NEFROLOGÍA. Vol. XXIII. Suplemento 3. 2003 Papel del VEGF en la respuesta celular a la agresión M. V. Álvarez-Arroyo, S. Yagüe, F. R. González-Pacheco, M. A. Castilla, Y. Suzuki, S. Jiménez, J. J. P. Deudero, F. Neria, L. Velasco y C. Caramelo Laboratorio de Nefrología e Hipertensión. Clínica de la Concepción. Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica (IRSIN). Madrid. El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es un potente mediador angiogénico endotelial con capacidades multifuncionales 1,2. Recientemente, trabajos de varios laboratorios, han resaltado la función del VEGF como factor de viabilidad endotelial3, 4. La integridad y viabilidad endotelial es fundamental en múltiples situaciones, incluyendo entre otras la isquemia/reperfusión, neoplasia, inflamación, perfusión de órganos destinados al trasplante, shock y reendotelización de superficies denudadas5. El VEGF actúa a través de la unión a receptores específicos de membrana con actividad tirosina quinasa (VEGFR1 y VEGFR2) y al receptor complementario neuropilina2. La unión del VEGF a cada uno de sus receptores da lugar a la activación de varias vías de señalización, siendo el receptor VEGFR2 el más importante desde un punto de vista funcional1,2,4. El mecanismo de señalización intracelular del VEGF, aunque aclarado solo en forma parcial, involucra: fosforilación de al menos 11 proteínas, incluyendo fosfolipasa C (PLC) y proteínas asociadas, proteínas del aparato de adhesión, fosfatidil inositol 3 quinasa (PI3K), pico transitorio de Ca2+ libre citosólico (Ca2+i), activación de MAPK (proteínas kinasa activadas por mitógeno), incluyendo ERKs, JNKs, y p38, y producción de óxido nítrico (NO) 4, 6. El control de la expresión del gen del VEGF ocurre tanto a nivel pre como post-transcripcional 1, 2. Los cambios en la tensión del O2 son el mecanismo esencial en la regulación transcripcional del VEGF, a través de la inducción del factor inducido por hipoxia 1(HIF-1). Varias citoquinas y factores de crecimiento pueden regular este gen, a su vez se han observado diferencias en la expresión del gen cuando las células están sometidas a agentes agresores. VEGF Y VIABILIDAD ENDOTELIAL Las propiedades citoprotectoras del VEGF exógeno sobre las células endoteliales (CE) descritas hasta ahora incluyen la expresión de las proteínas antiapoptóticas bcl-2 y survivina, la prostaciclina, NO y el papel de la vía PIK3K/Akt 7-9. La proteína antiapoptótica bcl-2 regula la apertura del poro mitocondrial de permeabilidad transitoria inhibiendo la salida del citocromo c al citosol. La proteína Akt inhibe la apoptosis a través de su interacción con caspasa 9, su regulación de NFKB (nuclear factor-kappa B) y su actividad inhibitoria de p38MAPK (importante modulador del programa proapoptótico en CE) 7, 10, 11. A su vez, Akt es responsables, en parte, de la producción de NO por VEGF, a través de la fosforilación en Ser/Tre de la NO síntasa endotelial (eNOS) 12, 13. Bajo ciertas condiciones, la exposición de las CE a especies reactivas de oxígeno (H2O2), al desorganizador de los filamentos de actina citocalasina D (CyD), a la disrupción de las uniones interendoteliales, o al medicamento inmunosupresor ciclosporina A (CsA), resulta en un efecto protector significativo sobre la apoptosis producida por la depleción de suero fetal bovino (estudiada por fragmentación del ADN, citometría de flujo con yoduro de propidio, activación de caspasa 3 y/o cambios en el potencial de membrana mitocondrial); por el contrario, concentraciones más altas de estos agentes son claramente tóxicas para el endotelio 14, 15. Además, las CE pretratadas con dosis protectoras de CsA producen tolerancia a dosis sucesivas más elevadas y tóxicas de esta droga inmunosupresora respuesta adaptativa)16. El interés específico de la respuesta adaptativa radica en que permitiría plantearse un precondicionamiento de los pacientes con dosis menores de esta droga, con la finalidad de reducir los efectos secundarios indeseables de su utilización crónica. El hecho de que la CsA, la CyD y el H2O2 produzcan ambos efectos citoprotector y tóxico en las CE dependiendo de concentración podría estar relacionado con la estimulación de mecanismos protectores a bajas concentraciones, como el VEGF, que Correspondencia: Dra. M. V. Álvarez-Arroyo Dr. C. Caramelo Lab. de Nefrología e Hipertenisón Fundación Jiménez Díaz Avda. Reyes Católicos, 2 28040 Madrid E-mail: mvarroyo@fjd.es ccaramelo@ fjd.es 54 PAPEL DEL VEGF EN LA RESPUESTA CELULAR A LA AGRESIÓN son desbordados por la toxicidad producida por dosis más elevadas de estos agentes agresores. Esto se ha demostrado al comprobar que la utilización de un anticuerpo bloqueante de los efectos del VEGF hace que el efecto citoprotector de estas sustancias desaparezca, potenciándose drásticamente su toxicidad endotelial 14-16. El papel citoprotector del VEGF autocrino está en parte relacionado con su sobrexpresión génica. En datos de nuestro Laboratorio, observamos que la expresión y síntesis autocrina del VEGF aumenta cuando las CE se tratan con CyD o H2O2, pero no cuando se tratan con CsA 14-16. Los resultados obtenidos anteriormente nos llevaron a profundizar en el estudio de: los mecanismos de acción de la CsA, desde el punto de vista de su relación con el VEGF. En linfocitos, la CsA se une e inhibe una proteína citoplasmática que es una isopropil-propril isomerasa, la ciclofilina (CyP). El complejo formado por CsA-CyP se une e inhibe una fosfatasa, la calcineurina (Cn); la Cn desfosforila al factor nuclear activador de las células T (NFAT), que migra al núcleo favoreciendo la activación génica de las linfoquinas esenciales para la proliferación de células T. No está establecido, sin embargo, sí los efectos tóxicos de la CsA sobre el endotelio se deben a su unión a CyP o a Cn. En experimentos empleando análogos de la CsA (MeVal-4-CsA, Meile-4-CsA) que unen CyP pero no inhiben Cn (testados por la incapacidad de bloquear la unión del NFAT a proteínas nucleares), se ha podido establecer por primera vez que los efectos citoprotectores y citotóxicos de la CsA en el endotelio implican una vía independiente de la unión a Cn16. Con relación a los mecanismos de transmisión de señal del VEGF, observamos que CE pretratadas con concentraciones citoprotectoras de CsA o MeVal-4CsA durante 24 h presentan un aumento del pico transitorio de Ca2+i producido por VEGF significativamente mayor que las CE no preincubadas con estas drogas16. A su vez, el efecto protector aumenta cuando las CE se les trata conjuntamente con CsA y VEGF exógeno. Por último el efecto protector de la CsA y sus análogos desaparece cuando las CE se preincuban con un anticuerpo bloqueante de los efectos del VEGFR2 16. El VEGFR2 se incrementa significativamente cuando las CE se tratan con CsA y/o sus análogos tanto a dosis tóxicas, como protectoras, y en la respuesta adaptativa de esta droga16. Se observan resultados similares con otros agentes agresores, como por ejemplo el H2O2 (Gonzalez-Pacheco y cols., datos no publicados). Estos resultados sugieren consistentemente que el nivel de expresión de VEGFR2 constituye un punto de control princi- pal del papel del VEGF en los efectos de la CsA en el endotelio. Para analizar los mecanismos por el cual VEGF ejerce su acción protectora, la utilización de un inhibidor de PI3K (LY294002) bloquea el efecto protector de la CsA sobre la apoptosis provocada por una depleción de suero fetal bovino en CE CsA (Yagüe y cols, datos no publicados). A su vez el LY294002 bloquea el incremento en la expresión del VEGF en CE tratadas con H2O2 (González-Pacheco y cols., datos no publicados) y el incremento de VEGFR2 en CE tratadas con CsA (Álvarez-Arroyo y cols., datos no publicados). Estos resultados confirman y amplian a la regulación del VEGF endógeno y su receptor VEGFR2 el papel de la vía PI3K en la citoprotección por VEGF. Tanto el VEGF, como la CsA provocan un aumento en la producción de NO y una estimulación de la eNOS, datos observados por otros autores y confirmados por nosotros. Sobre esta base, es posible que el NO contribuya al efecto protector de la CsA y otros agentes agresores sobre el endotelio, lo que se confirma en la observación de que la protección endotelial debida a bajas concentraciones de esta droga desaparece en presencia de un inhibidor de la formación de NO (L-NAME) (datos no publicados). En conjunto, los resultados que describimos abren un nuevo camino en el estudio de las bases celulares de la toxicidad endotelial ante la agresión y, por consiguiente, pueden contribuir a posibles soluciones del problema. La caracterización del papel de la CyP y su relación con el VEGFR2 aporta una base experimental a aspectos en los que las interpretaciones existentes hasta la actualidad se basaban en extrapolaciones de los conocimientos obtenidos en linfocitos, y que como se ve, no son totalmente válidas en las CE. Como corolario a los resultados anteriores, una de las preguntas que nos planteamos es si el papel del protector del VEGF ante la agresión es un efecto específico del endotelio, o si puede extenderse a otros órganos diana de la acción de la CsA, como los túbulos renales17. Trabajos recientes han demostrado que la administración exógena del VEGF protege al riñón del daño tubular producido por CsA18. Estos estudios se basaron en la hipótesis de que la afectación tubular provocada por la CsA sea secundaria a daño de los capilares peritubulares. Durante el último año hemos obtenido resultados que demuestran que el VEGF endógeno, in vivo e in vitro, tiene un papel relevante en la nefrotoxicidad provocada por la CsA y que la inhibición del VEGF mediante un anticuerpo bloqueante da lugar a una clara intensificación del daño tubular19. Al igual que en el endotelio, confirmamos que existe una expresión basal de VEGF en córtex renales de ratones controles y en células tubu55 M. V. ÁLVAREZ-ARROYO y cols. lares renales en cultivo controles. Esta expresión se intensifica cuando los ratones y las células se tratan con un agente agresor como la CsA19. Por tanto el VEGF autocrino actúa como mediador de citoprotección en otros tipos celulares diferentes al endotelio. VEGF, VIABILIDAD ENDOTELIAL Y PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO (HSPs) Una parte considerable de las aplicaciones clínicas derivadas de la inducción del VEGF como respuesta a la agresión están relacionadas con su efecto protector3,14,4. El VEGF protege del estrés osmótico, de agentes tóxicos, de neoplasias, de procesos de isquemia/reperfusión, de la agresión farmacológica y de la hipoxia5. En la mayoría de estos procesos también se ha descrito un aumento de la expresión y síntesis de una familia de proteínas protectoras, muy conservadas evolutivamente, ampliamente expresadas y muy abundantes en las células de mamíferos, las HSPs20,21. En las células vasculares, se ha detectado inducción de las HSPs tanto en procesos fisiológicos como patológicos, asociándose esta inducción a un papel protector20,21. Las HSPs se clasifican de acuerdo a su peso molecular. Su función primordial es la de actuar como «chaperones» (proteínas de acompañamiento de otras proteínas en diversas circunstancias funcionales) en condiciones fisiológicas y de estrés. La regulación de las HSPs se lleva a cabo tanto a nivel post-transcripcional como pretranscripcional y se encuentran reguladas por factores transcripcionales específicos (HSFs)22, 21. Se han descrito tres HSFs en los mamíferos: HSF1, HSF2 y HSF4. El HSF1 y el HSF2 son los más abundantes y están expresado ubiícuamente, mientras que el HSF4 sólo se ha encontrado en cerebro y pulmón22, 21. El HSF1 y HSF2 existen constitutivamente en una forma libre en el citosol, y ante situaciones de estrés son hiperfosforilados por miembros de la familia de las MAPK como ERK1, SAP/JNK y p38, formando un homotrimero que migra al núcleo, donde se une a una región similar del ADN. HSF1 y HSF2 difieren en los mecanismos de activación y en la respuesta transcripcional 22, 21. Una de las hipótesis sugerida por nuestro trabajo reciente es que el endotelio, ante una situación de estrés, podría responder con un sistema de defensa unitario y polivalente, en el cual se pondrían en juego una serie de proteínas relacionadas entre sí, y controladas por el VEGF, cuya finalidad sería restablecer de nuevo el equilibrio. En términos de efecto celular, existen considerables similitudes entre las HSPs y el VEGF: 1) Ambos grupos de proteínas se expresan en los mismos procesos fisiológicos y patológicos como res56 puesta defensiva de las células al estrés4,20. 2) Son reguladas a nivel transcripcional por NO, H2O2, metales pesados, hipoxia, o análogos de aminoácidos 12,4. 3) Tanto el VEGF como las HSPs son claves en la regulación de la apoptosis, inhibiendo la activación de las caspasas y favoreciendo la síntesis de proteínas antiapoptóticas como bcl-2 9,23-26. 4) La proteína quinasa C delta (PKCd) regula la activación transcripcional del HSF y HIF1 por hipoxia, siendo la PI3K un regulador de la translocación del PKCd27. 5) Ambos grupos de proteínas pueden ejercer su función actuando como activadores o inhibidores de la transcripción de genes. Todas estas circunstancias comunes entre HSPs y VEGF apoyan nuestra hipótesis de trabajo. La HSP90 es esencial para la activación del HIF1 por hipoxia, pero además se asocia con la eNOS, favoreciendo su fosforilación por PI3K/Akt12. EL VEGF promueve la formación y estabilización de este complejo multiproteico13. Se ha descrito la interacción de la HSP70 con dominios de transactivación de factores transcripcionales como el NFKB, que a su vez está implicado en la regulación del VEGF y VEGFR228. El NO, JNK y p38, que están implicados en la estimulación de la HSP70 y HSP25/27 respectivamente29, forman parte del mecanismo de señalización del VEGF4, por lo que es plausible que el VEGF pueda regular la HSP70 vía NO y/o JNK y la HSP25/27 vía p38. La regulación de las HSPs por el VEGF es un tema complejo, debido a las interacciones existentes entre ambos. Por ello, tanto la respuesta protectora como tóxica a nivel endotelial de las HSPs y el VEGF están sometidas a un fino equilibrio dependiente de diferentes factores que pueden simultáneamente inducir la expresión de proteínas protectoras y la muerte celular. Resultados de nuestro laboratorio muestran que la inhibición funcional de las HSPs mediante geldanamicina potencia drásticamente la toxicidad de la CsA y de los análogos de la CsA. Además, la CsA induce un aumento en la síntesis de la HsP70 tanto a dosis protectoras, como tóxicas. La importancia de este hecho es evidente, dada la importancia de la HSP70 en el replegamiento de proteínas desnaturalizadas, en su acción antiapoptótica y en la respuesta adaptativa celular. Más aún, cuando las CE se preincuban con un anticuerpo específico anti-VEGF, el incremento en la síntesis de la HSP70 producido por dosis protectoras de CsA y/o análogos de CsA disminuye significativamente. Como confirmación de estos hallazgos, al tratar. CE con VEGF exógeno, se observa un aumento significativo de HSP70 (Álvarez-Arroyo, datos no publicados). En el momento actual, el Laboratorio de Nefrología-Hipertensión está estudiando los mecanismos responsables de la interacción entre estos dos mecanismos de defensa ante la agresión. PAPEL DEL VEGF EN LA RESPUESTA CELULAR A LA AGRESIÓN Una visión colectiva de los resultados enunciados indica que el VEGF cumple un papel singular en la unificación de señales citoprotectoras en CE en situación quiescente y, por lo tanto, análoga a la que existe en la pared vascular normal. Aunque predecible, la coordinación de los diferentes mecanismos expuestos constituye el trasfondo de una respuesta que, aunque posee una serie de elementos comunes, es flexible y diferenciada para cada tipo diferente de agresión. Basados también en los datos presentes, debemos resaltar la notable complejidad de la respuesta citoprotectora en un tipo de células que, como las endoteliales, se encuentran en una posición anatómica particularmente accesible a la agresión. BIBLIOGRAFÍA 1. Ferrara N: Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 280 (6): C1358-C1366, 2001. 2. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J 13 (1): 9-22, 1999. 3. Álvarez Arroyo MV, Caramelo C, Ángeles CM, González Pacheco FR, Martín O, Arias J: Role of vascular endothelial growth factor in the response to vessel injury. Kidney Int Supl. 68 S7-S9, 1998. 4. Zachary I: Signaling mechanisms mediating vascular protective actions of vascular endothelial growth factor. Am J Physiol Cell Physiol 280 (6): C1375-C1386, 2001. 5. Minowada G, Welch WJ: Clinical implications of the stress response. 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