INTRODUCCIÓN

La nefropatía membranosa (NM) es la primera causa de síndrome nefrótico idiopático en el adulto1. Su base fisiopatológica es la formación de depósitos inmunes en el espacio subepitelial, entre la lámina rara externa de la membrana basal glomerular y el podocito2. La NM se clasifica en idiopática o secundaria en función de si es o no posible hallar una etiología responsable de ella. En ausencia de una enfermedad sistémica, infecciosa, neoplásica o de exposición a fármacos, distinguir entre ambas formas es con frecuencia complejo y no puede hacerse únicamente con los datos que proporciona la biopsia renal. La mayor parte de la evidencia disponible indica que en las formas idiopáticas los depósitos renales se forman in situ tras la fijación del anticuerpo a un antígeno diana propio del podocito3, mientras que las formas secundarias se producen o bien como consecuencia del depósito subepitelial de inmunocomplejos circulantes que contienen antígenos extrarrenales o bien como consecuencia de la formación de anticuerpos frente a antígenos extrarrenales que se han fijado a la superficie externa de la membrana basal4. Recientemente, se ha identificado el receptor (R) tipo M de la fosfolipasa A2 (PLA2R), presente en la membrana podocitaria, como uno de los antígenos diana de la respuesta autoinmune en la NM idiopática5 y se ha descrito que los anticuerpos mayormente IgG4 circulantes frente a él (anti-PLA2R) tienen correlación significativa con la actividad clínica de la enfermedad6 y con la respuesta al tratamiento7,8. Por otra parte, mediante técnicas de inmunofluorescencia o de inmunohistoquímica, es posible demostrar la presencia de depósitos renales de anticuerpos anti-PLA2R. La descripción de estos anticuerpos ha generado grandes expectativas en cuanto a su utilidad para identificar subgrupos de NM idiopática con perfil clínico o pronóstico distinto y en cuanto a la posibilidad de diferenciar entre formas idiopáticas y secundarias. La evidencia disponible indica que la prevalencia de anticuerpos anti-PLA2R en enfermos con NM idiopática oscila alrededor del 70 %5,9, pero hasta la fecha no se ha demostrado que la presencia de anti-PLA2R se asocie a un determinado perfil clínico de presentación de la enfermedad. Por otra parte, aunque se ha descrito que estos anticuerpos son altamente específicos de NM idiopática, la frecuencia de detección de posibles etiologías secundarias en enfermos anti-PLA2R positivos descrita en distintos estudios es variable9-16. La correlación descrita entre niveles circulantes y evidencia de depósito renal es elevada; sin embargo, se ha observado la presencia de depósitos de anticuerpos anti-PLA2R en enfermos en los que el nivel circulante de anticuerpos es negativo17,18. Las diferencias entre estudios podrían deberse a razones étnico-geográficas, pero podrían también estar relacionadas con el tipo de técnica utilizada para la detección (dado que las técnicas de detección empleadas en los estudios publicados han sido distintas y no estandarizadas) y con el hecho de haber o no analizado simultáneamente el nivel de anticuerpos (ac) circulantes y la presencia de depósitos renales.

Los objetivos del presente estudio son:

PACIENTES Y MÉTODOS

Se estudió una muestra de 64 pacientes mayores de 18 años, con criterios de síndrome nefrótico y diagnóstico de NM confirmado por biopsia renal. Cuarenta y siete de ellos presentaban NM idiopática y 17 NM secundaria. El diagnóstico de NM se realizó ante la presencia de un patrón morfológico compatible, asociado a la evidencia de depósitos subepiteliales de IgG y C3 en la inmunofluorescencia y en la microscopia electrónica. Tras un estudio protocolizado (que, además de una anamnesis y un examen físico completos, incluía estudios serológicos relacionados con autoinmunidad, serologías virales, ecografía renal y vías urinarias, radiografía de tórax y tomografía tóraco-abdominal en todos los casos, seguidos de estudios endoscópicos en función de los hallazgos encontrados inicialmente), los enfermos en los que no se identificó una etiología responsable fueron clasificados como NM idiopática y los pacientes en los que se identificó una etiología responsable fueron clasificados como afectos de formas secundarias (uno con adenocarcinoma de colon, uno con adenocarcinoma renal de células claras, tres casos de NM asociada a tiroiditis autoinmune, ocho con nefropatía lúpica tipo V, dos con enfermedad mixta del tejido conectivo y dos secundaria a tratamiento con antiinflamatorios no esteroideos). En el momento del diagnóstico, se realizaron mediciones séricas de colesterol total, creatinina, albúmina, proteinuria de 24 horas, filtrado glomerular estimado mediante la fórmula CKD-EPI (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration)19, niveles de ac anti-PLA2R por inmunofluorescencia indirecta (IFI) (Anti-Phospholipase A2 receptor IIFT; Euroimmun AG, Lübeck, Alemania)20 y por ELISA (Euroimmun, Lübeck, Alemania; linealidad: 6-1500 RU/ml; límite inferior de detección 0,6 RU/ml).

Las biopsias renales fueron teñidas con hematoxilina-eosina, PAS-metenamina de plata y tricrómico de Masson para análisis morfológico, y se realizaron estudios de inmunofluorescencia con ac frente a IgA, IgG, IgM, C3, fibrinógeno y cadenas ligeras. Los procedimientos de inmunohistoquímica para la detección de ac anti-PLA2R se realizaron en tejido incluido en parafina tras desparafinización y rehidratación, según el método de avidina-biotina-peroxidasa, usando ac anti-PLA2R (HPA012657 Sigma-Aldrich Co.LLC).

El presente trabajo siguió los parámetros de la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes otorgaron consentimiento informado por escrito y el comité de bioética del centro aprobó el estudio.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como media y desviación típica para variables de distribución normal o la mediana y cuartiles para las de distribución no normal. Las diferencias entre medias de grupos se analizan mediante la prueba t de Student para datos independientes o la prueba U de Mann Whitney. Las diferencias en proporciones se analizan mediante la prueba de χ2 o el test exacto de Fisher. Se calculó la sensibilidad y especificidad de la determinación de anti-PLA2R por IFI y de la presencia de depósitos renales de ac anti-PLA2R para el diagnóstico de NM idiopática. Asimismo, mediante curvas ROC, se determinó el título de ac anti-PLA2R medido por ELISA con mayor sensibilidad y especificidad para identificar a los pacientes con depósitos renales de ac anti-PLA2R. Una vez determinado, se calculó la sensibilidad y la especificidad de dicho valor para el diagnóstico de la NM idiopática. Se consideraron estadísticamente significativos todos los valores de p < 0,05. Se utilizó el programa estadístico SPSS versión 20.0.

RESULTADOS

En la tabla 1 se resumen las características clínico-demográficas de los pacientes con NM estudiados. No se observaron diferencias significativas en cuanto a sexo, edad, colesterol total, proteinuria, albúmina sérica y filtrado glomerular entre enfermos con NM idiopática y secundaria.

En la figura 1, se presentan imágenes representativas de positividad y negatividad del estudio de IFI para detección de ac anti-PLA2R circulantes y en la figura 2 se presentan imágenes representativas de estudios inmunohistoquímicos con y sin evidencia de depósitos renales de ac anti-PLA2R.

La prevalencia de depósitos renales de ac anti-PLA2R por IHQ fue del 76,6 % en los enfermos con NM idiopática frente al 5,8 % en los enfermos con NM secundaria (p: 0,0001). La IFI tuvo una sensibilidad del 94,4 % y una especificidad del 100 % para la identificación de los enfermos con depósitos renales, y una sensibilidad del 74,4 % y una especificidad del 94,1 % para la identificación de los enfermos con NM idiopática (tabla 2). Por ELISA, la mediana del título de ac en el momento del diagnóstico fue de 42,41 RU/ml (P25-75: 17-90 RU/ml) en los enfermos con NM idiopática y 12 RU/ml (P25-75: 0-13,4 RU/ml) en los enfermos con NM secundaria (p: 0,0026). Los enfermos con NM idiopática y evidencia de depósitos renales de ac anti-PLA2R presentaron un título de ac significativamente superior al de los enfermos con NM idiopática sin depósitos de ac en la biopsia (43,8 RU/ml [P25-75: 16-100 RU/ml] frente a 1,23 RU/ml [P25-75: 0-3,8 RU/ml], p: 0,00014). Mediante curvas ROC, se apreció que, por ELISA, un título de ac anti-PLA2R > 15 RU/ml fue el valor con mayor sensibilidad (94,5 %) y especificidad (100 %) para la identificación de los enfermos con depósitos renales de ac anti-PLA2R, por lo que se tomó este valor como punto de corte para considerar un resultado de ELISA como positivo. Aplicando dicho criterio a la muestra estudiada, el ELISA tuvo una sensibilidad del 74,4 % y una especificidad del 94,2 % para el diagnóstico de NM idiopática (tabla 2). Solo se encontró evidencia de depósitos renales y niveles de anti-PLA2R detectables por IFI y ELISA en 1 (5,8 %) de los 17 pacientes clasificados como NM secundaria. En dicho paciente, tras realizar las exploraciones protocolizadas para descartar etiologías secundarias, se llegó al diagnóstico de adenocarcinoma renal de células claras. Dos enfermos con depósitos renales de ac anti-PLA2R presentaron estudio negativo por IFI y uno de ellos adicionalmente por ELISA. Ambos, en el momento en que se extrajeron las muestras, presentaban síndrome nefrótico con niveles medios de proteinuria de 12 ± 2,6 g/día. Los títulos de ELISA fueron de 13,2 y 15,4 RU/ml, respectivamente.

En la tabla 3, se resumen las características clínico-demográficas de los pacientes con NM idiopática en función de la presencia o no de ac anti-PLA2R por IHQ. El grupo de enfermos con NM idiopática y ac anti-PLA2R negativos estuvo integrado exclusivamente por varones. Los pacientes con anti-PLA2R positivo presentaron cifras de proteinuria significativamente mayores (13,25 [P25-P75: 9,05-15,87] frente a 9,43 [P25-P75: 6,30-15] g/día, p: 0,018), pero no se observaron diferencias significativas en ninguna de las demás variables estudiadas. No se apreció correlación estadística entre el título de ac medido por ELISA y la edad, la función renal, el nivel de albúmina sérica o la proteinuria en 24 horas.

DISCUSIÓN

Los resultados de nuestro estudio indican que el 76,6 % de los enfermos con NM idiopática presentan depósitos renales de ac anti-PLA2R detectables por IHQ. La presencia de estos depósitos se asocia a niveles circulantes de ac anti-PLA2R, cuya presencia se puede demostrar en el 94,4 % de los casos mediante técnicas de IFI y en el 97,2 % de los casos mediante ELISA. La prevalencia de ac circulantes con ambas técnicas es similar a la descrita en estudios previos con técnicas tanto de IFI20 como de ELISA21 o de Western Blot5.

El primer aspecto de interés en cuanto a las técnicas de detección de ac circulantes anti-PLA2R es su sensibilidad para la identificación de los enfermos en los que hay evidencia de depósitos renales de aquellos. A este respecto, en nuestra experiencia, las técnicas de ELISA y de IFI tienen resultados similares. Todos los enfermos con niveles de ac circulantes detectables por una u otra técnica presentaron depósitos renales de anti-PLA2R. Sin embargo, fue posible demostrar la presencia de depósitos renales de ac anti-PLA2R en ausencia de niveles circulantes detectables. Esta evidencia coincide con datos previamente descritos por otros grupos17,18 y podría explicarse por una ausencia de paralelismo entre la evolución de los títulos de ac circulantes y la de los depósitos renales de anti-PLA2R. En nuestra experiencia, los enfermos en los que se detectaron depósitos renales, pero no ac circulantes anti-PLA2R, presentaron títulos medidos por ELISA próximos al valor de corte definido para la clasificación de los grupos y, en todos los casos, presentaron criterios indiscutibles de síndrome nefrótico sin diferencias clínicas en relación con los enfermos con niveles circulantes de anti-PLA2R. Dada la gran diferencia en el título de ac entre estos casos y el que se detecta en las formas de NM en las que no hay evidencia de depósitos renales de anti-PLA2R (valores próximos a 0), nuestros datos sugieren que cuando por las técnicas de IFI no se detectan niveles circulantes de ac anti-PLA2R, aunque el resultado del ELISA sea también negativo, si los títulos detectados por esta última son próximos a 15 RU/ml, es posible que en la biopsia renal se hallen depósitos subepiteliales de ac anti-PLA2R.

El segundo aspecto de interés en cuanto a las técnicas de detección de ac anti-PLA2R circulantes es su valor clínico para diferenciar entre NM idiopática y secundaria. Las técnicas de IFI, al ser cualitativas, pueden dar lugar a resultados difíciles de interpretar o falsamente negativos a títulos bajos de ac. Las técnicas de ELISA requieren la definición de un punto de corte a partir del cual el resultado obtenido se considera positivo. En nuestra experiencia, el título con mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de los enfermos con depósitos renales de ac anti-PLA2R fue de 15 RU/ml, valor ligeramente inferior al punto de corte definido por el laboratorio que desarrolló el sistema de medida. Este valor tuvo una sensibilidad similar a la de la IFI, por lo que debe concluirse que ambas técnicas son comparables. Las ventajas de una u otra dependerían de algunas de sus características diferenciales. Las técnicas de ELISA permiten la detección de ac circulantes y su cuantificación. Por ello, serían teóricamente aplicables en los casos en los que se pretenda monitorizar la evolución de los títulos en seguimientos prospectivos, aunque su utilidad clínica para este fin todavía no ha sido formalmente analizada. Como contrapartida, las técnicas de ELISA actualmente disponibles tienen un coste elevado, son de procesamiento lento y no pueden aplicarse para el análisis de muestras individuales, mientras que las técnicas de IFI, al permitir el análisis de grupos reducidos de muestras, pueden proporcionar un resultado cualitativo o semicuantitativo en un menor plazo de tiempo.

Tras la identificación de los ac anti-PLA2R como posibles mediadores de la lesión renal en la NM idiopática, se generaron expectativas sobre la posibilidad de que su detección permitiera excluir el diagnóstico de NM secundaria y especialmente de neoplasias asociadas. Desde su descripción, la mayor parte de los estudios indican que la detección de depósitos renales o de ac circulantes anti-PLA2R es altamente específica de NM idiopática. Sin embargo, entre los diferentes estudios hay ciertas discrepancias en cuanto al porcentaje de enfermos con ac anti-PLA2R positivos en los que se detecta una posible etiología responsable9. Hay pocos casos descritos en los que una NM con ac anti-PLA2R se asocie a una enfermedad sistémica o infecciosa9,11,20. Nuestros datos coinciden con estudios previos5,11,13,18 en que la presencia de ac anti-PLA2R tiene una especificidad muy elevada para el diagnóstico de NM idiopática. En nuestra experiencia, en ninguno de los enfermos con NM asociada a enfermedad sistémica o a fármacos pudo demostrarse la presencia de depósitos renales o de niveles circulantes de ac anti-PLA2R, pero uno de los dos enfermos en los que la NM se asoció a neoplasia presentó depósitos renales y niveles circulantes de ac. Por ello, a pesar de que la asociación de ac anti-PLA2R con neoplasia descrita en diferentes estudios es muy baja9,11 y de que en algunos casos pueda tratarse de asociaciones casuales, hasta que no se disponga de mayor experiencia, no parece prudente dejar de realizar estudios con la finalidad de descartar posibles formas secundarias en los enfermos con NM y evidencia de ac anti-PLA2R. El último de los objetivos planteados en el presente estudio fue analizar si en los enfermos con NM idiopática hay algún tipo de diferencia en el perfil clínico de la enfermedad en función de la presencia o no de ac anti-PLA2R. A este respecto, nuestros resultados coinciden con estudios previos en los que se describe que los enfermos con ac anti-PLA2R positivos presentan un nivel de proteinuria significativamente superior (pero de escasa relevancia clínica), en el momento del diagnóstico, pero no diferencias significativas en ninguna de las demás variables analizadas.

En resumen, nuestros datos indican que, tras el diagnóstico de NM por biopsia renal, la tinción por inmunohistoquímica es la técnica preferible para la localización de los casos que se asocian a presencia de ac anti-PLA2R. Las técnicas de IFI y de ELISA permiten la detección de ac circulantes anti-PLA2R en la mayor parte de los enfermos con depósitos renales, por lo que, como sugieren algunos autores9, podría considerarse su utilización como screening no invasivo en enfermos con síndrome nefrótico. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, aunque con escasa frecuencia, pueden dar lugar a resultados falsamente negativos. Cuando se utilizan para la clasificación de los pacientes en formas idiopáticas y secundarias, ambas técnicas dan lugar a resultados comparables. Las técnicas de ELISA tienen el valor adicional de permitir la cuantificación de los títulos de ac de una manera sencilla. Por ello, podrían ser preferibles o complementarias a la IFI si se demuestra relación entre el título de ac y el curso clínico espontáneo de la enfermedad, la respuesta al tratamiento y/o la predicción de recidivas.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés potenciales relacionados con los contenidos de este artículo.

Tabla 2. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos de cada una de las pruebas para el diagnóstico de nefropatía membranosa idiopática.

Tabla 1. Variables clínico-demográficas basales en la muestra.

Tabla 3. Características clínicas y demográficas en función de la presencia de depósitos de anti-PLA2R en enfermos con nefropatía membranosa idiopática.

Figura 1. Inmunofluorescencia indirecta para anti-PLA2R en suero.

Figura 2. Inmunohistoquímica para anti-PLA2R en biopsia renal.