NEFROLOGÍA. Vol. XXIII. Suplemento 3. 2003 Ascitis y disfunción vascular en la cirrosis hepática humana: nuevos conceptos fisiopatológicos para una complicación severa M. Morales-Ruiz, P. Cejudo-Martín y W. Jiménez Laboratorio de Hormonas. Hospital Clínic Universitari. Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer e Instituto Reina Sofía de Investigaciones Nefrológicas. Universidad de Barcelona. Barcelona. INTRODUCCIÓN El incremento en la resistencia al flujo portal es el factor primario de la fisiopatología de la hipertensión portal, siendo esta complicación la mayor causa de morbilidad y mortalidad de los pacientes cirróticos1. Este incremento en la resistencia vascular intrahepática es consecuencia de anomalías anatómicas causadas por la formación de nódulos de regeneración hepática y por el aumento del flujo portal venoso que recibe el hígado y que mayoritariamente está causado por un incremento en la vasodilatación arteriolar esplácnica. La formación de ascitis en los pacientes cirróticos es la complicación más frecuente asociada a la hipertensión portal y consiste en la acumulación de líquido en la cavidad peritoneal2. La ascitis está formada por una solución de agua y sales, cantidades variables de albúmina, globulinas y células en suspensión, principalmente células mesoteliales, eritrocitos, macrófagos, linfocitos y neutrófilos. Debido a esta composición relativamente simple, clásicamente se ha considerado que la ascitis tiene poca influencia sobre las anormalidades hemodinámicas y renales que se observan en los pacientes cirróticos. Sin embargo, este concepto debería ser reconsiderado a la luz de los hallazgos descritos por nuestro laboratorio y por otros investigadores en los que se demuestra la existencia de cantidades significativas de citocinas proinflamatorias, factores vasoactivos y agentes proliferativos en la ascitis de los pacientes cirróticos3-7. Bajo determinadas circunstancias, la producción de estas sustancias por células residentes de la cavidad peritoneal podría modificar la respuesta inmune inespecífica, la tonicidad y la permeabilidad vascular, en este área o en territorios adyacentes. Correspondencia: Dr. Wladimiro Jiménez Hospital Clínic Universitari Villarroel, 170 08036 Barcelona E-mail: wjimenez@medicina.ub.es El estudio de las propiedades fisiopatológicas de la ascitis y de los tipos celulares contenidos en este fluido, es un requisito necesario para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas que tengan como finalidad mejorar la calidad de vida de los enfermos cirróticos y retardar la aparición de descompensaciones severas, incrementando, por tanto, sus posibilidades para beneficiarse de tratamientos alternativos como el trasplante hepático. Por ello, el objetivo de este artículo es el de revisar los últimos estudios en los que se introducen nuevos conceptos sobre la fisiopatología del líquido ascítico en la cirrosis. PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) EN MACRÓFAGOS PERITONEALES DE PACIENTES CIRRÓTICOS El NO es un producto de secreción de células eucariotas que está implicado en numerosos procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Una de sus principales funciones es la de actuar como agente bactericida participando en la respuesta inmune no específica desarrollada por determinados tipos celulares, como por ejemplo los macrófagos. Aunque la actividad antimicrobiana del NO ha sido confirmada por numerosos estudios, los datos más concluyentes fueron obtenidos en el trabajo publicado por MacMicking y cols. en 19958, donde se demuestra que ratones mutantes nulos para el gen iNOS presentan una disminución en la respuesta inmunológica promovida por infecciones bacterianas. Hasta la fecha el significado biológico de la activación de iNOS en macrófagos humanos es más controvertido y la transcripción del gen en respuesta a citocinas y lipopolisacárido (LPS) es sorprendentemente débil, en comparación con ratones, y requiere la participación de CD23 y/o CD699, 10. En lo que atañe a la cirrosis descompensada, diversos estudios han sugerido que en la cavidad peritoneal de estos pacientes se produce NO11. Estas afirmaciones provienen de estudios en los que se de- 58 ASCITIS Y DISFUNCIÓN VASCULAR EN LA CIRROSIS HEPÁTICA muestra que la ascitis contiene concentraciones significativamente mayores de nitratos y nitritos (NOx) que las concentraciones halladas en la sangre periférica de los pacientes cirróticos con ascitis y peritonitis bacteriana espontánea (PBE)12. La PBE es una complicación común desarrollada por los pacientes cirróticos y definida como la infección del líquido ascítico en ausencia de una fuente aparente de infección intra-abdominal13, 14. La ascitis de los pacientes cirróticos con PBE contiene concentraciones elevadas de mediadores proinflamatorios que probablemente derivan de células residentes en el peritoneo, como por ejemplo macrófagos y células mesoteliales. Esta hipótesis proviene de datos experimentales que demuestran que la concentración en la ascitis de pacientes cirróticos de interleucina-6 (IL6) y de factor de necrosis tumoral- (TNF-) es marcadamente superior a la concentración plasmática15. A pesar de la eficacia terapéutica del tratamiento antibiótico, el índice de mortalidad en estos pacientes sigue siendo elevado. La patogénesis de este fenómeno es incierta pero algunas hipótesis sugieren que mediadores vasculares liberados por células residentes en la cavidad peritoneal durante el transcurso de la PBE, podrían acentuar la vasodilatación arterial presente en los enfermos cirróticos y, como contrapartida, activar sistemas vasoactivos compensatorios que conducirían a la vasoconstricción renal. La concentración de citocinas y NOx en la ascitis de los pacientes cirróticos varía ampliamente en función de si estos individuos presentan o no PBE o si el tratamiento antibiótico ha resuelto recientemente la peritonitis5. La concentración de TNF- e IL-6 es diez veces superior en ascitis de pacientes con PBE que en la de los pacientes cirróticos sin PBE. Sin embargo, la concentración de citocinas en la ascitis de los sujetos que han recibido tratamiento antibiótico, y en los que por tanto se ha resuelto la PBE, es similar a la observada en los pacientes cirróticos con ascitis no infectada. Los cambios de concentración en líquido ascítico de NOx no siguen el mismo patrón. Los pacientes cirróticos con PBE presentan niveles de NOx superiores a los valores obtenidos en los pacientes cirróticos sin peritonitis; sin embargo, la resolución de la PBE no se asocia a una disminución en la concentración de NOx. Por el contrario, los valores más elevados de NOx en el líquido ascítico se alcanzan tras la resolución de la PBE. Estos hallazgos son similares a los obtenidos por Bories y cols.12 en los que se demuestra que las concentraciones más elevadas de NOx se alcanzan una semana después del inicio de la PBE. Estudios inmunocitoquímicos han demostrado que en NOx encontrado en el líquido ascítico de los pacientes cirróticos con PBE es producido por lo macrófagos peritoneales5 y que la liberación de NOx es superior cuando las células provienen de pacientes con una PBE resuelta. Por el contrario, los macrófagos aislados a partir de la ascitis de pacientes cirróticos sin PBE no producen NOx. Paralelamente a los datos obtenidos en los estudios de producción de NO, el análisis de la expresión del ARN mensajero y de la proteína de iNOS ha demostrado una activación importante de iNOS en los macrófagos peritoneales de los pacientes cirróticos con PBE, siendo ésta más prominente en los macrófagos aislados de pacientes con PBE resuelta. Estudios realizados en nuestro laboratorio demuestran que la inducción del enzima iNOS juega un papel fundamental para prevenir el desarrollo de peritonitis en ratas cirróticas con ascitis16. Es razonable pensar, por tanto, que la síntesis peritoneal de NO contribuiría al control de la PBE en la cirrosis hepática humana. PRODUCCIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR (VEGF) MEDIADA POR MACRÓFAGOS PERITONEALES DE PACIENTES CIRRÓTICOS El VEGF-A es una familia de glicoproteínas constituida por diferentes isoformas (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206) que se sintetizan mediante un proceso de splicing alternativo post-transcriptional a partir de un gen único. Se han identificado cinco genes relacionados estructuralmente con VEGF-A que se denominan: VEGF-B, VEGF-C, VEGFD, VEGF-E y VEGF-F, y de los cuales las formas C y D son necesarias durante el proceso de linfoangiogénesis17, 18. El VEGF-A induce proliferación, citoprotección y migración celular en el endotelio, a través de la activación de sus receptores específicos flt-1, KDR/flk-1 y flt-4. Además, está descrito que este factor de crecimiento es un potente inductor de la permeabilidad vascular y actúa como agente vasodilatador in vivo19, 20. El VEGF-A es producido por una gran variedad de células en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas (macrófagos, células musculares lisas vasculares, queratinocitos, fibroblastos, células epiteliales, células mesangiales, etc.). En concreto, dos estudios realizados en pacientes cirróticos3,6 han demostrado que los macrófagos peritoneales humanos producen VEGF en condiciones basales y que el tratamiento de estas células con lipopolisacárido (LPS), TNF- o IL-1 incrementa significativamente la producción de VEGF-A en comparación con la producción basal. Además, el tratamiento combinado con estos tres agentes provoca una respuesta acumulativa en la producción de VEGF-A. Este incremento se correlaciona directa59 M. MORALES-RUIZ y cols. mente con un aumento significativo en la expresión y en la estabilidad del ARN mensajero de las isoformas 121, 165 y 189 de VEGF. Paralelamente, los macrófagos extraídos de pacientes con PBE también producen VEGF en condiciones basales y en respuesta al tratamiento combinado con LPS, TNF-, e IL-1, aunque este efecto es de menor intensidad que la respuesta observada en las células de pacientes cirróticos sin PBE. Es importante destacar que este incremento en la producción de VEGF-A en respuesta al tratamiento con LPS y citocinas no se observa en los monocitos circulantes de sujetos sanos. El análisis inmunocitoquímicos realizados con anticuerpos anti-VEGF-A también demostró que la expresión de VEGF-A es exclusiva de los macrófagos y no se detecta en otros tipos celulares característicos de la ascitis, como son los eritrocitos, los linfocitos, o los leucocitos polimorfonucleares. El significado clínico de estos resultados ha sido analizado midiendo la concentración de VEGF-A en la ascitis y el plasma de pacientes cirróticos con o sin PBE. No se observaron diferencias significativas entre las concentraciones plasmáticas de VEGF-A de sujetos sanos y de pacientes cirróticos con o sin PBE. Sin embargo, se detectaron concentraciones elevadas de VEGF-A en el líquido ascítico de los pacientes cirróticos con PBE pero no en los pacientes cirróticos sin peritonitis bacteriana. Los experimentos de proliferación diseñados para determinar si el VEGF-A acumulado en el líquido ascítico tiene actividad biológica, mostraron que la ascitis de pacientes cirróticos sin PBE ejercía un discreto efecto proliferativo sobre las células endoteliales humanas (HUVEC). Sin embargo, la ascitis o el medio condicionado de macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos con PBE incrementaron la proliferación de células HUVEC. Este fenómeno fue inhibido al incluir en las condiciones experimentales anticuerpos anti-VEGF-A. Los datos anteriores, junto con los experimentos que demuestran que los monocitos circulantes de sujetos sanos y de pacientes cirróticos no producen VEGF-A en condiciones basales, apoyarían la hipótesis de que un incremento en la concentración de VEGF en la ascitis de los pacientes cirróticos, podría tener consecuencias fisiopatológicas en el contexto de la regulación local del tono vascular y de la permeabilidad endotelial. LA HIPOXIA ES UN INDUCTOR DE AGENTES VASODILATADORES ESPLÁCNICOS EN LOS PACIENTES CIRRÓTICOS Los pacientes cirróticos presentan frecuentemente niveles anormales de O2 en sangre. De acuerdo con diferentes artículos, la concentración arterial de O2 60 se encuentra reducida entre el 20% y el 60% de estos pacientes21,22, siendo la prevalencia de esta anomalía más alta en pacientes con cirrosis severa23. Lo mismo ocurre en la cavidad peritoneal, donde la concentración media de O2 en la ascitis de pacientes cirróticos sin PBE es del 7% ± 0,3%4. La disminución tisular en la concentración de O2 induce una respuesta celular adaptativa que consiste en la regulación de determinados genes que ayudarán a compensar esta deficiencia (por ejemplo: VEGFA, adrenomedulina y endotelina-1). La inducción de estos genes por hipoxia está mediada principalmente por el factor de transcripción HIF-1. El HIF-1 es una proteína heterodimérica que está formado por 2 subunidades: HIF-1 de expresión constitutiva y HIF-1 que se degrada en condiciones de normoxia. Sin embargo, la proteína de HIF-1 se estabiliza en condiciones de hipoxia, hecho que permite la dimerización con HIF-1 y la activación de HIF-1. Este factor de transcripción se une específicamente a secuencias denominadas elementos de respuesta a hipoxia, que están localizadas en la región promotora de los genes expresados en estas condiciones24. Los macrófagos son células especialmente sensibles a los niveles de O2. Por ejemplo, diversos estudios han descrito que la hipoxia produce grandes cambios en la actividad secretora de estas células, induciendo la liberación de citocinas y agentes angiogénicos25. Cejudo y cols.4, analizaron la síntesis de sustancias vasoactivas reguladas por hipoxia en monocitos y macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos con ascitis. En este trabajo se prueba que los monocitos circulantes de los pacientes cirróticos producen endotelina-1 (ET-1) y que esta producción se incrementa en condiciones de hipoxia. En contraste, los macrófagos peritoneales de estos pacientes liberaron cantidades significativas de VEGF-A y adrenomedulina (ADM), pero no se detectó la producción del vasocontrictor ET-1. Es importante destacar que la incubación de estas células en hipoxia reguló positivamente la secreción de VEGF-A y ADM. Los estudios moleculares demostraron que la hipoxia causó en los macrófagos peritoneales cultivados in vitro una inducción del ARN mensajero de la ADM y de VEGF-A que se mantuvo durante 24 horas. Esta regulación positiva de ADM y VEGF-A se detectó también en el proceso de transducción proteica. La ADM y el VEGF, a parte de ser importantes sustancias angiogénicas, tienen la propiedad de incrementar la permeabilidad vascular y la vasodilatación y, por tanto, de disminuir la presión arterial y la resistencia vascular en modelos experimentales. Todos estos fenómenos son realizados a través de la activación del NO. Concretamente, en experimentos realizados in vitro, se ha observado que el medio de cultivo de macrófagos peritoneales de pa- ASCITIS Y DISFUNCIÓN VASCULAR EN LA CIRROSIS HEPÁTICA cientes cirróticos cultivados en normoxia estimula la síntesis de NO en células HUVEC. Sin embargo, la concentración de NO detectada en el medio de cultivo de las células HUVEC es mayor cuando las células endoteliales son tratadas con el sobrenadante de los macrófagos de pacientes cirróticos cultivados en hipoxia. Este fenómeno es dependiente de la estimulación de las células endoteliales por VEGF, ya que el tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-A bloquea la producción de NO. En este mismo trabajo se demuestra que los macrófagos peritoneales se encuentran en condiciones de hipoxia en la cavidad peritoneal de los pacientes cirróticos, ya que estas células expresan en condiciones basales la proteína HIF1, y los ARN mensajeros de VEGF y ADM. Por tanto, estos estudios apoyan la hipótesis de que la ADM y el VEGF sintetizados por los macrófagos peritoneales en condiciones de hipoxia podrían actuar como vasodilatadores endógenos que agravarían la vasodilatación arterial esplácnica característica de la cirrosis. CONCLUSIONES En este artículo se ha analizado un aspecto particularmente relevante e inexplorado de la fisiopatología de la ascitis en los pacientes cirróticos. La producción de NO y de factores de crecimiento por células residentes en la cavidad peritoneal podría modificar la respuesta inmune inespecífica, la tonicidad y la permeabilidad vascular en el área esplácnica o en los territorios adyacentes. De la misma manera, el líquido ascítico podría contener sustancias capaces de regular las propiedades moleculares, morfológicas o fisiológicas del endotelio vascular peritoneal. Por lo tanto, sería deseable una mayor caracterización de las propiedades biológicas del líquido ascítico y de sus componentes celulares, para posibilitar el diseño de estrategias futuras más efectivas en el tratamiento de las complicaciones severas que aparecen durante el transcurso de la historia natural de la cirrosis. BIBLIOGRAFÍA 1. Bosch J, García-Pagán JC: Complications of cirrhosis. I. Portal hypertension. J Hepatol 32 (Supl. 1): 141-156, 2000. 2. Arroyo V, Ginés P, Jiménez W, Rodés J. Renal function in liver diseases. En: Bircher J, Benhamou JP, McIntyre N, Rizzetto M, Rodés J, eds: Oxford Textbook of Clinical Hepatology. Oxford Medical Publications, Oxford: 733-761, 1999. 3. Cejudo-Martín P, Ros J, Navasa M y cols.: Increased production of vascular endothelial growth factor in peritoneal macrophages of cirrhotic patients with spontaneous bacterial peritonitis. Hepatology 34: 487-493, 2001. 4. Cejudo-Martín P, Morales-Ruiz M, Ros J y cols.: Hypoxia is an inducer of vasodilator agents in peritoneal macrophages of cirrhotic patients. Hepatology 36: 1172-1179, 2002. 5. Jiménez W, Ros J, Morales-Ruiz M y cols.: Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression in peritoneal macrophages of cirrhotic patients. Hepatology 30: 670-676, 1999. 6. Perez-Ruiz M, Ros J, Morales-Ruiz M y cols.: Vascular endothelial growth factor production in peritoneal macrophages of cirrhotic patients: regulation by cytokines and bacterial lipopolysaccharide. Hepatology 29: 1057-1063, 1999. 7. Pruimboom WM, Bac DJ, van Dijk AP y cols.: Levels of soluble intercellular adhesion molecule 1, eicosanoids and cytokines in ascites of patients with liver cirrhosis, peritoneal cancer and spontaneous bacterial peritonitis. Intv J Immunopharmacol 17: 375-384, 1995. 8. MacMicking JD, Nathan C, Hom G y cols.: Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Cell 81: 641-650, 1995. 9. De Maria R, Cifone MG, Trotta R y cols.: Triggering of human monocyte activation through CD69, a member of the natural killer cell gene complex family of signal transducing receptors. J Exp Med 180: 1999-2004, 1994. 10. Vouldoukis I, Riveros-Moreno V, Dugas B y cols.: The killing of Leishmania major by human macrophages is mediated by nitric oxide induced after ligation of the Fc epsilon RII/CD23 surface antigen. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7804-7808, 1995. 11. Guarner C, Soriano G, Tomás A y cols.: Increased serum nitrite and nitrate levels in patients with cirrhosis: relationship to endotoxemia. Hepatology 18: 1139-1143, 1993. 12. Bories PN, Campillo B, Azaou L, Scherman E: Long-lasting NO overproduction in cirrhotic patients with spontaneous bacterial peritonitis. Hepatology 25: 1328-1333, 1997. 13. Guarner C, Soriano G: Spontaneous bacterial peritonitis. Semin Liver Dis 17: 203-217, 1997. 14. Rimola A, Navasa M: Infections in liver disease. En: Bircher J, Benhamou JP, Mc Intyre N, Rizzetto M, Rodes J, eds. Oxford Texbook of Clinical Hepatology. Oxford University Press, Oxford: 1862-1874, 1999. 15. Navasa M, Follo A, Filella X y cols.: Tumor necrosis factor and interleukin-6 in spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: relationship with the development of renal impairment and mortality. Hepatology 27: 1227-1232, 1998. 16. Morales-Ruiz M, Jiménez W, Ros J y cols.: Nitric oxide production by peritoneal macrophages of cirrhotic rats: a host response against bacterial peritonitis. Gastroenterology 112: 2056-2064, 1997. 17. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J. 13: 9-22, 1999. 18. Jussila L, Alitalo K. Vascular growth factors and lymphangiogenesis. Physiol Rev 82: 673-700, 2002. 19. Bates DO, Lodwick D, Williams B: Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation 6: 83-96, 1999. 20. Ferrara N, Davis-Smyth T: The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev 18: 4-25, 1997. 21. Agustí AG, Roca J, Rodríguez-Roisín R. Mechanisms of gas exchange impairment in patients with liver cirrhosis. Clin Chest Med 17: 49-66, 1996. 22. Moller S, Hillingso J, Christensen E, Henriksen JH. Arterial hypoxaemia in cirrhosis: fact or fiction? Gut 42: 868-874, 1998. 23. Vachiery F, Moreau R, Hadengue A y cols.: Hypoxemia in patients with cirrhosis: relationship with liver failure and hemodynamic alterations. J Hepatol 27: 492-495, 1997. 24. Semenza GL: HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol 88: 1474-1480, 2000. 25. Lewis JS, Lee JA, Underwood JC, Harris AL, Lewis CE: Macrophage responses to hypoxia: relevance to disease mechanisms. J Leukoc Biol 66: 889-900, 1999. 61