NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 3. 1994 COMUNICACION BREVE Un método inmunonefelométrico con rayo láser para la determinación de microalbuminuria G. García Bulnes, D. González Bárcena*, A. Ibarra*, A. Pérez López** y J. E. Exaire*** Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Nefrológicas. Jefatura de Investigación Médica, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. Departamento de Endocrinologia*, Unidad de Trasplante**, División de Medicina***. Hospital de Especialidades, Centro Médico La Raza, IMSS, México DF. Introducción Los capilares basal del glomérulo normal restringen casi en su totalidad el paso de moléculas de gran tamaño, como la albúmina. Cuando se inicia el daño glomerular, como en el caso de la nefropatía diabética, los capilares permiten el paso de proteínas de diferentes tamaños moleculares. Detectar esta patología en su principio no era posible debido a la escasa sensibilidad de las técnicas para cuantificar albúmina en la orina; anteriormente era posible diagnosticar esta nefropatía cuando las concentraciones de aquélla ya alcanzaban magnitudes de miligramos (albuminuria clínica), o sea cuando el daño glomerular ya se hallaba en fases avanzadas e irreversibles. C o n el radioinmunoanálisis modificado 1 para la determinación de pequeñas cantidades de albúmina en orina a nivel de microgramos (albuminuria subclínica o microalbuminuria) es posible conocer en qué momento se inicia el daño glomerular en la nefropatía diabética. Asimismo su importancia para predecir el futuro de la misma es relevante2. Claramente conviene disponer de métodos alternativos, posiblemente menos costosos. Se presenta aquí la validación de un método inmunológico específico y sensible. Se funda en la precipitación de albúmina en pequeños volúmenes de orina (µl) con un anticuerpo antialbúmina humana. La determinación de la concentración de los complejos (Ag-Ac) se efectúa por nefelometría láser, lo que lo hace reproducible y exacto. Material y método El fundamento del método es el siguiente: Antígeno (Ag) + Anticuerpo (Ac)wAg-Ac Albúmina humana Suero de conejo Complejo anti-albúmina precipitado humana Para procesar la curva de calibración se utilizó albúmina humana del Instituto Merieux Lyon, Francia (lote núm. O67,303H), suero de conejo anti-albúmina humana para nefelometría de los laboratorios Behring (s.a.p.a. Hoescht Behring), OSAL 04/05 (lote núm. B. 153916A), solución de cloruro de sodio al 0,9 % de concentración, a la que se le agrega detergente (Tween 20) a razón de 0,15 ml por litro. Esta solución se utiliza para hacer las diluciones de la albúmina humana y del anticuerpo, así como para Ilevar a 100 ul las muestras de orina. La curva de calibración se procesa con las siguiente,s concentraciones de albúmina: 0,01 0,1 56, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5 y 5,0 ug en 100 ul c/u de cada concentración, y por duplicado se depositan 100 ul directamente en las celdillas para nefelome- Recibido: 23-III-92 En versión definitiva: 9-XII-93. Aceptado: 9-XII-93. Correspondencia: Dr. J. Emilio Exaire. Hospital Especial del Centro Médico La Raza. Seris y Zaachila, s/n. C.P. 02990 -México D F. 341 G. GARCIA BULNES y cols. tría láser (Behring OVEI 0,4/0,5), se les agregan 200 u l del antisuero anti-albúmina humana diluido 1:10 c/u de las celdillas, se agitan y se dejan a temperatura ambiente por una hora. Las muestras de orina se centrifugan a 2.000 r.p.m. por 10 minutos a 4 ºC, se decantan y del sobrenadante se toman 20 ul, que se depositan directamente en la celdilla para nefelometría. Se complementa el volumen con 80 ul de solución salina Tween 20 y se procede igual que en la curva de calibración. L a s lecturas se hacen en el Behring Laser Nephelometer Mod. -B, que se encuentra conectado a una computadora Hewlett Packard mod. 9815-A, cuyo casete se programa previamente con las concentraciones y las lecturas correspondiente de voltaje, obtenidas de la curva de calibración en el nefelómetro láser. La computadora informa directamente los ug/100 u l de albúmina en las muestras de orina. Con el objeto de obtener las cifras normales de microalbuminuria por este método se solicitó la colecta de orina de 24 horas a 14 sujetos sanos (residentes médicos y personal de laboratorio). También se estudió un grupo de 47 pacientes adultos que asisten para su control a la Clínica de Diabetes Tipo I del Hospital de Especialidades del Centro Médico La Raza, del IMSS. Los pacientes fueron hospitalizados para evaluar diversas complicaciones de la diabetes mellitus, entre las que se incluyó la microalbuminuria de 24 horas. En este grupo, los períodos de evolución del padecimiento fueron de 3 meses a más de 20 años. y los valores límites internacionales que se han establecido para la microalbuminuria. Tabla I. Linearidad Vol. de Dil. Vol. tot. u g tot. Microalbúmina Lect. orina ug/min nefelómetro ul orina 24 h albúmina 10 u 5 PI 20 LI 0,2 0,4 0,8 2 0 0 1.490ml 100 50 1.490ml 1.49Oml 59.600 59.600 59.600 41,38 41,38 41,38 Las concentraciones de microalbuminuria en 24 horas de los 47 pacientes diabéticos tipo I hospitalizados, independientemente del tiempo de evolución, fueron: En 5 orinas (1 1 %) las cifras se encontraron entre los límites normales, de O-7 pg/min. En 36 pacientes (76 %), con valores de 20-70 &min, y los seis restantes (13 %), con más de 70 &min. En la figura 3 se presenta gráficamente la distribución de estos pacientes agrupados por períodos de cinco años de evolución hasta más de 20 años de haber iniciado el padecimiento. Al comparar las concentraciones de albúmina de los cinco grupos por cálculos estadísticos (prueba de U de Mann-Whitney10 para dos muestras independientes) con las cifras normales, todos los grupos resultaron diferentes a los normales: normales VS 3 meses a 5 años, p < 0,002; normales vs 5-10 años, p = 0,0005; normales vs 15-20 años, p < 0.003; normales VS más de 20 años, p < 0,025. Resultados La figura 1 presenta tres curvas de calibración de albúmina humana cuyas pendientes se sometieron a un análisis de varianza y el resultado (p = 0,410) demuestra que las tres son iguales. También se observa la sensibilidad, que va desde 0,156 a 5,0 ug/1 00 ul, así como a la variación interensayo, ya que se procesaron con una semana de diferencia una de la otra y el coeficiente de correlación fue F = 0,950. La linearidad se estudió colocando 5, 10 y 20 u l de la orina número 344, tomada al azar (fig. 2). La tabla I muestra también que se pueden usar diferentes volúmenes de orina sin alterar el resultado de la concentración de la albúmina. La reproducibilidad intraensayo se efectuó procesando 20 ul de la orina número 344 por decaplicado. Los resultados se presentan en la tabla II. En la tabla III se presentan las cifras normales de microalbuminuria obtenidas por inmunonefelometría láser, así como la comparación de estas concentraciones con las de otros métodos utilizados (RIA, inmunodifusión radial, etc.) por otros grupos de trabajo 342 MEDICION DE MICROALBUMINURIA Y Tabla II. Intraensayo orina número 344 (vol. 20 ul). Lect. Número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -10 n= nefelómetro 0,8 0,7 0.7 0.0 0.8 0,8 O,8 0,8 0,9 0,8 totales 59.600 52.150 52.150 59.600 59.600 59.600 59.600 59.600 67.050 59.600 ug Microalbuminuria ug/min 41,38 36,21 36,21 41,38 41,38 41,38 41.38 41,38 46,56 41,38 `> : E 0 c - 0 Lo- cm: : 0.6h I g 0.4`E z z 0.2I 5 F i g2.-Linearidad I 10 microalbuminuria . I 20 x ,=1.000 pco.oooo1 1 0.- x = 40.864 VS = 2.786. v'x = 0.881 CV = 6,81. Discusión Los valores de albúmina urinaria encontrados en los sujetos sanos por el método inmunonefelométrico láser (0-7 pg/min) son comparables con los que informan otros autores 2-9. En el estudio de los 47 pacientes diabéticos tipo 1, el 11% de ellos estuvieron entre cifras normales. Según los estudios de Mogensen y cols.2, 9, el grupo en el que presentaron concentraciones de 20-70 Fg/min el daño renal es temprano y reversible con tratamiento y dieta. En los seis pacientes cuyos valores se encontraron por arriba de 70 pg/min, el daño renal es probablemente avanzado e irreversible. No se presenta en detalle la relación entre los valores de microalbuminuria y el estado clínico de los pacientes, por ser éste un informe preliminar, cuyo interés principal es mostrar la exactitud y sencillez del método inmunoelectroforético láser para la cuantificación de pequeñas cantidades de albúmina en orina. Conclusiones El método inmunonefelométrico láser para la cuantificación de microalbuminuria es una herramienta sencilla de gran utilidad en la clínica, por ser un método específico, sensible, reproducible, exacto y de bajo costo, que permite al clínico en un momento dado disponer de una orientación rápida acerca de la magnitud del daño glomerular en el curso de la evolución del padecimiento renal. Agradecimientos Al Dr. Silvestre Frenk Freud por la revisión y corrección del manuscrito. Al físico Hugo Tuddón Garcés por los cálculos estadísticos, y a la señora Mónica Abrajam por su labor secretarial. Tabla III. Microalbuminuria y cifras normales. Año 1961 1968 1970 1971 1982 1982 1984 1987 1988 números () Autor Berggörd 1. Poortman J. 4 Miles D. W. 5 Mogensen C. E.6 Viberti, Kenn 7 Parvin H. 8 Mogensen C. E. 9 Mogensen C. E. 2 García B. G. bibliografía. Método Inmunoquímico Inmunodifusión radial RIA RIA RIA Inmunodifusión radial RIA RIA Inmunonefelométrico láser @min (24 h) 2,5-9,8 6,1-15,2 5,9-7,9 4,2-1 5,2 < 30 < 27,7 0-15 0-9 0-7 Normales Microalbuminuria pg/min 30-140 15-150 20-200 20-200 343 G. GARCIA BULNES y cols. Fig. 3.-Microalbuminuria en pacientes diabéticos tipo 1. Bibliografía 1. Keen H y Chlouverakis C: An immnoassay method for urinary albumin at low concentrations. Lancet 2:913-914, 1964 . 2 . M o g e n s e n CE: Microalbuminuria as a predictor of clinical diabetic nephrophaty. Kidney Int 31:673-689, 1987. 3 . B e r g g a r d I y Risinger C: Quantitative immunochemical d e t e r m i n a t i o n of albumin in normal human urine. Acta Soc Med Upsalien 66:217, 1961. 4. P o o r t m a n s J y Jeanloz K W : Q u a n t i t a t i v e i m m u n o l o g i c a l d e t e r m i n a t i o n of 12 plasma proteins excreted in human urine collected before and after exercise. J Clin Invest 47:386-393, 1968. 5. 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