NEFROLOGIA. Vol. XVI. Suplemento 3. 1996 Factores que desencadenan glomerulosclerosis después de la reducción de la masa renal O. Flores, M. Mac Laughlin, B. Gallego y J. M. López-Novoa Instituto de Investigación Nefrológica Reina Sofía. Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Salamanca. INTRODUCCION Después de una extensa reducción de la masa renal, las nefronas remanentes realizan una adaptación bioquímica, morfológica y funcional que les permite conservar la homeostasis del medio interno. Se han realizados muchos e interesantes estudios con el intento de reconocer cuál es, dentro de los mecanismos adaptativos, el determinante del desarrollo de glomerulosclerosis (GSC). La GSC es el proceso de sustitución total o parcial del ovillo glomerular por material hialino fibroso con la consecuente pérdida de la capacidad de filtración. La masa renal remanente sufre unos mecanismos c o m p e n s a d o r e s como son hiperfunción, hipertensión glomerular e hipertrofia; todos ellos contribuyen al daño glomerular. Fundamentalmente el tema se centra en la distinción entre hipertensión glomerular e hipertrofia como causas determinantes de este deterioro. La hipertensión glomerular y la hiperf u n c i ó n van a aumentar el normal tránsito de macromoléculas por el mesangio dañando el glomérulo. La hipertrofia, por su parte, puede llevar a la esclerosis glomerular sea por el efecto de las citoq u i n a s o factores de crecimiento liberados por el glomérulo hipertrofiado o directamente por las modificaciones biofísicas a nivel de la pared de los capilares glomerulares (fig. 1). ¿HIPERTENSION INTRAGLOMERULAR O HIPERTROFIA? Bidani y cols. (1990) 1, teniendo en cuenta que trabajos previos sugerían que el aumento de presión cap i l a r glomerular es el mecanismo desencadenante del daño glomerular 2, 3, se propusieron distinguir entre los efectos sistémicos e intraglomerulares del inc r e m e n t o de presión sobre el desarrollo de GSC. P a r a ello trabajaron con ratas Wistar Kyoto (WKY) c o n reducción de 5/6 de la masa renal. Estas ratas presentan la particularidad de ser genéticamente resistentes al desarrollo de hipertensión. De esta manera este modelo les permite distinguir las contribuciones independientes de la hipertensión sistémica y de la hiperfiltración glomerular y/o hipertrofia sobre el daño glomerular. Las ratas normotensas con disminución de la masa renal presentaban a las seis semanas un incremento de la filtración glomerular por nefrona (FGN), la presión en el capilar glomerular (Pcg) estab a sólo ligeramente incrementada (5 mmHg) y la presión arterial sistémica no se modificaba. La masa renal remanente en estas ratas presentaba una hipertrofia e hiperfiltración glomerular comparable a la observada en otras cepas de ratas 5/6 nefrectomizadas 4, 5. Los datos demuestran que los cambios adaptativos (hiperfiltración e hipertrofia) no son necesariamente perjudiciales cuando ocurren en ausencia de hipertensión sistémica. Ya que el incremento de Pcg fue pequeño, se puede atribuir a esto la ausencia de GSC. Los autores concluyen que mientras no se desarrolle hipertensión sistémica, la hiperfiltración y la hipertrofia glomerular no llevan a daño glomerular. Si todo este proceso se desencadena sólo en presencia de hipertensión sistémica parecería entonces que el fallo está en el mecanismo autorregulatorio. Este permite, por vasoconstricción de la arteriola aferente, que los cambios en la presión arterial sistémica no se trasladen al capilar glomerular. En este sentido, el incremento marcado en la Pcg en el modelo de reducción de la masa renal se ha atribuido a un Correspondencia: Dr. J. M. López-Novoa. Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Salamanca. Edificio Departamental. Campus Miguel de Unamuno. Avda. Campo Charro, s/n. 37007 Salamanca. España. 14 REDUCCION DE LA MASA RENAL Y GLOMERULOSCLEROSIS REDUCCION MASA RENAL Mecanismos adaptativos Hipertensión Mecanismos biofísicos Hiperfunción Factores de crecimiento Hipertrofia GLOMERULOSCLEROSIS Fig. 1.--Mecanismos generales implicados en el desarrollo de glomerulosclerosis después de una reducción de la masa renal. fallo en el mecanismo autorregulatorio 2, 6, 7-11. En el modelo de ratas SHR (ratas espontáneamente hipertensas) se ha comprobado que no se desarrolla esclerosis glomerular a pesar de la hipertensión sistémica. Precisamente en este modelo se conserva intacto el mecanismo autorregulador, de tal forma que la vasoconstricción aferente impide el traslado de la presión arterial sistémica al capilar glomerular, que se mantiene así dentro de límites normales. La relación entre el incremento de la presión capilar glomerular y el daño renal se estudió también en un modelo de hipertensión sistémica conseguida colocando un clip en la arteria renal y retirando 2/3 de la masa renal del riñón contralateral 12. Se compararon con: a) ratas sin riñón clipado, y b) ratas normales. Dos meses después de la cirugía las ratas con riñ ó n clipado presentaban una presión arterial s i g n i f i c a t i v a m e n t e aumentada, alrededor de 170 mmHg. El FGN estaba incrementado en los dos grupos con reducción de la masa renal en niveles semejantes. Sin embargo, sólo el grupo con hipertensión sistémica (riñón clipado) presentaba incremento de Pcg. Observaciones histológicas en las ratas con riñón contralateral no clipado demostraron un aumento significativo del volumen glomerular sin evidencia de daño, mientras que en el grupo hipertenso el volumen glomerular estaba más aumentado y al mismo tiempo se presentaban marcados cambios histológicos. Los resultados demuestran nuevamente que la hiperfunción glomerular no daña el glomérulo si no está acompañada de incrementos en la Pcg. El factor crítico, según estos autores, es el incremento de Pcg. El defecto en la vasoconstricción aferente en respuest a a la hipertensión sistémica continúa siendo la constante que asocia la hipertensión sistémica al daño glomerular 13-15. Sin embargo, otros estudios consideran más importante la hipertrofia compensatoria que la hipertensión intraglomerular como principal determinante del daño glomerular y de la esclerosis 16, 17. Yoshida y cols. (1989) 18 investigaron la posible relación causa-efecto e n t r e la hiperfunción, la hipertrofia y la esclerosis glomerular. Estudiaron para ello las secuencias morfólogicas y funcionales de la reducción de 2/3 de la masa del riñón izquierdo junto con diversión ureteral (DU) o extracción del riñón derecho (5/6 N). Como control utilizaron ratas en las cuales el riñón derecho permaneció intacto. A las cuatro semanas observaron el mismo grado de hiperfunción glomerular con pron u n c i a d o s incrementos de Pcg (15 mmHg) en los g r u p o s DU y 5/6N; sin embargo, sólo en el último g r u p o se desarrollaba hipertrofia glomerular. Consecuentemente este grupo presentaba una marcada GSC que no se presentaba en el grupo DU, en el cual no se observaba hipertrofia, aunque sí hiperfunción. Por lo tanto, no había asociación entre hiperfunción glomerular y GSC, mientras que sí la había entre hipertrofia y GSC. En otras palabras, estos autores concluyeron que la GSC estaba asociada a hipertrofia y no a hiperfunción. Con todo lo anteriormente expuesto puede deducirse que tanto la hipertensión glomerular como la hipertrofia son los procesos claves que van a conducir a GSC actuando de forma sinérgica por los mecanismos que se detallarán más adelante. Sin embargo, existen otros fenómenos que de forma paralela van a contribuir al daño glomerular; es el caso de la hiperf u n c i ó n , que aislada no va a provocar GSC 1 . Cambios en la hemodinamia glomerular, como el aumento del flujo sanguíneo renal, incrementan el proceso denominado shear stress o, lo que es lo mismo, un aumento del fenómeno de fricción sobre las célul a s endoteliales y mesangiales por parte del fluido con el cual están en contacto. Hsied y cols. (1991) 19 demostraron que el shear stress induce en las células endoteliales la expresión de genes de factores de crecimiento, sustancias directamente implicadas en el desencadenamiento de GSC. Además este aumento del FSR debido a la hiperfunción, junto con el aumento de la Pcg, van a aumentar el habitual tránsito de macromoléculas a través del mesangio 20. El mesangio glomerular juega un papel importante en la regulación fisiológica de la microcirculación glomerular. Existen evidencias de que un flujo plasmático que acarrea macromoléculas circula a través del mesangio. Cambios en los determinantes de la hemodinamia glomerular y en la liberación y/o producción de sustancias vasoactivas, part i c u l a r m e n t e la angiotensina II (Ang II), pueden influenciar grandemente el movimiento mesangial de 15 O. FLORES y cols. macromoléculas. Cambios cuali o cuantitativos en este movimiento pueden llevar a daño mesangial. Se h a n propuesto tres mecanismos para relacionar el tránsito de macromoléculas en el mesangio con el daño glomerular progresivo que lleva a GSC: 1) aumento del movimiento de macromoléculas; 2) persist e n c i a de moléculas atrapadas en el mesangio; 3) cambios en el flujo y presión glomerular que pueden inducir cambios en el movimiento de macromoléculas. Raij y Keane (1985) 21 definieron una rama aferente y otra eferente en el mesangio, para diferenciar la captación mesangial de macromoléculas y la pérdida de las mismas, respectivamente 22. No obstante, dada la inmediatez de ambos procesos, es imposible s e p a r a r l o s en la práctica. Factores capaces de influenciar la rama aferente incluyen los niveles sang u í n e o s de macromoléculas, el estado del sistema mononuclear fagocítico y las características de las macromoléculas: tamaño, tipo, digestibilidad y carga. Factores hemodinámicos y sustancias vasoactivas capaces de inducir cambios en la microcirculación glomerular pueden influenciar la rama eferente del mesangio, como lo sugieren experimentos que estudiaron la relación entre hemodinamia renal y procesamiento mesangial de macromoléculas 22-25, y de est a forma aumentar el tránsito o la permanencia de macromoléculas en el mesangio, provocando un daño en el glomérulo (fig. 2). A d e m á s se ha postulado otro mecanismo por el cual el aumento de la Pcg daña el glomérulo en el trabajo realizado por Shankland y cols. en 1994 26. En él demuestran que ratas SHR uninefrectomizadas con elevación de la Pcg muestran un aumento en la expresión de los genes de diferentes factores de crec i m i e n t o como factor de crecimiento derivado de p l a q u e t a s , PDGF y factor de crecimiento transformante , TGF-, implicados directamente en fenómenos que desarrollan GSC, como son proliferación celular y síntesis de matriz mesangial; un tratamiento Tránsito de macromoléculas farmacológico que revierte el aumento de la Pcg logra suprimir la expresión de estos genes y así el desarrollo de GSC. AUMENTO DE LA TENSION GLOMERULAR. FACTORES BIOFISICOS E l aumento de la tensión en la pared del capilar glomerular como consecuencia de la hipertrofia ha sido también considerado un efecto perjudicial para el glomérulo 27, 28. La ley de Laplace relaciona la tensión circunferencial en la pared del vaso (T) con la presión transmural (P) (diferencia entre la presión interna y la externa sobre la pared del vaso) y el radio r. Según esta ley, la T es directamente propocional al radio, siendo P el factor de proporcionalidad (T = P. r). La representación gráfica de T en función de r es una línea recta que pasa por el origen. Cuanto mayor es la presión, mayor es la pendiente. En el caso particular de un vaso sanguíneo, si éste fuera un cilindro distensible, el aumento de presión determinaría el del radio y, consecuentemente, el de la tensión en la pared. La representación gráfica sería u n a línea recta como la que describimos anteriormente. En la práctica, la relación no es lineal, sino curvilínea, debido a la heterogeneidad de la pared del vaso sanguíneo. Esta está formada por fibras elásticas y colágenas (más rígidas que las anteriores) y células musculares lisas. A pequeñas presiones y pequeño radio, las fibras elásticas están en tensión, no así las colágenas. A medida que aumenta la presión y, en consecuencia, el radio, aumenta la tensión. En este caso, un conjunto mayor de fibras colágenas se verá sometido a tensión y la rigidez de la pared aumenta. En otras palabras, el vaso se hace menos distensible (es necesario un mayor incremento de P para obtener el mismo incremento de V). De acuerdo a lo anteriormente expresado, el capilar glomerular hipertrofiado tendrá la tensión de su pared aumentada por el aumento del diámetro del vaso. Por lo tanto, el capilar es más sensible a los efectos de aumentos en la Pcg. Cuando el capilar glomerular se hipertrofia, el estiramiento del glomérulo y de la célula mesangial resultan de la interacción entre el nivel de distensibilidad y de la tensión de la pared capilar, dependiendo de Pcg y r. El glomérulo hipertrofiado posee una dist e n s i b i l i d a d anormalmente disminuida (endurecimiento por estiramiento de fibras colágenas) y, aun cuando los niveles de Pcg se mantengan dentro de l o s límites normales, se puede presentar un efecto mecánico significativo por el aumento de la tensión. Por todo esto se ha sugerido que el incremento de la tensión en la pared glomerular representa la vía final común por la cual la hipertensión intraglomerular y/o Inflamación Daño mesangial Persistencia de macromoléculas atrapadas en el mesangio Alteració de los flujos y presiones glomerulares GLOMERULOSCLEROSIS Fig. 2.--Relación entre el tránsito de macromoléculas a través de mesangio y el daño glomerular. 16 REDUCCION DE LA MASA RENAL Y GLOMERULOSCLEROSIS Hipertensión intraglomerular. Hipertrofia Hipertensión Pérdida de nefronas Tensión en la pared glomerular Esclerosis glomerular Crecimiento celular Proliferación Fig. 3.--Proceso en cadena que relaciona la pérdida de nefronas con el aumento de tensión en la pared del vaso y los fenómenos implicados en el desarrollo de la esclerosis glomerular. la hipertrofia resulta en daño glomerular y esclerosis. La tensión en el capilar glomerular, más que la presión intraglomerular, sería el mecanismo patogénico que induciría el daño glomerular. La hiperfiltración y la hipertrofia sólo contribuirían a aumentar la vulnerabilidad de las nefronas remanentes (fig. 3). En conclusión, es el aumento de la tensión en la pared del vaso glomerular el desencadenante de los fenómenos que provocan la GSC, que se caracteriza por una excesiva proliferación celular y un acúmulo de matriz mesangial que incluso llega a obturar la luz del capilar, evitando así la filtración glomerular. Queda por explicar, sin embargo, el mecanismo por el cual los cambios en la tensión de la pared producirían una activación de las células glomerulares, provocando proliferación y una excesiva formación de matriz mesangial, o, en otras palabras, cómo es d e t e c t a d o el estiramiento y transformado en señal metabólica. El estiramiento de las células musculares lisas induce un incremento en el Ca2+ intracelular debido primariamente al influjo de Ca2+ extracelular y secundariamente a su liberación de los depósitos intracelulares 29. En general, el aumento de Ca2+ en el interior celular se debe: 1. Estimulación que provoca la apertura de: 1.1) canales de Ca2+ activados por el estiramiento (activados por una distensión mecánica o por un aumento de la presión intravascular y, por consiguiente, un aumento de la tensión según la ley de Laplace). Son insensibles a los antagonistas de Ca2+, y/o 1.2) canales transmembrana de Ca2+ dependientes de voltaje (CDV, activados por despolarización) que aumentan l a permeabilidad de la membrana para los iones Ca2+, permitiendo que el ión entre a la célula a favor de un gradiente de concentración. Existen en el músculo liso dos tipos de CDV: 1.2.1) canales T (transitor i o s o de tránsito) activados por despolarizaciones débiles, que se inactivan rápidamente. Son insensibles a los antagonistas de Ca2+; 1.2.2) canales L (larga duración) se abren por grandes despolarizaciones y tardan más tiempo en inactivarse que los canales T. Son los mayoritarios y los más importantes desde el punto de vista funcional, siendo el blanco de los moduladores de los canales de Ca2+. 2. Activación de un receptor por el agonista fisiológico correspondiente: 2.1) Acoplado a fosfolipasa C (PLC), que cataliza la rotura del fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP2) en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 actúa como segundo mensajero intracelular promoviendo la liberación de Ca2+ del retículo endoplásmico y pudiendo de esta forma incrementar la concentración de Ca2+ libre citosólico desde 0,1 µM a 1 µM. A partir de una cierta concentración el Ca2+ citosólico se une a la calmodulina y a otras proteínas citoplasmáticas, creando complejos q u e activan ciertas fosfoquinasas dependientes de Ca2+, capaces de fosforilar proteínas. El DAG también i n d u c e fosforilación de proteínas, por ejemplo aumentando la sensibilidad de la maquinaria contráctil al Ca2+ y la modulación de algunos de los mecanismos que se encargan de regular el pH intracelular. De esta forma éste se incremente hasta un valor de 8, que es el pH óptimo para la interacción del IP3 con sus receptores del retículo sarcoplasmático. Por otro lado, el DAG es capaz de activar una PKC, la cual puede fosforilar proteínas en los canales de Ca2+, provocando su apertura. A su vez, la PKC activada puede fosforilar otras proteínas tanto de membrana como intracelulares, modificando de alguna forma múltip l e s procesos celulares. 2.2) No acoplado a PLC: produce un influjo de Ca2+ que activa directamente la apertura de canales de Ca2+ operados por receptor. La presión en el capilar glomerular es mucho mayor que la de cualquier otro capilar del organismo y ésta además está aumentada en la reducción de 5/6 de la masa renal 30. Las células mesangiales están sometidas a los cambios en Pcg que normalmente se producen después de la reducción de la masa renal, p o r estar ubicadas en forma contigua a las células endoteliales del capilar glomerular. Células mesangiales en cultivo 31, cuando se someten a procesos de estiramiento-relajación y en ausencia de factores de crecimiento, aumentan la síntesis de proteínas (colágenas y no colágenas) y se induce proliferación celular, sugiriendo que el «stretch» físico puede por sí sol o alterar la morfología y función de la célula mesangial in vivo. Este proceso de estiramiento-relajación causa, a su vez, un aumento de la expresión 17 O. FLORES y cols. de los genes de respuesta rápida c-fos y zif 268/egr-1, siendo el aumento máximo dentro de los 30 minutos. Esta inducción de genes es precedida por una translocación de PKC desde el citoplasma a la membrana y por un aumento del influjo de 45Ca. Este efecto se inhibe por bloqueo de la PKC, mientras que una inhibición menor se observaba cuando se disminuye el influjo de calcio. La activación de genes de respuesta rápida da lugar a proteínas que actúan como factores de transcripción, que son capaces de unirse a sitios específicos del DNA y activar la proliferación. Queda entonces por explicar cómo los cambios en los valores de Ca2+ intracelular alteran la formación de matriz mesangial. Este proceso podría involucrar la acción de mediadores autocrinos o paracrinos, y uno de los posibles es el TGF-. Este es un potente estimulador de la síntesis de proteínas de la matriz p o r células mesangiales en cultivo 3 2 y es también producido por ellas 33. Cuando las células mesangiales en cultivo se estiran se produce la liberación de TGF- 34. Estos resultados sugieren que el TGF- se regula hacia arriba (up) en respuesta al estiramiento y puede actuar como un factor autocrino para aumentar la síntesis de matriz extracelular por las células mesangiales. Además disminuye la degradación de la matriz extracelular 35, estimulando aún más su acumulación. Fig. 4.--Efectos de algunas sustancias activas sobre la morfología y metabolismo de las células glomerulares. LIBERACION DE FACTORES DE CRECIMIENTO La simultaneidad de la hipertrofia y de la esclerosis glomerular sugiere además que citoquinas locales o circulantes u otras sustancias promotoras del crecimiento contribuirían a la hipertrofia glomerular y por e s t i m u l a c i ó n de la formación de matriz mesangial llevarían a una acumulación de la misma típíca de la GSC 36 (fig. 4). De esta forma muchos autores han encontrado aumentados determinados factores de crecimiento (FC), así como el número de sus receptores específicos dentro del glomérulo en este modelo experimental y que sucede al poco tiempo de la ablación renal 37-39. Como ya hemos visto, en el modelo de 5/6 de reducción de la masa renal varios son los estímulos que van a provocar aumento de la expresión de FC, como son el shear stress provocado por aumento del FSR 19 y el estiramiento de las células glomerulares 26. Distintos factores de crecimiento, como el PDGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), y hormonas vasoactivas, como la AgII o la endotelina, estimulan a través de la interacción con sus receptores específicos el rápido recambio de los fosfoinositoles de la membrana celular, llevando al incremento del calcio intracelu18 lar que actúa como segundo mensajero. Esta estimulación se produce por la unión a dos tipos de receptores: el ligado a proteínas G y el receptor tirosina q u i n a s a . De esta manera estimulan la PLC, cuyo m e n s a j e r o intracelular es el calcio, como ya se ha visto. La proliferación de células de mamíferos es inducida por FC, dependiendo de la concentración de Ca2+ extracelular 40. Estudios realizados in vitro en células mesangiales en cultivo han mostrado que el PDGF y la trombina son capaces ambos de estimular la síntesis de DNA y la división celular a través de la activación de dos enzimas dependientes de la concentración de Ca2+ extracelular: PLC y PKC 41, 42. Receptores dependientes de Ca2+ jugarían un importante papel mediando el efecto mitogénico de estas hormonas, ya que estimulan la síntesis de DNA en una forma dependiente del influjo de Ca2+ a la célula 43-45. A este respecto, recientemente Doi y cols. (1988) 46 observaron que ratas transgénicas en las cuales la hormona d e crecimiento o determinados FC están excesivamente expresados mueren a edad temprana debido al desarrollo de insuficiencia renal. El estudio histológico reveló que estos glomérulos se caracterizaban por hipertrofia, proliferación mesangial y esclerosis. Los autores proponen que hormonas circulantes o locales capaces de provocar el crecimiento de las células glomerulares juegan un papel fundamental en delinear el círculo vicioso que lleva a la enfermedad renal terminal. En estas condiciones de aumento de factores de crecimiento se estimula tanto la síntesis de matriz extracelular como la proliferación celular; como ya se ha dicho, el PDGF, a través de la activación de la PLC y la PKC, activa la división celular mediante la expres i ó n de genes de respuesta rápida, lo que produce una proliferación exagerada de las células glomerulares, sobre todo las mesangiales. Estas, a su vez, son REDUCCION DE LA MASA RENAL Y GLOMERULOSCLEROSIS Fig. 5.--Implicación del TGF- en el círculo vicioso que lleva a glomerulosclerosis por deposición excesiva de matriz mesangial (tomado de la referencia 50). estimuladas por parte de FC como el TGF- provocando el aumento de la síntesis de la matriz extracelular. El TGF- además de producir el aumento de la matriz extracelular, bloquea la degradación de la misma, disminuyendo la expresión de colagenasa 47, aumentando los niveles de inhibidores de proteasas y disminuyendo la secreción de las mismas como el activador del plasminógeno 48 que degradan proteínas de la matriz extracelular. Por lo tanto, además de servir como un factor autocrino para la rápida reparación del daño tisular, el TGF- puede ser responsable del daño glomerular. En condiciones normales, cuando el proceso de reparación termina, se inhibe la producción de TGF- y de matriz mesangial por mecanismos hasta ahora desconocidos 49. Sin embargo, en e n f e r m e d a d e s glomerulares existe un fallo en este proceso de regulación que lleva a una producción acelerada de TGF-. Se crea así un círculo vicioso que lleva a la producción de más matriz mesangial 50 (fig. 5). Cuando la matriz en exceso obtura el capilar glomerular aparece una lesión típicamente esclerótica (fig. 3). Resumiendo, los fenómenos que ocurren después de la reducción de la masa renal y que al final van a provocar GSC son muy numerosos y complejos (figura 6), siendo fundamentalmente el aumento de tens i ó n en la pared del capilar glomerular producido por la hipertensión intraglomerular y la hipertrofia de forma sinérgica el mecanismo desencadenante de la patología glomerular. 19 O. FLORES y cols. Fig. 6.--Cuadro explicativo de los procesos más característicos y la relación entre ellos, destacando el aumento de tensión como factor desencadenante de la patología glomerular. Bibliografía 1. Bidani AN, Mitchell KD, Schwartz MM, Navar G y Lewis EJ: Absence of glomerular injury of nephron loss in a normotensive rat remnant kidney model. Kidney Int 38:28-38, 1990. 2. Olson JL y Heptinstall RH: Non inmunologic mechanisms of glomerular injury. Lab Invest 59:564-578, 1988. 3. Brenner BM: Nephron adaptation to renal injury or ablation. Am J Physiol 249:F324-F337, 1985. 4. 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