NEFROLOGIA. Vol. XV. Número 5. 1995 Regulación de la óxido nítrico sintetasa inducible glomerular M. Saura y S. Lamas Centro de Investigaciones Biológicas. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Introducción En los últimos años, el óxido nítrico (NO) ha sido identificado como un importante mensajero intercelular que regula una gran variedad de funciones en diversos tejidos. Es un mediador inusual, ya que es un gas extremadamente lábil cuya vida media es del orden de segundos. Esta molécula actúa como radical libre gracias a su electrón desapareado que le confiere la capacidad de ser altamente reactivo con otras moléculas. Nadie esperaba que esta sustancia pudiera ser importante en la biología. Hasta hace relativamente pocos años era considerado un constituyente más de la contaminación atmosférica. Sin embargo, a finales de los años 80 se describió la síntesis de NO2­/NO3­, productos de la oxidación del NO, por los mamíferos 1, 2 y se identificó al NO como el factor relajante derivado del endotelio 3, 4, abriéndose entonces un intenso campo de investigación en la comunicación entre células, ya que esta molécula, dada su naturaleza difusible, atraviesa libremente la membrana celular y actúa como mensajero inter e intracelular. La gran variedad de tipos celulares donde ha sido identificado, así como el gran número de reacciones controladas por el NO, ha incrementado el interés en el estudio de esta sustancia y ha hecho que se alcance un rápido progreso en la investigación acerca de este mediador. Síntesis y acciones del NO La principal acción del NO es la relajación de la musculatura para reflejar su activación por agentes inflamatorios como citoquinas y LPS. NOSi está aus e n t e en la mayoría de las células en condiciones normales. Su expresión es inducida en varios tipos celulares por señales procedentes del sistema inmune tales como citoquinas, produciendo grandes cantidades de NO durante períodos tan largos como cinco días. Dada la participación del NO en la fisiología y fisiopatología de tantos y variados sistemas de órganos hay un profundo interés en la regulación de la biosíntesis de NO desde el punto de vista fisiológico y f a r m a c o l ó g i c o . Una motivación para este interés, aunque no la única, es la evidencia de que la profunda hipotensión resultante de la administración de endotoxina bacteriana (LPS) o de factor de necrosis tumoral- (TNF-) podría depender de la inducción de NOSi5, 11. Debido a que la NOSc endotelial interviene en la regulación de la agregación plaquetaria y la regulación del tono vascular y la neuronal podría jugar también un importante papel fisiológico, muchos investigadores consideran que el mayor desafío es encontrar una manera de inhibir selectivamente NOSi. Regulación de la expresión de NOSi Existen tres razones fundamentales que obligan a pensar en un ingenioso mecanismo de regulación de la actividad de este enzima. Primero, la amplia distribución por todo el organismo de la isoforma inducible que ha sido demostrada hasta la fecha en macrófagos, neutrófilos, queratinocitos, astrocitos, hepatocitos, musculatura lisa, contribuyendo a la regulación del tono vascular. Sin embargo, el NO tiene otra serie de complejas funciones: actúa en la inhibición de la agregación plaquetaria, es un neurotransmisor en el sistema nervioso central y también interviene en reacciones de quimiotaxis y citotoxicidad 5. Por otra parte, en el momento actual se cree que cantidades anorm a l m e n t e elevadas de NO están involucradas en ciertas situaciones fisiopatológicas como la hipotensión que acompaña al shock séptico y la respuesta inflamatoria inducida por daño tisular. E l NO es el producto de la oxidación del grupo guanidinio de la L-arginina por un enzima denominado óxido nítrico sintetasa (NOS). Este enzima cataliza la oxidación de la L-arginina para convertirla en 411 Correspondencia: Dr. S. Lamas. Departamento de Estructura y Función de Proteínas. Centro de Investigaciones Biológicas/CSIC. Velázquez, 144. 28006 Madrid. M. SAURA y cols. citrulina, siendo el NO el coproducto de esta reacción 6. Hasta ahora han sido aisladas y caracterizadas tres NOS distintas que son producto de tres genes diferentes. Las tres isoformas varían en la localización celular, secuencia de aminoácidos, regulación y, por lo tanto, en sus papeles funcionales. Dos isoformas de NOS son dependientes de Ca2+ y de calmodulina exógena y se expresan de manera constit u t i v a . Una está localizada en el endotelio 7, 8 y la otra se expresa en neuronas periféricas y centrales mediando procesos como la vasodilatación y la neurotransmisión 9. Estas dos enzimas se denominan genéricamente NO sintetasa contitutiva (NOSc) y perm a n e c e n en reposo hasta que una elevación en el nivel de Ca2+ intracelular activa su unión a la calmod u l i n a y hace que se produzca NO durante varios minutos. La tercera forma es inducible y se denominó NOS inducible (NOSi) 10, células musculares lisas, endoteliales, epitelio, celélulas mesangiales, fibrob l a s t o s , células tumorales y miocitos cardíacos 5. Segundo, en todas estas celulas, la máxima inducción de NOSi depende de la combinación sinérgica de estímulos cuya eficacia varía según el tipo celular. A menudo la sinergia se produce entre el interferón g a m m a y un compuesto de la pared bacteriana, el lipopolisacárido (LPS) 12 o con TNF- 13, pero la lista de agentes que son capaces de inducir la NOSi se ha i n c r e m e n t a d o en los últimos años y ahora incluye sustancias como el ácido picolínico 14, ozono, agentes que aumentan el AMPc 15, luz ultravioleta y agentes microbianos que han perdido el LPS. Finalmente, N O S i está sujeta a supresión inmunológica, por ejemplo, por el factor transformante del crecimiento (TGF-) 16 o las interleuquinas 4 (IL-4) 17, 10 18 y 13 19, 20 . En la mayoría de los casos la producción de NO se relaciona con cambios similares en la abundancia del mRNA de NOSi, indicando que en su mayor parte la regulación de la NOSi se produce a nivel transc r i p c i o n a l , actuando bien directamente sobre la transcripción o sobre la estabilidad del mRNA. Debido a que, en general, la inducción de la expresión de NOSi refleja un incremento en la transcripción del gen se han intensificado los esfuerzos para clonar el gen e identificar los elementos del DNA involucrados en su regulación. Hasta el momento se han clonado los promotores del gen de la NOSi humana 21 y murina 22, 23. La inducibilidad de NOSi por d i v e r s o s estímulos indica que la regulación de su promotor debe ser muy compleja. En la región promotora de este gen, tanto en humanos como en ratón, se han detectado numerosas secuencias de DNA reguladoras a las que posiblemente se pueden unir diferentes factores de transcripción. Mediante el análisis computarizado de las secuencias se han podido identificar sitios para la unión de NF-B, AP-1, NF414 IL-6, elementos de respuesta a interferón y a TNF-. La capacidad de inducir la transcripción de la NOSi m u r i n a por LPS parece ser debida a una única sec u e n c i a NF-B situada entre los nucleótidos -85 y -76, en combinación con otras proteínas nucleares no identificadas hasta la fecha 22, 23. Sin embargo, la funcionalidad de muchos de estos posibles elementos reguladores en la región reguladora del promotor de la NOSi todavía no ha sido determinada. Aspectos funcionales de la expresión de NOSi La expresión de NOSi es el resultado de respuestas inflamatorias difusas o localizadas resultantes de la infección o daño tisular. Así, donde la respuesta inflamatoria es parte de una respuesta adaptativa, la expresión de NOSi es beneficiosa; cuando la expresión de NOSi es parte de una inflamación anormal, e s t a expresión puede ser perjudicial (ejemplo, enf e r m e d a d e s autoinmunes). Como aspectos beneficiosos puede destacarse que la expresión de NOSi resulta en la inhibición del crecimiento de patógenos desde microorganismos hasta virus 24. Y también parece proteger a los tejidos del daño en respuestas agudas inflamatorias sistémicas como la sepsis 25. La v a s o d i l a t a c i ó n resultante de la expresión de NOSi mejora la perfusión durante la sepsis, pero si ésta es excesiva la hipotensión resultante puede llegar a ser refractaria y, por tanto, letal. En el contexto de los órganos sólidos, la expresión de NOSi en endotoxem i a podría ser citoprotectora, ya que previene la f o r m a c i ó n de microtrombos inhibiendo la agregación plaquetaria y la lesión mediada por radicales del oxígeno 26. NOSi y riñón Varios autores han comenzado a localizar la NOS en el riñón 27. Existen datos publicados recientemente que indican que el NO tiene potentes efectos en la función renal, incluyendo modulación de las hemodinámicas renal y glomerular, secreción de renina, f e e d - b a c k túbulo-glomerular y excreción de sodio ( r e v i s a d a en ref. 28) . Este NO es importante manteniendo la tasa de filtración glomerular en condiciones basales y también en estados patológicos en los que está incrementada la producción de angiotensina I I 29. Además el NO puede inhibir la proliferación mesangial y así modular los efectos de las citoquinas y factores de crecimiento en la glomerulonefritis 30. A p e s a r de la creciente importancia que se asigna al NO en la función renal se conoce relativamente poco acerca de la expresión de NOSi a lo largo de la OXIDO NITRICO SINTETASA INDUCIBLE nefrona. Wilcox y colaboradores han demostrado la presencia de NOS en las células de la mácula densa 31. Se ha identificado NOSi en cultivos primarios de células del túbulo proximal y de túbulos colectores de la capa medular interna en rata 32. Morrissey y cols. demostraron recientemente la representación de NOSi en distintos tejidos del riñón, encontrándola en la capa medular externa y en glomérulos 33. Se ha demostrado que algunas citoquinas inflamatorias, como el TNF- 34, la IL-1 35 o productos de la pared microbiana como el LPS 36 son capaces de inducir la expresión de un tipo de NOS similar a la del m a c r ó f a g o en células mesangiales y que éstas son capaces de responder al NO por ellas liberado, incrementando los niveles de GMPc intracelular. Las células mesangiales glomerulares son un tipo especializado de células musculares lisas con propiedades comunes a los macrófagos, incluyendo la capacidad de sintetizar prostaglandinas, radicales libres d e l oxigeno, citoquinas y factores de crecimiento. Debido a su naturaleza contráctil son capaces de regular la tasa de filtración glomerular y el tráfico de macromoléculas a través del glomérulo. Estas células responden al NO derivado del endotelio con la formación de GMPc y la subsiguiente relajación 37. Nuestro grupo ha llevado a cabo estudios utilizand o LPS y TNF- y hemos comprobado que ambas sustancias se comportan de forma sinérgica para ind u c i r la NOS 13. Cuando analizamos el comportamiento de este enzima se observó que la inducibilid a d que presenta ante estos dos estímulos es dependiente del proceso de transcripción y de síntesis proteica. Es un hecho conocido que las células mesangiales son capaces de producir NO ante estímulos de tipo inmunológico, pero recientemente se h a descrito la inducción de la transcripción de la NOSi en estas células por sustancias no relacionadas, como la forskolina que actúa de forma sinérgica con la IL-1 38, o agentes capaces de aumentar los niveles de AMPc 39. El mecanismo por el que se produce la inducción es desconocido hasta el momento. La expresión de este enzima puede resultar autotóxica en determinadas situaciones. El exceso de formación de NO y de GMPc en células mesangiales no sólo bloq u e a la contractilidad de estas células 35, sino que puede contribuir al daño tisular observado en la patogénesis de ciertas formas de glomerulonefritis 40. Debido a la implicación del NO en la fisiopatología renal hay un creciente interés en conocer la regulación de la NOSi mesangial. En 1989, Pfeischifter y cols. describieron que la actividad de este enzima se podía inhibir con glucocorticoides 41, hecho que ya se había comprobado en macrófagos y, al igual que ocurre en éstos, también por el TGF- 16. Sin embargo, en estos trabajos no explican el mecanismo empleado por estas sustancias para inducir este efecto. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que un glucocorticoide, la dexametasona, es capaz de inhibir la transcripción de NOSi en células mesangiales de rata inducida por LPS+TNF- 13. Este fenómeno se p r o d u j o de forma dependiente de concentración y t i e m p o . La dexametasona es capaz de prevenir el efecto producido por la combinación del LPS+TNF-; sin embargo, el tratamiento con dexametasona no es capaz de revertir el efecto producido por la estimulación de la NOSi, lo cual podría ayudar a explicar el f r a c a s o terapéutico de los glucocorticoides en el shock séptico admitiendo, naturalmente, que el NO es un importante mediador implicado en las alteraciones hemodinámicas que en éste se producen 42. El mecanismo molecular que subyace en este proceso no ha sido aún establecido; los glucocorticoides podrían disminuir la estabilidad del RNA, disminuir la tasa de transcripción o interaccionar con otros factores de transcripción activadores inhibiendo su efecto. En células musculares lisas se ha descrito que la dexametasona es capaz de aumentar la estabilidad del mRNA y al mismo tiempo disminuir en un 30% la tasa de transcripción de NOSi 43, pero no existe hasta el momento ningún trabajo que señale un fenómeno semejante en células mesangiales. No se ha clonado el promotor de la NOSi de rata, de forma que no se c o n o c e si existe un elemento de respuesta a glucocorticoides. En el promotor murino no se ha detectado ningún elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) 22, 23, que constituye el mecanismo general de actuación sobre la expresión génica de estas drogas 44. Sin embargo, es posible que existan pequeñas pero significativas diferencias en el gen de rata que ayuden a explicar este fenómeno. E l control de la transcripción de este enzima en respuesta a citoquinas inflamatorias está siendo intensamente estudiado, y parece claro que están involucrados una serie de factores de transcripción comunes a muchos sistemas celulares, el más llamativo de los cuales es el NF-B. Se trata de un factor de transcripción multiproteico formado por dos subunidades, la p50 y la p65, que se encuentra de forma inactiva en el citoplasma acomplejado con una subunidad inhibitoria, el IB. Este factor es activado en respuesta a LPS, IL-1, TNF- y otros estímulos y juega un papel clave en el desarrollo de respuestas inmunes e inflamatorias 45. Otros grupos además del nuestro, han descrito la participación de este factor en la activación de la transcripción de NOSi en células mesangiales de rata 13, 39. Para ello se utilizó un inhibidor de su activación, el pirrolidin ditiocarbamato (PDTC). La activación del NF-B conlleva la disociación de la subunidad inhibitoria IB y la subsiguiente translocac i ó n al núcleo del factor donde se une al DNA; el PDTC es capaz de bloquear la liberación de IB con un mecanismo de acción relacionado probablemente 415 M. SAURA y cols. con su capacidad quelante de metales pesados y su actividad antioxidante 46. Esta sustancia produjo una inhibición dependiente de tiempo y dosis sobre la inducción de la NOSi observada en CMR estimuladas con LPS+TNF-. El PDTC añadido cuatro horas después de inducir el enzima es todavía capaz de inhibir s u expresión. También se ha demostrado que el PDTC es capaz de inhibir la expresión de NOSi inducida por IL-1 de forma dependiente de la dosis, pero no la inducida por AMPc 39. Esto indica que la activacion vía AMPc implica la actuación de otros factores de transcripción que bien, solos o en combinación con el NF-B, son capaces de activar la NOS inducible de la célula mesangial. Observaciones recientes concluyen que el NF-B es capaz de interaccionar de forma directa con el receptor de los glucocorticoides activado 47, 48. La significación biológica de este hecho todavía no ha sido bien estudiada, pero es posible que pueda ayudar a explicar el efecto inhibitorio de los glucocorticoides en la NOSi mesangial. Parece cada vez más claro que el NO liberado por las células mesangiales podría está implicado en determinadas enfermedades renales 40, 49, 50. En ratas con glomerulonefritis de Heyman, los glomérulos aisla­ dos producen cantidades importantes de N02 basalmente y después de la estimulación con LPS cuando se compara con glomérulos de animales control 49. Los autores de estos estudios atribuyen estos efectos a los macrófagos infiltrados, pero es posible, en virtud de lo antes expuesto, que las células mesangiales estén realizando una contribución sustancial a este fenómeno, sin descartar la participación de las otras estirpes celulares componentes del glomérulo, como son las células endoteliales 51 y las epiteliales 32. Así, n o s o t r o s hemos observado, utilizando glomérulos a i s l a d o s que la combinación de LPS+IFN- y L P S + T N F - e s capaz de inducir la expresión de la NOSi, y también demostramos el efecto inhibitorio de la dexametasona y del PDTC en esta estructura, donde los resultados son más fácilmente extrapolables a lo que podría suceder in vivo 13. Esto sugiere una potencial vía de actuación en la disfunción renal que ocurre en la sepsis. En trabajos recientes se ha investigado el papel del NO producido en la enfermedad glomerular inducida por endotoxina. De estos estudios se desprende que el LPS puede estimular endógenamente la producción de NO in vivo de forma sistémica y dentro del glomérulo y que ejerce un papel protector en la trombosis glomerular ayudando a mantener la perfusión del órgano en situaciones en las cuales ésta se ve comprometida 26. Conclusión En resumen, las células mesangiales pueden producir NO en respuesta a variados estímulos. Las cé416 M. SAURA y cols. lulas endoteliales glomerulares y los macrófagos infiltrados, y posiblemente las células epiteliales, podrían s e r una fuente adicional de NO en el glomérulo. Además, la endotoxina o citoquinas circulantes podrían actúar directamente en la célula mesangial para estimular la producción de NO. Así, el NO producido por las células mesangiales glomerulares podría tener un número importante de acciones dentro del glomérulo, y por ende, regular asimismo la función tubular. Se necesitarán estudios adicionales para determinar si el NO está implicado en otras patologías glomerulares y para explorar la posibilidad de manipulación terapéutica de la NOSi glomerular. Esto sólo se conseguirá cuando se conozca y comprenda la compleja regulación a la que el gen que codifica la NOSi está sometido. Bibliografía 1. S t u e h r DJ y Marletta MA: Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci USA 82:7738-7742, 1985. 2. M a r l e t t a MA, Yoon PS, Iyengar R, Leaf CD y Wishnok JS: Macrophage oxidation of L-Arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. The American Chemical Society 27:8706-8711, 1988. 3. I g n a r r o LJ, Buga GM, Wood RS, Byrns RE y Chaudhuri G: Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 84:9265-9269, 1987. 4. 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