NEFROLOGIA. Vol. XIX. Suplemento 1. 1999 III. TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA RENAL EN EL ANCIANO Relación entre control metabólico y disfunción endotelial en ratas diabéticas C. F. Sánchez-Ferrer, J. Angulo, S. Vallejo*, C. Peiró, J. L. Llergo, A. Sánchez-Ferrer*, E. Cercas y L. Rodríguez-Mañas* Departamento de Farmacología y Terapéutica. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Madrid. *Unidad de Investigación y Servicio de Geriatría. Hospital Universitario de Getafe. Madrid. Spain. RESUMEN Este trabajo se diseñó para analizar in vivo la influencia del control metabólico, medida por los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c), sobre la disfunción endotelial vascular en ratas diabéticas por estreptozotocina. Para ello, se estudiaron las respuestas vasoactivas de origen endotelial causadas por acetilcolina mediante la técnica de la rata anestesiada autoperfundida. Se utilizaron ratas no diabéticas como controles y cuatro grupos de ratas diabéticas con valores de HbA1c de 5,5 a 7,4%, de 7,5 a 9,4%, de 9,5 a 12% y mayor del 12%, respectivamente. Administrada sobre un tono previo de noradrenalina, acetilcolina (0,25, 0,75, 2,5, 7,5 and 25 µg/kg) indujo en todos los grupos respuestas vasodilatadoras dosis-dependientes, que fueron similares en el las ratas no diabéticas y en las diabéticas con un buen control metabólico (HbA1c de 5,5 a 7,4%), mientras que en ratas diabéticas con niveles de HbA1c mayores de 7,5% se observó una menor respuesta vasodilatadora a acetilcolina. En ratas diabéticas sin tratamiento (HbA1c > 12%), la relajación inducida por el donante de óxido nítrico nitroprusiato sódico fue asimismo menor. Nuestros resultados indican que la disfunción endotelial diabética está estrechamente relacionada con el control metabólico de la enfermedad. Es posible incluso establecer un umbral, a partir del cual se desarrolla deterioro endotelial, en porcentajes de HbA1c superiores al 7,5%. Palabras clave: Diabetes. Disfunción endotelial. Control metabólico. Oxido nítrico. Arginina. Aniones superóxidos. METABOLIC CONTROL AND ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN DIABETIC RATS SUMMARY This work was designed to determine in vivo the influence of the metabolic control of streptozotocin-induced diabetic rats, measured by the levels of hemoglobin glycosylation in blood (HbA1c), in developing vascular endothelial dysfunction. For this, the endothelium-derived vasoactive responses were studied using the technique of the anaesthetized autoperfused rat, analyzing the responCorrespondencia: Dr. Carlos F. Sánchez-Ferrer Departamento de Farmacología y Terapéutica Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Madrid Arzobispo Morcillo, 4 28029 Madrid 53 C. F. SÁNCHEZ y cols. ses to acetylcholine in non-diabetic and diabetic rats with different degree of metabolic control (four groups with HbA1c levels of 5.5-7.4%, 7.5-9.4%, 9.5-12%, and >12%, respectively). When administered over a noradrenaline-induced vasopressor tone, acetylcholine (0.25, 0.75, 2.5, 7.5 and 25 µg/kg) induced in all rat groups dose-dependent vasodilatatory responses, both reducing mean arterial pressure and perfusion pressure of the left hindlimb. These responses were similar in non-diabetic and in diabetic rats with good metabolic control (HbA1c of 5.5-7.4%), while diabetic rats with levels of HbA1c higher than 7.5% showed significantly lower vasodilatatory responses to acetylcholine. In untreated diabetic rats, the relaxant responses evoked by the nitric oxide donor sodium nitroprusside were analogously impaired. The results indicate that the endothelial dysfunction associated to diabetes is closely related to the level of metabolic control of the disease. Therefore, it is possible to establish a threshold for developing endothelium impairment from percentages of HbA1c higher than 7.5%. Key words: Diabetes. Endothelial dysfuncton. Metabolic control. Nitric oxide. Arginine. Superoxide anions. INTRODUCCION El deterioro de la relajación vascular mediada por el endotelio está descrito en pacientes diabéticos 1, 2 y en modelos experimentales de esta enfermedad 3, 4. Algunos estudios en humanos indican la posibilidad de una relación entre el control metabólico de la enfermedad y la aparición de vasculopatía diabética 5, 6. En este sentido, se ha sugerido en modelos animales de diabetes la existencia de un nexo de unión entre control metabólico y función endotelial 7, aunque este aspecto no ha sido específicamente abordado por ningún estudio. Con estas premisas, el objeto del presente trabajo ha sido determinar in vivo la influencia del control metabólico, medido por los niveles sanguíneos de hemoglobina glicosilada (HbA1c), en el desarrollo de la disfunción vascular diabética producida en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina. Para ello, mediante la técnica de la rata anestesiada autoperfundida, se estudiaron las respuestas vasoactivas de origen endotelial inducidas por acetilcolina (ACh) en rata diabéticas con distintos grados de control metabólico. METODOS Modelo experimental Diabetes insulino-dependiente fue inducida en ratas Sprague-Dawley de 16 semanas de vida (400 a 450 g) mediante una única administración de estreptozotocina (60 mg kg-1; i. p.). Tras una espera de 72 horas, se tomaron muestras de sangre en la cola de los animales y se midió la glucemia con un glucómetro Accutrend (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alema54 nia). La inducción de la diabetes se consideró un éxito cuando en estas condiciones la glucemia fue mayor de 200 mg dl-1. Un grupo de animales fue inyectado con solución salina en las mismas condiciones para su utilización como grupo control. Los animales fueron separados en cinco grupos diferentes, uno control (no diabéticas) y cuatro de ratas diabéticas, clasificados de acuerdo a su control metabólico (es decir, con distintos niveles de HbA1c: 5,5 a 7,4%; 7,5 a 9,4%; 9,5 a 12% y >12%). Para obtener este amplio rango en el porcentaje de HbA1c, un grupo de ratas diabéticas no recibió tratamiento alguno, mientras que en los otros tres se administraron diferentes cantidades de insulina mediante implantes subcutáneos de insulina bovina. Los implantes contenían ácido palmítico como excipiente y se introducían sin suturas bajo la piel dorsal de las ratas, ligeramente anestesiadas con ketamina (30 mg kg-1). Los cálculos para la dosis se hicieron siguiendo las instrucciones del fabricante, que indica que la liberación de insulina es constante y proporcional, independientemente de que se administre más de un implante o una fracción del mismo. Los implantes tienen 7 mm de longitud y secretan 2 U de insulina por día, por lo que un implante fraccionado liberará una cantidad proporcional (1 mm de implante libera 0,286 U por día). Así pues, la cantidad media de insulina recibida por los distintos grupos de animales se calculó según el número de implantes o fracciones de implante administrados. La cantidad de insulina recibida por cada grupo siguiendo este proceso fue de 8,3 ± 0,3, 6,0 ± 0,7 y 4,2 ± 0,5 U kg-1 día-1 en los grupos con niveles de HbA1c de 5,5 a 7,4%, 7,5 a 9,4% y 9,5 a 12%, respectivamente. Las ratas no diabéticas y las diabéticas sin tratar (HbA1c >12%) recibieron implantes controles de ácido palmítico. Los experimentos CONTROL METABOLICO Y FUNCION ENDOTELIAL EN DIABETES se realizaron ocho semanas tras la inducción de la diabetes, de acuerdo a lo previamente publicado 7. En ese momento se midió la glucemia y los niveles de HbA1c. La HbA1c se midió por inmunoturbidimetría8. Efectos de los fármacos en ratas anestesiadas autoperfundidas En estos experimentos se utilizó una modificación de la técnica descrita por Medgett 9. La diferencia principal fue que no se usaron ratas desmeduladas sino que los animales fueron anestesiados durante todo el experimento. Las ratas se anestesiaron con 40 mg kg1 de ketamina, 3,2 mg kg-1 de diazepam y 0,16 mg kg1 de atropina (i.p.), con dosis suplementarias cuando fue preciso. Los animales recibieron ventilación mecánica con un respirador (New England Medical Instruments, Medway, Mass, USA) y su temperatura se mantuvo a 37° C con una mesa térmica (Cibertec RTC1, Madrid, España). Se canularon ambas carótidas y la presión arterial sistémica y la frecuencia cardíaca se registraron a partir de la carótida derecha mediante un transductor de presión (Spectramed P23XL, Oxnard, CA, USA), conectado a un polígrafo (Grass 7D, Quincy, Mass, USA). La circulación del miembro trasero izquierdo se perfundió de modo constante con 3,3 ml min-1 kg-1 de sangre tomada de la carótida izquierda e infundida por una cánula situada en la arteria femoral izquierda. La presión de perfusión del miembro trasero se registró con un transductor de presión situado en el circuito de forma distal a la bomba peristáltica (Gilson Minipuls 2, Villiers-le-Bel, Francia) utilizada para la perfusión. El volumen extracorpóreo fue de 1,1 ml, rellenado con solución Krebs-Henseleit (KH) conteniendo heparina sódica (0,5 mg ml-1). La preparación se estabilizó tras perfundirse durante 30 min. Para estudiar las respuestas vasodilatadoras, se indujo un tono vasopresor infundiendo continuamente noradrenalina (2 µg min-1 kg-1) con una bomba (Harvard Apparatus, Millis, Mass, USA) por la arteria femoral izquierda. Cuando tanto la presión arterial media como la presión de perfusión en el miembro trasero izquierdo alcanzaron un tono estable, se administraron dosis sucesivamente mayores de ACh (0,25, 0,75, 2,5, 7,5 y 25 µg kg-1). Cada dosis de ACh se disolvió en 0,2 ml de KH y se infundió de una embolada en la arteria femoral izquierda, de forma no acumulativa, es decir, la respuesta producida por cada dosis se obtuvo desde el tono vasopresor basal, habiendo desaparecido por completo el efecto de cualquier infusión previa de ACh. En algunos experimentos, se verificó la capacidad vasodilatadora de nitroprusiato sódico (NPS; 3, 10, 30 y 100 µg kg-1) en ratas no diabéticas y en diabéticas sin tratamiento. Materiales La composición de la solución KH fue (mM): NaCl 115, CaCl2 25, KCl 4,6, KH2PO4 1,2, MgSO4.7H2O 1,2, NaHCO3 25, glucosa 11,1 y Na2EDTA 0,03. Los fármacos utilizados fueron hidrocloruro de noradrenalina, cloruro de acetilcolina, nitroprusiato sódico, sulfato de atropina, hidrocloruro de ketamina, diazepam (todos ellos de Sigma, St Louis, Mo, USA) y heparina sódica (Laboratorios Leo, Madrid, España). Los implantes controles y de insulina bovina se obtuvieron de Linplant (Scarborough, Ontario, Canadá). Las soluciones madre se realizaron en agua bidestilada, salvo la norarenalina que se preparó en salino (0,9% NaCl)-ascórbico (0,01%). Evaluación estadística Los experimentos se hicieron de forma no pareada, las desviaciones de la media respecto a las curvas a ACh y NPS se analizaron estadísticamente mediante el análisis de la varianza para dos factores. En otros casos, se utilizó la t de Student (los valores de la P se ajustaron mediante la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples). Se consideró la significancia estadística con una P < 0,05. Aspectos éticos Este trabajo se hizo de acuerdo a la normativa europea. El estudio se aprobó por el comité de investigación del centro. RESULTADOS Características de las ratas diabéticas por inducción con estreptozotocina Según lo descrito en métodos, se establecieron cinco grupos de animales, uno de ratas controles no diabéticas y cuatro de ratas diabéticas con diferentes grados de control metabólico, de acuerdo a sus niveles de HbA1c. Algunos parámetros de esos grupos están en la tabla 1, incluyendo las características hemodinámicas en condiciones basales, en ausencia de cualquier fármaco. La presión arterial media fue similar en todos los grupos, pero las presiones alcanzadas en el miembro inferior izquierdo, perfundido con un flujo constante, estuvieron elevadas de forma significativa en aquellos grupos de ratas diabéticas con niveles de HbA1c.mayores de 7,5%. También se observó en esos grupos un descenso de la frecuencia cardíaca (tabla I). Respuestas vasoactivas inducidas por ACh y NPS 1 La administración de noradrenalina (2 µg min-1 kg) produjo el aumento tanto de la presión arterial 55 C. F. SÁNCHEZ y cols. Tabla I. Parámetros generales de las ratas no diabéticas y de las diabéticas por estreptozotocina divididos en grupos en función de los niveles sanguíneos de HbA1c Diabéticas No diabéticas n=7 Peso, g Glucemia, mg dl-1 HbA1c, % Presión arterial media, mm Hg Frecuencia cardíaca, latidos min-1 Presión basal del miembro inferior izquierdo, mm Hg 466,8 158,3 4,03 122,7 369,2 80,8 ± ± ± ± ± ± 22,3 7,6 0,31 5,9 12,0 2,8 HbA1c 5,5-7,4% n=9 461,3 280,6 6,68 124,0 364,4 76,7 ± ± ± ± ± ± 17,1 24,9* 0,20* 4,2 11,4 5,0 HbA1c 7,5-9,4% n=8 375,3 455,2 8,79 128,7 317,5 102,1 ± ± ± ± ± ± 24,1* 32,3* 0,08* 4,8 11,8* 7,3* HbA1c 9,5-12% n=8 381,4 466,6 10,36 129,0 317,7 107,0 ± ± ± ± ± ± 20,9* 20,8* 0,20* 2,9 9,9* 10,2* HbA1c > 12% n=8 244,6 497,6 13,45 127,5 307,6 100,5 ± ± ± ± ± ± 9,9* 20,6* 0,25* 1,7 11,4* 4,5* Los resultados representan la media ± error estándard; n es el número de ratas empleadas en las mediciones. *P < 0,05 frente al valor del grupo de ratas no diabéticas. media como de la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo, siendo las respuestas observadas similares en el grupo control y en los diferentes grupos de ratas diabéticas (tabla II). Sobre esta respuesta vasopresora, la administración de ACh indujo respuestas vasodilatadores dependientes de la dosis, que originaban caídas transitorias de la presión arterial media y de la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo en todos los grupos de ratas estudiados. Expresando la máxima relajación en cada caso a 25 µg kg-1 de ACh frente al porcentaje de HbA1c en sangre (fig. 1), se observó que la mayoría de los animales con valores de HbA1c superiores a 7,5% mostraban respuestas a ACh menores que las de animales con valores de HbA1c inferiores a 7,5% (fig. 1). Cuando las ratas se agruparon como se ha descrito previamente, Tabla II. Aumentos de la presión arterial media y de la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo producidos por la administración de noradrenalina (2 µg min-1 Kg-2) en ratas no diabéticas y en ratas diabéticas con distintos niveles de HbA1c Presión arterial media mmHg No diabéticas; n = 7 HbA1c 5,5-7,4%; n = 9 HbA1c 7,5-9,4%; n = 8 HbA1c 9,5-12%; n = 8 HbA1c >12%; n = 8 116,5 121,2 112,6 120,7 112,8 ± ± ± ± ± 5,5 8,1 11,1 9,6 11,2 Presión de perfusión del miembro inferior izquierdo, mmHg 194,0 199,7 206,2 199,2 208,7 ± ± ± ± ± 12,5 12,1 8,0 10,4 6,2 Los resultados se expresan como media ± error estándard. n es el número de animales empleados en las mediciones. a 100 90 Presión (%) Presión arterial media 7,5% HbA1c b Presión de perfusión del miembro inferior izquierdo 7,5% HbA1c 100 90 Presión (%) 2 4 6 8 10 12 HbA1c (%) 14 16 80 70 60 50 40 30 80 70 60 50 40 30 2 4 6 8 10 12 HbA1c (%) 14 16 Fig. 1.--Respuestas vasoactivas individuales inducidas por 25 µg kg-1 acetilcolina sobre a la presión arterial media y b la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo perfundido con un flujo constante de 3,3 ml min-1 kg-1 de ratas no diabéticas y en diabéticas por estreptozotocina con diferentes grados de control metabólico, expresado en función de los niveles de HbA1c. Los datos se representan como porcentaje de la presión previa alcanzada por una infusión de noradrenalina. 56 CONTROL METABOLICO Y FUNCION ENDOTELIAL EN DIABETES observamos que la vasodilatación a ACh fue similar en animales no diabéticos y en aquellos diabéticos con mejor control metabólico (niveles de HbA1c de 5,5-7,4%). Por el contrario, en aquellas ratas con niveles de HbA1c de 7,5-9,4%, 9,5-12%, or > 12%, las respuestas producidas por ACh tanto sobre la presión arterial media como sobre la presión de perfusión en el miembro inferior izquierdo se redujeron de forma significativa y creciente (fig. 2). Los efectos de NPS (donante de NO) se comprobaron también en ratas diabéticas no tratadas (HbA1c > 12%). Este compuesto redujo de forma concentración-dependiente la presión arterial media y la presión de perfusión en el miembro inferior izquierdo, efecto que fue significativamente menor en las ratas diabéticas (fig. 3). DISCUSION La rata anestesiada autoperfundida permite registrar simultáneamente la presión arterial media y la presión de perfusión en el miembro inferior izquierdo 9. Utilizando esta preparación, la ACh indujo respuestas vasodilatadoras, expresadas como descensos de ambos parámetros. Estos resultados concuerdan con datos previos, en los que ACh baja la presión arterial en ratas a 100 90 Presión (%) 80 70 60 50 Presión arterial media b Presión de perfusión del miembro inferior izquierdo 100 90 Presión (%) 80 70 60 50 No diabéticas (n = 7) HbA1c 5,5-7,4% (n = 9) HbA1c 7,5-9,4% (n = 8) HbA1c 9,5-12% (n = 8) HbA1c > 12% (n = 8) 0,25 0,75 2,5 7,5 ACh (µg Kg-1) 25 0,25 0,75 2,5 7,5 ACh (µg Kg-1) 25 Fig. 2.--Respuestas vasoactivas inducidas por acetilcolina (ACh) sobre a la presión arterial media y b la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo perfundido con un flujo constante de 3,3 ml min-1 kg-1 de ratas no diabéticas y en diabéticas por estreptozotocina con diferentes grados de control metabólico, expresado en función de los niveles de HbA1c. Los datos se representan como media ± error estándard del porcentaje de presión previa alcanzada por una infusión de noradrenalina. El número de animales empleados en cada caso figura en paréntesis. *P < 0.05 (ANOVA) frente a la curva a ACh en ratas no diabéticas. a 100 90 Presión (%) 80 70 60 50 40 30 Presión arterial media b Presión de perfusión del miembro inferior izquierdo 100 No diabéticas (n = 4) HBA1c > 12% (n = 5) 90 Presión (%) 80 70 60 50 40 30 3 10 30 NPS (µg Kg-1) 100 3 10 30 NPS (µg Kg-1) 100 Fig. 3.--Respuestas vasoactivas inducidas por nitroprusiato sódico (NPS) sobre a la presión arterial media y b la presión de perfusión del miembro inferior izquierdo perfundido con un flujo constante de 3,3 ml min-1 kg-1 de ratas no diabéticas y en diabéticas por estreptozotocina sin tratamiento (HbA1c > 12%). Los datos se representan como media ± error estándard del porcentaje de presión previa alcanzada por una infusión de noradrenalina. El número de animales empleados en cada caso figura en paréntesis. *P < 0.05 (ANOVA) frente a la curva a NPS en ratas no diabéticas. 57 C. F. SÁNCHEZ y cols. anestesiadas 10. En preparaciones similares, la ACh también desciende la presión de perfusión de zonas específicas, siendo estas respuestas vasodilatadoras dependientes de la presencia del endotelio10, 11. Se ha descrito, además, que los cambios en la presión de perfusión reflejan las respuestas vasoactivas arteriolares 12, por lo que este método es válido para analizar la disfunción endotelial diabética en vasos de resistencia. La existencia de disfunción endotelial asociada a la diabetes ha sido demostrada en varios estudios 1-3. También se ha descrito una menor respuesta a donantes de NO en pacientes diabéticos 1. En el modelo de diabetes experimental utilizado en este trabajo, diabetes inducida por estreptozotocina, la interferencia con las relajaciones endotelio-dependientes se ha descrito tanto en segmentos vasculares aislados 8, 13 como en animales perfundidos 14, lo que indica que las alteraciones endoteliales ocurren tanto en vasos de conductancia como de resistencia. En concordancia con estos datos previos, las respuestas vasodilatadoras mediadas por ACh se redujeron en las ratas diabéticas, en los dos parámetros determinados. Además, la relajación inducida por NPS, un donante de NO independiente de endotelio 15, también fue menor. Curiosamente, el grado de disfunción endotelial estuvo claramente relacionado con con el control metabólico de la diabetes, estimado por los niveles de HbA1c. Así, cuando se consiguió un buen control metabólico, con valores de HbA1c cercanos a los de ratas no diabéticas, no hubo cambios en las respuestas vasodilatadoras. Esto coincide con datos previos obtenidos en vasos de ratas diabéticas por estreptozotocina tras ocho a doce semanas de tratamiento con insulina 16 o con transplante de islotes pancreáticos 7. En estos trabajos, la mejora de la función endotelial es posterior a la mejora del control metabólico, evaluado por los valores de HbA1c7, 16. Además, nuestros resultados sugieren la existencia de un umbral para el desarrollo de disfunción endotelial diabética. El grado de control metabólico desde el cual se manifiesta el daño endotelial se estableció en una HbA1c mayor de 7,5%; en este sentido, es interesante resaltar que, aunque la presión arterial media no se modificó entre los diferentes grupos de ratas diabéticas y no diabéticas, la presión de perfusión basal en el miembro inferior izquierdo se incrementó de forma significativa en aquellos animales diabéticos con niveles patológicos de HbA1c, lo que parece indicar un aumento de las resistencias vasculares periféricas. En conclusión, nuestros resultados indican que la disfunción endotelial asociada a la diabetes está estrechamente relacionada con el control metabólico de la enfermedad. Además, es posible establecer un umbral para el deterioro endotelial desde porcentajes de HbA1c superiores a 7,5%. 58 Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (SAF 96-0142 y 98-0010) y Bayer España, S.A. Agradecemos a Mª Carmen Fernández-Criado y a José M. Badajoz-Martínez por el cuidado de los animales. BIBLIOGRAFIA 1. Calver A, Collier J, Vallance P: Inhibition and stimulation of nitric oxide synthesis in the human forearm arterial bed of patients with insulin-dependent diabetes. J Clin Invest 90: 2548-2554, 1992. 2. Johnstone MT, Creager SJ, Scales KM, Cusco JA, Lee BK, Creager MA: Impaired endothelium-dependent vasodilation in patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Circulation 88: 2510-2516, 1993. 3. Fortes ZB, Leme JG, Scivoletto R: Vascular reactivity in diabetes mellitus: role of the endothelial cells. Br J Pharmacol 79: 771-781, 1983. 4. Durante W, Sen AK, Sunahara FA. 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