hipertensión, 20: 163-170, 2003), acerca de los "Factores genéticos en la hipertensión arterial". En este artículo los citados autores van realizando un comentario resumido de los trabajos más representativos que relacionan cada uno de los genes nominados al inicio del manuscrito, con la hipertensión arterial. Por el contrario, en el presente artículo tratamos de establecer las estrategias de trabajo de los genes que consideramos candidatos a la HTA. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. BIBLIOGRAFÍA 1. 2. 3. 4. Salido E: Análisis del DNA. Ill. Mapping genético y mapping físico. Nefrología 15 (Supt. 2): 18-30, 1995. 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