NEFROLOGIA. Vol. XVI. Suplemento 3. 1996 Citoquinas profibrogénicas y angiotensina II en la patogenia de la esclerosis renal J. Egido, M. Ruiz Ortega, C. Bustos, D. Gómez Garre, S. González, C. Gómez Guerrero, M. J. López Armada y A. Ortiz Servicio de Nefrología. Fundación Jiménez Díaz. Universidad Autónoma. Madrid. INTRODUCCION En condiciones normales, los tejidos se encuentran en un estado quiescente con un mínimo reemplazamiento celular. Muchas formas de agresión, desde la inflamación a cambios físicos o metabólicos, pueden pertubar el sistema y activar una cascada de reacciones que pueden conducir a la formación excesiva de tejido conectivo 1, 2. En los vertebrados inferiores, que son capaces de regenerar los tejidos dañados incluyendo miembros y órganos, la destrucción tisular conduce a una serie de reacciones secuenciales que comienzan con la desdiferenciación de células maduras, migración al sitio del daño tisular, proliferación y diferenciación de las células encargadas de regenerar el tejido en particular. Este proceso suele durar, en ocasiones, varios meses. En los organismos superiores, los procesos reparativos son más rápidos y simples, y la regeneración funcional está a menudo ausente. La sec u e n c i a reparativa comienza con una rápida infiltración de neutrofilos, seguida de un influjo de m a c r ó f a g o s y, posteriormente, de linfocitos. Esto m a r c a el inicio de inflamación crónica, que es de mayor duración y en la cual también participan las células residentes 1, 2. En el glomérulo, las células implicadas en el acúmulo de matriz son fundamentalmente las mesangiales y las células epiteliales. Estudios de inmunofluor e s c e n c i a han demonstrado que los mayores constituyentes de la matriz mesangial son los colágenos tipo IV y V, las glicoproteínas laminina y fibronectina y los proteoglicanos heparan sulfato (perlec a n y condroitin/dermatan sulfatos) (versican, decorina y biglicanos), todos ellos sintetizados por células mesangiales en cultivo. En algunas condiciones de cultivo, y en situaciones patológicas, las células mesangiales también sintetizan cantidades relativamente grandes de colágenos intersticiales (tipos I y III). A nivel intersticial, las células más importantes en los procesos reparativos y de progresión son los fibroblastos 3, 4. Aunque los mecanismos precisos que conducen a la expansión de la matriz y fibrosis a nivel glomerular e intersticial no son aún bien conocidos, diversos datos sugieren que las citoquinas, los factores de crecimiento y las hormonas vasoactivas pueden jugar un papel importante (tabla I). CITOQUINAS Y FIBROSIS RENAL Las citoquinas son mediadores polipeptídicos segregados por una variedad amplia de células, que se unen a receptores específicos de numerosas células (pleitropismo) y modifican su conducta de una manera autocrina, paracrina o endocrina 5. Las citoquinas pueden ser producidas a nivel renal por las células de sangre periférica que invaden el órgano, así como por las células intrínsecas glomerulares (célul a s endoteliales, mesangiales y epiteliales) y tubulointersticiales (células epiteliales, tubulares y fibroblastos) 6-8. En los últimos años existe un amplio número de publicaciones demostrando la participación de las citoquinas en el daño renal in vivo 6-8. La expresión de los genes y la síntesis de diversas citoquinas se ha demostrado en glomérulos aislados y en biopsias renales. La inyección sistémica de algunas citoquinas causa daño glomerular y modula las manifestaciones de glomerulonefritis experimentales. In vitro, las citoquinas modifican la conducta de diversas células renales. Además, la producción glomerular de citoquin a s se ha relacionado con la severidad de la enfermedad renal. El tratamiento con fármacos que modifican las lesiones renales se asocia con una disminución en los niveles de citoquinas glomerulares y Correspondencia: Jesús Egido. Servicio de Nefrología. Fundación Jiménez Díaz. Avda. Reyes Católicos, 2. 28040 Madrid. 22 CITOQUINAS Y FIBROSIS RENAL Tabla I. C i t o q u i n a s , sustancias vasoactivas y producción de matriz extracelular · Citoquinas profibrogénicas: IL-1, IL-1, TNF-, PDGF, FGF y TGF- · Sustancias vasoactivas: Ang II, ET-1, TxB2 y PAF. Otras citoquinas proinflamatorias, como la IL-6, IL-8, MCP-1, IP-10 y otras, pueden particiar también en el incremento de matriz extracelular a través del reclutamiento de células mononucleares en el tejido dañado. tubulointersticiales. En algunos casos, un efecto protector de diversas estrategias anticitoquinas ha sido demostrado 6, 7. Aunque el listado de citoquinas implicadas en la patogenia renal es importante: factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), factor de crecimiento derivado de plaquetas ( P D G F ) y factor transformante del crecimiento (TGF), entre otros, en esta revisión solamente nos centraremos en aquellos en los que existe una evidencia más firme. TNF Y DAÑO RENAL Tras la exposición al lipopolisacárido bacteriano (LPS), diversas células renales expresan y sintetizan TNF. El TNF, a su vez, ejerce una amplia variedad de reacciones proinflamatorias sobre células glomerulares, así como sobre células epiteliales tubulares, incluyendo cítotoxicidad/apoptosis y síntesis de otras citoquinas, mediadores lipídicos, enzimas proteolític o s , matriz extracelular y radicales de oxígeno. Además, el TNF activa el endotelio, favoreciendo el influjo de leucocitos al tejido dañado 9-12. La participación del TNF en los mecanismos del daño glomerular en diversas enfermedades renales experimentales ha sido bien demostrado en los últimos años. Los glomérulos aislados de ratas con nefritis nefrotóxica, nefritis crónica inmune y nefrosis por puromicina y adriamicina expresan y producen más TNF que los animales controles. En general, la mayor síntesis glomerular de esta citoquina coincidió con el pico de proteinuria y lesiones morfológicas ren a l e s 9-13. En algunos de estos modelos también se observó una excreción urinaria elevada de TNF 15. Los estudios en patología humana son más escasos. Una expresión aumentada del TNF mRNA ha sido observada en pacientes con glomerulonefritis rápidamente progresiva. Una atención particular merecen los estudios de TNF y nefropatía de cambios mínimos y sus variantes 14-16. Los mecanismos de proteinuria en estas enfermedades no están completamente definidos, aun- que desde hace varios años se ha especulado que un factor circulante podría dañar la célula epitelial glomerular. En estudios in vitro hemos observado que la a d r i a m i c i n a y la puromicina, fármacos empleados para inducir nefrosis experimental, inducen citotoxicidad en células epiteliales glomerulares, que disminuyó en presencia de anticuerpos anti-TNF 14. In vivo, la máxima producción glomerular de TNF y su excreción urinaria en ambos modelos coincidió con la mayor proteinuria. La administración de ciclosporina o una dieta hipoproteica, que disminuyen el daño renal, indujeron simultáneamente una disminución en la producción glomerular y en la eliminación urinaria de esta citoquina 15, 16. Nuestro grupo ha demostrado que las células mononucleares de niños con nefrosis activa expresan y producen cantidades mayores de TNF que los niños controles 17. Además, los pacientes en remisión y/o tratados con ciclosporina o esteroides, o ambos, tenían bajos niveles de producción de TNF. En un grupo de pacientes estudiados de manera seriada, la máxima producción de TNF coincidió con la recaída de la enfermedad 17. In vitro, el TNF disminuye la producción de proteoglicanos por células epiteliales glomerulares 15. Puesto que la pérdida de estas sustancias a nivel glomerular es, en parte, responsable d e la disminución de la electronegatividad de la membrana basal glomerular, esta citoquina podría ser una de las responsables del daño renal en la nefrosis experimental y humana. La ciclosporina incrementó la producción de proteoglicanos, sugiriendo un nuevo mecanismo de acción de este fármaco en el tratamiento de esta enfermedad 15. TGF Y FIBROSIS Entre los diversos factores de crecimiento, el TGFß tiene un papel clave en la regulación del turnover de la matriz extracelular 18. El TGFß-1 estimula la síntesis de matriz proteica (fibronectina, colágenos y laminina) e inhibe la liberación de matriz, incrementando la actividad de los inhibidores de proteasas y disminuyendo la síntesis de proteasas. Además, estimula la síntesis de receptores de matriz proteica tales como las integrinas 18. El TGFß es también un factor atractante de fibroblastos y estimula la proliferación de estas células. Datos recientes, obtenidos fundamentalmente en un modelo de nefritis mesangial por anticuerpos antiThy-1, han demostrado que el TGFß es un factor crítico en el acúmulo de matriz in vivo 19, 20. En este mod e l o se observó un incremento en la expresión génica y en la bioactividad del TGFß glomerular asociado a un aumento en la síntesis de proteoglicanos y 23 J. EGIDO y cols. fibronectina. La administración de anticuerpos antiTGFß-1 suprimió la producción de matriz extracelular y las lesiones histológicas. Además, la decorina, u n proteoglicano liberado tras estimulación con TGFß y que neutraliza la actividad de esta citoquina, disminuyó el daño renal en este modelo de nefritis mesangial 19, 20. En el modelo de nefritis nefrotóxica e n el conejo por anticuerpos antimembrana basal glomerular, la síntesis renal de TGFß y su excreción urinaria se correlacionó con la síntesis de cólageno cortical renal y el desarrollo de fibrosis 21. En un modelo de daño intersticial se observó una e s t r e c h a correlación entre la expresión génica del TGFß en monocitos-macrofagos intersticiales y la expresión de proteínas de matriz extracelular 22. En nefritis proliferativas mesangiales en humanos también se ha observado un incremento en la expresión del TGFß, sugiriendo que esta citoquina puede jugar un papel importante en la progresión de la enfermedad renal crónica. En conjunto, estos resultados sugieren que esta citoquina puede participar en la fibrosis glomerular e intersticial. Por último, utilizando la transfección génica in vivo en riñón, Isaka y cols. 23 han d e m o s t r a d o de manera firme que el TGFß es un determinante crítico del acúmulo de matriz in vivo. ANGIOTENSINA II Y ESCLEROSIS RENAL En los últimos años se ha especulado con que las hormonas vasoconstrictoras como la Ang II y la endotelina, en ciertas condiciones, podrían tener un comportamiento similar a los factores de crecimiento 24-28. La utilización desde hace varios años de los inhibidores del enzima convertidor de la Ang I (ECA) en patología experimental y humana ha centrado la atención de la Ang II como un factor potencial del crecimiento celular y de la producción de matriz extracelular 24-28. La mayoría de nuestro conocimiento acerca del papel de la Ang II en el crecimiento celular se ha obtenido de estudios in vitro en células musculares lisas procedentes de vasos. En células mesangiales, dependiendo de las condiciones de cultivo, la Ang II puede ind u c i r hiperplasia o hipertrofia, mientras que en células tubulares fundamentalmente induce hipertrofia. Muchas de estas acciones se realizan a través de la liberación de diversos factores de crecimiento como el PDGF, TGFß y otros como la IL-6, PAF y derivados del ácido araquidónico. La Ang II también ind u c e la expresión de diversos protooncogenes en células mesangiales, tubulares, epiteliales y fibroblastos 24-28. Diversos estudios han demostrado que la Ang II estimula la síntesis de componentes estructurales de la matriz extracelular en células mesangiales y células musculares lisas. Un incremento en el acúmulo glo24 merular de fibronectina y colágenos se ha observado en diversas situaciones asociadas con proliferación mesangial. La mayoría de estos estudios, incluidos los nuestros, han demostrado que la Ang II incrementa la expresión y síntesis de fibronectina de manera dosis y tiempo dependiente. En células mesangiales m u r i n a s en cultivo, la Ang II también estimula la transcripcíón y síntesis de colageno tipo I, pero no el tipo IV. Sin embargo, las células mesangiales de rata p r o d u c e n grandes cantidades de colágeno tipo IV cuando se incuban con Ang II 29. Dosis subpresoras de Ang II también estimulan la síntesis de glicosaminoglicanos vasculares. La implicación de la Ang II en la glomerulosclerosis se ha basado fundamentalmente en los estudios realizados en animales con masa renal reducida tratados con inhibidores de la ECA o antagonistas AT1. Este modelo se caracteriza por proteinuria, hipertensión e insuficiencia renal progresiva asociada a esclerosis glomerular. Diversos investigadores han observ a d o que en las nefronas remanentes existe un incremento del flujo plasmático renal y de la presión capilar glomerular. En este modelo, los inhibidores de la ECA disminuyen la proteinuria y el porcentaje d e glomérulos esclerosados coincidiendo con una normalización de la presión capilar glomerular, probablemente como resultado de la atenuación de los efectos de la Ang II sobre las arteriolas glomerulares aferentes y eferentes. Algunos investigadores, pero no todos, concluyen que los inhibidores de la ECA son más efectivos en la prevención del daño en este modelo que el tratamiento convencional con triple terapia (reserpina, hidralacina e hidroclorotiacida) a pes a r de una reducción equivalente en la presión arterial sistólica. Los estudios anteriores no permitían, sin embargo, diferenciar los efectos de los inhibidores de la ECA sobre la hipertensión sistémica y glomerular de la interacción de la Ang II con células residentes renales. En los últimos años se ha demostrado que el sistema renina-angiotensina tisular puede actuar a nivel auto- Tabla II. Efecto del inhibidor de la ECA quinapril en un modelo normotenso del daño renal · · · · Evita la aparición de proteinuria intensa. Reduce las lesiones glomeruales y tubulointersticiales. Disminuye el infiltrado renal de células mononucleares. Reduce la expresión y síntesis de fibronectina, colágenos IV, I, III y TGF-1. Tomado de Ruiz-Ortega y cols. Kidney Int 48:1778-1791, 1995. CITOQUINAS Y FIBROSIS RENAL crino y paracrino. Hoy sabemos que la actividad de la renina plasmática no refleja la producción intrarrenal de la Ang II. La concentración de esta hormona en el riñón es mil veces más alta que en el plasma. Los genes de los distintos componentes del sistema renina-angiotensina han sido clonados, y diversos estudios han mostrado la expresión génica de las diversas proteínas a nivel renal. Por tanto, es posible que la Ang II generada localmente, además de provocar constricción en las células mesangiales y en las arteriolas aferentes y eferentes, pueda modificar la conducta celular de las células residentes renales. Por ello, en un modelo normotenso de daño renal caracterizado por la presencia masiva de inmunocomplejos a nivel glomerular, estudiamos el efecto de un inhibidor de la ECA con alta fijación tisular como es el quinapril 30 (tabla II). La administración de este fármaco a ratas con proteinuria manifiesta (30-50 mg/24 h vs < 10 mg en controles) indujo un efecto beneficioso sobre las anomalías clínicas y morfológicas. Los animales no tratados desarrollaron síndrome nefrótico masivo e insuficiencia renal aproximadamente a las 3 semanas del comienzo de la proteinuria, mientras que los animales tratados con quinapril no presentaron aumento significativo en la proteinuria y la función renal estuvo preservada. Morfológicamente, los animales tratados presentaron menos hipercelularidad glomerular, glomerulosclerosis y lesiones tubulointersticiales que los animales no tratados. La expresión génica de la fibronectina y de los colágenos IV, I y III en la corteza renal disminuyó entre 40-80 % en ratas tratadas con quinapril. La presión arterial permaneció en límites normales en los animales tratados y no tratados 30. Estos datos sugieren que la adm i n i s t r a c i ó n temprana de un inhibidor de la ECA previene el daño renal probablemente modulando el efecto de la Ang II sobre los factores de crecimiento y las proteínas de matriz. Una cuestión importante en la inhibición farmacológica del sistema renina-angiotensina es si los antagonistas de la Ang II y los inhibidores de la ECA tien e n efectos idénticos o pueden ser diferenciados. Teóricamente, los antagonistas AT-1 proporcionan un mejor bloqueo de las acciones de la Ang II. Por el contrario, los inhibidores de la ECA presentan acciones adicionales (incremento de la bradiquinina y óxido nítrico), además de la inhibición de la generación de la Ang II. Sin embargo, hasta la actualidad ambas clases de compuestos parecen ejercer similares efectos hemodinámicos y sistémicos sobre el riñón. Los antagonistas AT-1 también han sido eficaces en las enfermedades renales experimentales. En el modelo de masa renal reducida, el losartan disminuyó la proteinuria y las lesiones de glomerulosclerosis segmentaria y focal de manera similar a los inhibidores de la ECA 31. LA ANG II COMO MEDIADOR DE LA FIBROSIS INTERSTICIAL RENAL La enfermedad renal progresiva se acompaña de u n infiltrado intersticial de células mononucleares que precede y acompaña a la atrofia tubular y a la fib r o s i s intersticial 32. De hecho, la progresión de la m a y o r í a de las glomerulonefritis está determinada más por el grado del daño tubulointersticial que por la extensión de la afectación glomerular. Algunos investigadores habían sugerido que las células monon u c l e a r e s , , infiltrando el intersticio, inducirían la atrofia tubular y la fibrosis intersticial a través de la s e c r e c i ó n de citoquinas y factores de crecimiento que actuarían sobre los fibroblastos, conduciendo a s u proliferación y a la producción de proteínas de matriz. Datos recientes sugieren que la Ang II circulante y local pueden jugar un papel importante en la fibrosis intersticial en el riñón. La infusión sistémica de Ang II durante 7-14 días se asoció con un influjo de monocitos/macrófagos al riñón, seguido por un aumento en la síntesis de la fibronectina y colágenos intersticiales por el riñón 33. Sin embargo, en esta situación también existe un cierto incremento en la presión sistémica y quizás no es un modelo apropiado para estudiar el papel de la Ang II en la fibrosis intersticial. La obstrucción ureteral crónica, que es seguida por una fibrosis intersticial renal, ha sido considerada recientemente como un buen modelo para estudiar este sistema 34-36. Aunque varias sustancias vasoconstrictoras (tromboxano) y vasodilatoras (óxido nítrico y prostaciclinas) se han implicado en las alteraciones hemodinámicas intrarrenales que ocurren tempranamente después de la ligadura ureteral, la Ang II parece estar implicada en la patogenia de la fibrosis. Así, a los cinco días de la obstrucción ureteral se observó un incremento a nivel de la corteza renal en la expresión génica de la renina, del TGFß y del colágeno IV. Por el contrario, la expresión del receptor AT-1 estuvo disminuida. El tratamiento con enalapril durante cinco días disminuyó la expresión del TGFß-1 y del colágeno IV en alrededor del 50 %. Estos datos sugieren que los inhibidores de la ECA podrían disminuir la fibrosis intersticial renal modificando la síntesis de TGFß-1 inducida por la Ang II 34-36. Las lesion e s tubulointersticiales asociadas a la nefrosis por administración crónica de puromicina también fueron prevenidas por inhibidores de la ECA 37. Aunque el fibroblasto intersticial es la principal célula implicada en el remodelamiento del intersticio renal, se ha prestado una atención escasa a la interacción Ang II-fibroblasto. Recientemente se ha demostrado que los fibroblastos cardíacos en ratas recién nacidas poseen receptores AT-1 funcionales. En esas células la Ang II indujo un aumento de la sínte25 J. EGIDO y cols. sis de DNA y de proteínas totales. Nuestro grupo ha demostrado que la exposición de fibroblastos intersticiales renales a la Ang II induce un incremento en la concentración de calcio intracelular y en la inducción de varios eventos metabólicos relacionados con el crecimiento, como la expresión del protooncogen c - f o s y un aumento en el número de células 38. La Ang II indujo proliferación celular de manera, dosis y t i e m p o dependiente a través del receptor AT-1. También causó un aumento en la expresión de fibronectina y de colágeno intersticial tipo I. En conjunto, estos trabajos han demostrado que la Ang II, independientemente de la presión sistémica y glomerular, es capaz de participar en el remodelamiento/fibrosis renal actuando de manera directa sobre células implicadas en la producción de proteínas de matriz como las células mesangiales y los fibroblastos intersticiales. TGF: PUNTO DE ENCUENTRO DE LAS SEÑALES PROFIBROGENICAS A NIVEL RENAL Como se ha comentado más arriba, la mayoría de los efectos de la TGFß están mediados a través del incremento del turnover de la matriz extracelular. El r i ñ ó n es una diana importante en las acciones del TGFß. Este factor de crecimiento estimula a las células mesangiales, epiteliales y fibroblastos a sintetizar fibronectina y diversos proteoglicanos. La matriz extracelular inducida por TGFß contiene componentes de la matriz como la tenascina e isoformas de la fibronectina que no están presentes en el tejido normal. Estos nuevos componentes de la matriz podrían ser de gran importancia en el reclutamiento de células mononucleares y en el control de la inflamación. E l TGFß-1 es el mayor inductor de la síntesis de p r o t e í n a s de matriz 1 8 . En estudios realizados en nuestro laboratorio hemos observado que en diversas células renales, obtenidas en cultivo primario o de líneas celulares, el TGFß, a concentraciones similares, incrementa la síntesis de fibronectina de una manera superior a la realizada por otras citoquinas como el TNFß, la IL-1 o la IL-6. Estudios recientes sugieren más bien que la mayoría de las acciones de diversas citoquinas y hormonas vasoactivas en la síntesis de proteína de matriz ocurre a través de la liberación de TGFß 39-43. Por ejemplo, en células musculares lisas y en células mesangiales, la Ang II incrementa los niveles del TGFß mRNA y la producción de TGFß en forma latente y bioactivo. La presencia de anticuerpos anti-TGFß en el medio disminuyó la síntesis de matriz inducida en células mesangiales y en fibroblastos por la Ang II. Estos datos son consistentes con la hipótesis de que los efectos de la Ang II sobre la síntesis de matriz proteica son, en parte, indirectos y de26 Tabla III. TGF- en el daño renal Agresión · Citoquinas · Vasoconstrictores Ang II ET-1 TxB2 · Hiperglicemia · Dieta hiperproteica · LDL TGF- TGF- Degradación de matriz Síntesis de matriz extracelular Ensamblaje de la matriz Esclerosis glomerular e intersticial penden de la secreción autocrina del TGFß. En otras palabras, existiría una cascada molecular en la que la Ang II estimula la producción y secreción de TGFß activo, que a su vez estimularía la síntesis y depósito de componentes de matriz proteica. Esta vía molecul a r es probablemente no exclusiva de la Ang II. Recientemente hemos demostrado que la activación d e los receptores Fc en células mesangiales incrementa la expresión y síntesis de matriz proteica, que fue precedida por la expresión y síntesis de TGFß-1. E s t e fenómeno también se ha observado con otros factores que aumentan la producción de TGFß y mat r i z celular como el factor activador de plaquetas (PAF), las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y el tromboxano A2 (tabla III). Estos datos han proporcionado una base racional, celular y molecular, al empleo de diversas maniobras terapéuticas en la práctica nefrológica. En otras palabras, el efecto beneficioso, conocido a nivel clínico, del control de la generación de la Ang II y de los niveles de glucosa séricos, del empleo de fármacos hipolipemiantes y de la dieta hipoproteica podría ser debido, entre otras acciones, a un descenso en la expresión y síntesis de TGFß y de la matriz extracelular. Conclusión Los estudios comentados en este trabajo apoyan la idea de que los avances en el conocimiento de los CITOQUINAS Y FIBROSIS RENAL mediadores celulares, de los factores de crecimiento, de las hormonas vasoactivas y de la producción de la m a t r i z extracelular pueden proporcionar nuevas perspectivas en el tratamiento de la mayoría de las enfermedades renales progresivas. Agradecimientos Los trabajos del grupo mencionados en esta revisión han sido financiados parcialmente por el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (FIS, 94/370), Ministerio de Educación y Ciencia (PM 9 2 / 4 2 ; PM 94/211), Fundación Iñigo Alvarez de Toledo y Fundación Conchita Rábago. Bibliografía 1. Couchman JR, Beavan LA y McCarthy KJ: Glomerular matrix: Synthesis, turnover and role in mesangial expansion. Kidney Int 45:328-335, 1994. 2. Kovacs EJ y Dipietro LA: Fibrogenic cytokines and connective tissue production. FASFB J 8:854-861, 1994. 3. 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