NEFROLOGIA. Vol. XVIII. Suplemento 7. 1998 Problemática actual del xenotransplante. Revisión de la experiencia y aspectos inmunológicos REVISION DE LA EXPERIENCIA CLINICA EN XENOTRASPLANTE La idea de trasplantar órganos de otras especies animales en receptores humanos no es nueva. Las siguientes tablas (I-III) recogen la experiencia clínica mundial en trasplante renal, cardíaco y hepático. En los primeros años de este siglo se realizaron tres intentos de xenotrasplante utilizando como donantes un cerdo, una cabra y una oveja, especies animales Tabla III. Experiencia clínica mundial en xenotrasplante hepático. Año 1966 1969 1969 1969 1970 1971 1971 1974 1992 1993 1993 Cirujano Starlz Starlz Starlz Bertoye Leger Poyet Motin Starlz Starlz Starlz Makowka Donante Chimpancé Chimpancé Chimpancé Babuíno Babuíno Babuíno Babuíno Chimpancé Babuíno Babuíno Cerdo Tipo Heterotópico Ortotópico Ortotópico Heterotópico Heterotópico Heterotópico Heterotópico Ortotópico Ortotópico Ortotópico Heterotópico Supervivencia < 1 día 9 días < 2 días < 1 día 3 días < 1 día 3 días 14 días 70 días 26 días < 2 días Tabla I. Experiencia clínica mundial en xenotrasplante renal. Año 1905 1906 1910 1913 1923 1964 1964 1964 1964 1964 1965 1966 Cirujano Princeteau Jaboulay Unger Schonstadt Neuhof Reemtsma Hitchcock Starzl Hume Traeger Goldsmith Cortesini Donante N Supervivencia 16 días < 3 días < 3 días < 2 días ? < 9 días ² 9 días 10 días 5 días < 60 días 1 día < 49 días 4 meses 31 días Conejo (parcial) 1 Cerdo 1 Cabra 1 Mono 1 Mono 1 Oveja 1 Chimpancé 12 Mono 1 Babuíno 1 Babuíno 6 Chimpancé 1 Chimpancé 3 Chimpancé 2 Chimpancé 1 Tabla II. Experiencia clínica mundial en xenotrasplante cardíaco. Año Cirujano 1964 1968 1968 1968 1969 1977 1977 1984 1992 Hardy Cooley Ross Ross Marion Barnard Barnard Bailey Religa Donante Chimpancé Oveja Cerdo Cerdo Chimpancé Babuíno Chimpancé Babuíno Cerdo Tipo Ortotópico** Ortotópico Heterotópico*** Perfusión con sangre humana Ortotópico? Heterotópico Heterotópico Ortotópico Ortotópico Supervivencia 2 horas No funcionó 4 minutos No funcionó 4 horas 5 horas 4 días 20 días 24 horas *En algunos casos hubo problemas funcionales por el reducido tamaño del corazón. **Se reemplaza el corazón del receptor por el xenoinjerto. ***Se coloca el xenoinjerto sin retirar el corazón nativo del receptor. que se encuentran muy alejadas del hombre en la escala filogenética. Como veremos después, la reacción inmunológica de rechazo que tiene lugar en estos xenotrasplantes es muy intensa, lo que determina una destrucción precoz de los xenoinjertos. En 1964, antes de que se dispusiera de la diálisis, Reemtsma trasplantó riñones de chimpancé a enfermos con insuficiencia renal. La mayoría de los riñones funcionaron inmediatamente después del trasplante, con presencia de diuresis y una mejoría de la función renal demostrada por la disminución de la urea y creatinina séricas. Dado que se sabía que el rechazo de estos xenoinjertos era más grave que el que se producía cuando los órganos provenían de donantes humanos (alotrasplantes), los receptores fueron tratados con una inmunosupresión mucho más intensa, que incluía azatioprina, corticoesteroides, actinomicina C e irradiación local. Este intenso tratamiento inmunosupresor no pudo evitar que todos los receptores presentaran varios episodios de rechazo agudo. Sin embargo, el problema más importante fue la aparición de diversas complicaciones infecciosas que causaron el fallecimiento de la mayoría de los pacientes, aunque uno de estos riñones funcionó normalmente durante nueve meses. En el mismo año 1964, Starlz realizó una segunda serie de xenotrasplantes renales utilizando otra especie de primates, los babuínos, como donantes. Los resultados fueron similares a los obtenidos por Reemtsna, 5 NEFROLOGIA. Vol. XVIII. Suplemento 7. 1998 con una buena función inicial de los xenoinjertos. Sin embargo, en este caso la máxima supervivencia que alcanzó uno de los xenoinjertos fue 60 días, presentando la mayoría de receptores complicaciones infecciosas graves como consecuencia de la intensa inmunosupresión utilizada (la misma que utilizó Reemtsma). Posteriormente se han practicado otras experiencias clínicas de xenotrasplante en las que se han implantado otros órganos. A destacar el de corazón llevado a cabo por Bailey en 1984 y los dos hepáticos realizados por Starzl en 1992 y 1993. Todos ellos utilizaron a babuínos como donantes, pero a pesar de disponer de mejores medicamentos inmunosupresores que los empleados en los años 60 y 70, en el cardíaco se utilizó ciclosporina y en los dos hepáticos tacrolimus y ciclofosfamida, los resultados finales fueron similares. Las supervivencias de los receptores oscilaron entre 20 y 70 días y todos fallecieron como consecuencia del rechazo del órgano o por complicaciones infecciosas. Estas experiencias clínicas han puesto de manifiesto importantes aspectos sobre la posible utilidad del xenotrasplante. RESPUESTA INMUNOLOGICA EN EL XENOTRASPLANTE El rechazo de un injerto (aloinjerto o xenoinjerto), requiere en primer lugar que las células del receptor reconozcan las diferencias existentes en los antígenos del donante, y que una vez identificadas se activen los linfocitos T. Estos, por un lado van a activar a los linfocitos B para producir anticuerpos contra los antígenos del donante (inmunidad humoral). Mientras la inmunidad celular es el elemento fundamental del rechazo en el alotrasplante, la inmunidad humoral juega un papel esencial en el rechazo del xenotrasplante. Los anticuerpos, que constituyen el elemento fundamental de la respuesta humoral, también pueden ser producidos por los linfocitos B sin la colaboración de los linfocitos T y sin que en principio, se conozca un contacto previo con el antígeno. Este tipo de anticuerpos se denominan naturales o preformados, siendo un ejemplo de los mismos los anticuerpos contra los grupos sanguíneos ABO incompatibles. La presencia o ausencia de anticuerpos preformados o naturales constituye la base para la división de los xenotrasplantes en discordantes o concordantes. En los modelos discordantes la presencia de anticuerpos en el momento del trasplante provoca un rechazo hiperagudo. Por el contrario, en los modelos concordantes, los anticuerpos se generan tras la exposición de los antígenos del xenoinjerto, por lo que el rechazo se produce varios días después 6 del trasplante. Aunque la distinción entre especies concordantes y discordantes no es perfecta, ya que por ejemplo humanos del grupo sanguíneo A son concordantes con babuínos del mismo grupo sanguíneo, mientras que humanos del grupo 0 son discordantes, esta distinción es útil para indicar la presencia o ausencia de anticuerpos preformados en el receptor y del rechazo hiperagudo del xenoinjerto. ¿Cuál es el donante xenogénico ideal para el hombre? En general cuanto mayor es la distancia que separa a dos especies en la escala filogenética, mayor es la probabilidad de que existan anticuerpos preformados, y por lo tanto rechazo hiperagudo. Las similitudes anatómicas y funcionales entre los humanos y los primates, hacen que estos animales sean la fuente más lógica de órganos para los humanos. Sin embargo, el uso de primates comporta muchas dificultades. Estos animales se reproducen lenta e ineficazmente en cautividad; algunos están en peligro de extinción; y pueden transmitir graves infecciones a los humanos. Esto hace que la utilización de primates como donantes de órganos para humanos plantee problemas médicos y éticos importantes. El donante xenogénico ideal sería una especie relativamente baja en el árbol filogenético, que sea utilizada habitualmente como fuente de comida por los humanos. El cerdo cumple muchos de los requisitos que serían deseables en un animal como potencial donante de órganos, se reproduce en camadas numerosas, es fácil de alimentar, crece rápidamente, y comparte numerosas similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Recientemente un hígado bioartificial preparado mediante la fijación de hepatocitos de cerdo a un sistema de perfusión extracorpórea se utilizó en un paciente con una hepatitis fulminante. Estos hepatocitos de cerdo fueron capaces de realizar las funciones de desintoxicación y síntesis hepáticas de forma adecuada, aunque por un corto espacio de tiempo. A otro enfermo que presentaba una hepatitis fulminante se le implantó heterotópicamente un hígado de cerdo. El órgano funcionó durante aproximadamente 30 horas antes que fallara como consecuencia de un rechazo hiperagudo. Estos datos sugieren que los órganos del cerdo podrían funcionar en humanos, aunque para que esto suceda es necesario evitar, en primer lugar, el rechazo hiperagudo. A) RECHAZO HIPERAGUDO El rechazo hiperagudo es una reacción que se manifiesta a nivel histopatológico por edema intersticial, hemorragia, trombosis difusa y necrosis celular, sin que apenas exista infiltrado celular. El trabajo original en el que Calne describió los dos tipos de rechazo en los PROBLEMATICA ACTUAL DEL XENOTRANSPLANTE xenotrasplantes, ya señalaba que el rechazo discordante era similar al que presentaban los receptores de alotrasplantes que estaban sensibilizados contra el donante, o a los que se les trasplantaba un órgano ABO incompatible. Dado que se había demostrado previamente que los anticuerpos eran los responsables del rechazo hiperagudo en estas circunstancias, se consideró que los anticuerpos eran los causantes del rechazo hiperagudo en los xenotrasplantes discordantes. En los últimos 5 años se han investigado los mecanismos moleculares responsables del rechazo hiperagudo que sufren los órganos de cerdo, cuando son trasplantados en primates humanos o no humanos, y que constituyen la base de la discordancia entre estas especies. Estos dependen fundamentalmente de tres factores: a) La unión de anticuerpos naturales del receptor con antígenos presentes en las células endoteliales del xenoinjerto. b) La activación del complemento. c) La incompatibilidad de las proteínas reguladoras del complemento del xenoinjerto con el complemento del receptor, lo que permite una activación incontrolable del mismo. tiene anticuerpos contra el grupo B. La identificación del antígeno del cerdo contra el que se dirigen la mayoría de los anticuerpos humanos, ha permitido una mejor caracterización de los xenoanticuerpos que inician la reacción del rechazo. Los estudios iniciales con anticuerpos naturales anti Gala1-3Gal se centraron en el papel que jugaban las inmunoglobulinas Ig G. La razón es que este isótopo de las inmunoglobulinas es el responsable del rechazo hiperagudo en el alotrasplante de enfermos sensibilizados. Sin embargo, el rechazo hiperagudo de órganos de cerdo en primates es mediado fundamentalmente por IgM, que activan el complemento en las células endoteliales del cerdo. La infusión de grandes cantidades de IgM humanas en primates no humanos que recibieron corazones de cerdo, no sólo no causan el rechazo del xenoinjerto, sino que prolonga la supervivencia del mismo al interaccionar con el complemento y evitar que parte de éste reaccione con el órgano. b) Papel del complemento en el rechazo hiperagudo El sistema del complemento es una parte esencial de la defensa del organismo contra microorganismos, y participa activamente en la respuesta inflamatoria. La activación del mismo se puede producir por la unión de un anticuerpo con un antígeno (vía clásica), o por elementos como la endotoxina bacteriana, que inician la reacción sin necesidad de anticuerpos (vía alternativa). La activación del complemento es el elemento fundamental del rechazo en todas aquellas combinaciones de xenotrasplante en las que existe un rechazo hiperagudo. En el xenotrasplante de órganos de cerdo en primates el complemento se activa por la vía clásica, siendo iniciada la reacción por el depósito de xenoanticuerpos naturales. La potencia biológica del complemento, como sistema efector dentro de la respuesta inmunitaria, queda patente, por el hecho de que más de la mitad de las proteínas que lo constituyen actúan como reguladoras de la actividad de otras proteínas. Algunas de las proteínas reguladoras del complemento no son elementos solubles y forman parte de la pared celular, como son el CD59, el factor acelerador de la degradación (DAF) y el cofactor proteico de membrana (MCP). Estas proteínas son específicas de especie, es decir, sólo pueden inhibir el complemento de la especie que las expresa. Como consecuencia, el rechazo xenogénico hiperagudo se produce, al menos en parte, por la incapacidad de las proteínas reguladoras del complemento expresadas en las células del xenoinjerto, para controlar la activación del complemento del receptor. 7 a) Anticuerpos naturales xenorreactivos La importancia de los anticuerpos naturales en la iniciación del rechazo hiperagudo de órganos de cerdo trasplantados en primates, se fundamenta en diversas observaciones. Por un lado, los órganos que sufren el rechazo hiperagudo invariablemente contienen inmunoglobulinas del receptor, depositadas junto con los componentes del complemento. Por otro lado, la deplección de los anticuerpos naturales xenorreactivos en el receptor, prolonga significativamente la supervivencia del xenoinjerto, a pesar de que el sistema del complemento permanezca intacto. Así, el trasplante de órganos de cerdo en primates recién nacidos, que carecen de anticuerpos pero presentan un complemento funcionante, no se asocia con rechazo hiperagudo. Aunque sería razonable pensar que los xenoanticuerpos reconocen un amplio número de antígenos del cerdo, cerca del 80% de los anticuerpos humanos capaces de fijar complemento, identifican una sola estructura: el disacárido galactosa a 1-3 galactosa (Gala1-3Gal). Este disacárido se encuentra presente en las células de todos los mamíferos inferiores y de los monos del nuevo mundo, en los que sustituye a los azúcares responsables de los grupos sanguíneos ABO. Los humanos, los primates y los monos del viejo mundo, expresan en todas sus células los grupos sanguíneos ABO y presentan anticuerpos naturales contra Gala1-3Gal, de forma similar a como un individuo del grupo sanguíneo A NEFROLOGIA. Vol. XVIII. Suplemento 7. 1998 c) Estrategias para superar el rechazo hiperagudo Inhibición de la interacción xenoanticuerpos-endotelio: La absorción de los anticuerpos anti Gala1-3Gal mediante columnas que expresan este disacárido, es una forma efectiva de disminuir selectivamente el nivel de estos anticuerpos. De forma similar, la infusión intravenosa de carbohidratos que contienen este disacárido también disminuye significativamente el nivel de anticuerpos anti Gala1-3Gal. Sin embargo, estos descensos son sólo temporales, restableciéndose posteriormente los niveles de anticuerpos que había antes de la realización de estas técnicas. Otra posibilidad de modificar el rechazo hiperagudo en el xenotrasplante de órganos de cerdo en primates, es disminuir la expresión del antígeno Gala1-3Gal por las células endoteliales del cerdo. Aunque la obtención de cerdos que no expresen este antígeno (animales «knockout») es técnicamente muy difícil, ha sido posible generar cerdos transgénicos que expresan una enzima, la a 1,2-fucosiltransferasa, que reduce significativamente el nivel de Gala1-3Gal. Células de estos cerdos no son destruidas «in vitro» por suero humano, lo que sugiere que los órganos de estos animales pueden ser resistentes al rechazo hiperagudo. Inhibición de la activación del complemento. La estrategia que ha permitido evitar, de forma sistemática y reproducible, el rechazo hiperagudo al trasplantar órganos de cerdo en primates no humanos, ha sido la producción de cerdos transgénicos para las proteínas reguladoras del complemento humano. Estos cerdos expresan en la membrana de sus células las proteínas reguladoras del complemento humano DAF, CD59 o ambas. Cuando los órganos de un cerdo que expresa el DAF humano son trasplantados en primates no humanos, no son rechazados de forma hiperaguda, produciéndose la reacción del rechazo aproximadamente al quinto día del trasplante si no se suministra ningún tratamiento inmunosupresor. La realización de una esplenectomía en el receptor y la administración de un tratamiento inmunosupresor con ciclofosfamida, para prevenir la producción de anticuerpos, y ciclosporina para inhibir la respuesta de los linfocitos T, permite obtener supervivencias superiores a los 90 días. Sin embargo, este intenso tratamiento inmunosupresor se asocia con graves efectos tóxicos en el receptor. Los resultados que se están obteniendo actualmente al trasplantar órganos de cerdos transgénicos en primates no humanos son similares a los observados previamente en los ensayos clínicos de xenotrasplante que utilizaron primates como donantes. Es decir, ausencia de rechazo hiperagudo del xenoinjerto, pero necesidad de un intenso tratamiento in8 munosupresor, que se asocia con graves efectos secundarios en el receptor, para evitar el rechazo posteriormente. B) OTROS TIPOS DE RECHAZO EN LOS XENOTRASPLANTES DISCORDANTES a) Rechazo xenogénico tardío Una vez superada la barrera del rechazo hiperagudo, el rechazo xenogénico tardío o rechazo vascular agudo, se ha convertido en el obstáculo más importante para el éxito de los xenotrasplantes. La fisiopatología de este rechazo no se conoce muy bien. Es una reacción que tiene lugar varios días después del xenotrasplante cuando se evita el rechazo hiperagudo. A nivel histopatológico se puede observar el depósito de xenoanticuerpos y fibrina en el endotelio vascular, la agregación de las plaquetas y un infiltrado celular en el que predominan las células polimorfonucleares, los monocitos y las natural killer (NK). Las células NK son una pequeña subpoblación de células, similares a los linfocitos, que tienen la capacidad de destruir a otras células, fundamentalmente células tumorales y células infectadas por virus, sin necesitar que el antígeno tenga que activar otros elementos celulares previamente. Los factores que inician el rechazo xenogénico tardío no están claros. Por un lado se ha sugerido que los anticuerpos naturales, aunque no activen el complemento, pueden activar a los factores de la coagulación y a diversos elementos celulares como macrófagos y las células NK. Por otro lado, las células NK pueden activar el endotelio independientemente de la presencia de anticuerpos y linfocinas, ya que tienen una actividad intrínseca contra los tejidos xenogénicos. b) Rechazo celular del xenoinjerto El estudio de la respuesta inmunitaria celular contra los xenoinjertos ha sido difícil en los modelos discordantes por el problema que representa superar las barreras del rechazo hiperagudo y el rechazo xenogénico tardío. Sin embargo, en aquellas pocas ocasiones en que esto ha sido posible, el rechazo celular ha sido, en general más grave que el presente en los alotrasplantes. Esto hace que los inmunosupresores convencionales (ciclosporina o tacrolimus) sean menos efectivos en el xenotrasplante que en el alotrasplante, lo que condiciona la utilización de tratamientos farmacológicos más potentes en el primero.