NEFROLOGÍA. Vol. XXII. Suplemento 5. 2002 Papel del inhibidor del ciclo celular p27 durante el remodelado vascular V. Andrés y A. Díez-Juan Laboratorio de Biología Vascular. Instituto de Biomedicina de Valencia. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Valencia. RESUMEN Las células de la pared arterial presentan normalmente una tasa de proliferación celular muy reducida. Sin embargo, la hiperplasia de células vasculares es una característica del remodelado vascular inducido por diversos estímulos fisiopatológicos (por ejemplo, neovascularización, arteriosclerosis y re-estenosis post-angioplastia). El avance en el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan el crecimiento celular en la pared vascular puede facilitar el desarrollo de terapias anti-proliferativas para el tratamiento de la patología vascular obstructiva. En esta revisión se discuten estudios recientes que demuestran el papel de la proteína supresora de crecimiento p27 durante el remodelado vascular. INTRODUCCIÓN La arteriosclerosis y las enfermedades cardiovasculares asociadas (por ejemplo, infarto de miocardio e infarto cerebral) ocupan el primer lugar entre las causas de mortalidad y morbilidad en países industrializados, siendo su prevalencia significativamente superior en pacientes con insuficiencia renal grave en comparación con la población general. Se acepta que la arteriosclerosis es un complejo proceso inflamatorio de naturaleza multifactorial en el que intervienen varios tipos celulares1 . Diversos factores de riesgo cardiovascular --genéticos y modificables-- desencadenan un proceso de disfunción endotelial que determina la adhesión de leucocitos a la pared arterial y su proliferación. Estas células liberan citoquinas que provocan una respuesta proliferativa y migratoria del miocito liso vascular (MLV) de la túnica media. Además, el MLV «activado» produce gran cantidad de componentes de la matriz extracelular que se acumulan en la placa ateromatosa. En la fase aguda de la enfermedad, la ruptura del ateroma y los procesos trombóticos ocasionan accidentes isquémicos agudos2 . Si bien la derivación ortocoronaria y la angioplastia resultan inicialmente muy eficientes para la revascularización de tejidos isquémicos, su eficacia a largo plazo se ve comprometida en un número elevado de pacientes. Así, el 25-40% de los pacientes que se someten a angioplastia sufren la reoclusión (re-estenosis) de la arteria afectada, típicamente en un plazo de 2 a 12 meses1 . Se acepta que la proliferación celular excesiva en la pared arterial es un factor importante en la re-estenosis post-angioplastia y durante la oclusión arterial en pacientes sometidos a derivación ortocoronaria1 , 3 . La proliferación celular en organismos eucariotas requiere la actividad de holoenzimas constituidos por una subunidad catalítica, denominada quinasa dependiente de ciclina (CDK, cyclin-dependent kinase), y una subunidad reguladora denominada ciclina 4. Durante las diferentes fases del ciclo celular se fosforilan substratos celulares gracias a la activación coordinada de diversos complejos CDK/ciclina. La actividad de los holoenzimas CDK/ciclina se inhibe por medio de su interacción con proteínas de la familia CKI, las cuales se clasifican en las subfamilias CIP/KIP (p21, p27 y p57) e INK4 (p15, p16, p18, p19) 4. El balance neto entre los niveles de CDKs, ciclinas y CKIs constituye un importante mecanismo de control del ciclo celular. p27 Y NEOVASCULARIZACIÓN La formación de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización) juega un papel clave durante diversos procesos fisiológicos y patológicos. Diversos estudios han demostrado la presencia de microvasos en la placa de ateroma humano 5-8, observándose una neovascularización más prevalente en la neoíntima de arterias con mayor grado de estenosis y mayor incidencia de rotura del ateroma 9. Zhang y cols. observaron la ausencia de microvasos en el 97% de ateromas coronarios humanos con una relación íntima/media inferior a 0,54, mientras que el 98% de las arterias con íntima/media superior a 0,54 mostraron neovascularización6. Utilizando un modelo de arteriosclerosis experimental, Moulton y cols.10 han demostrado que la administración de inhibidores del proceso de neovascularización (en17 V. ANDRÉS y A. DÍEZ-JUAN dostatina y TNP-470) reduce significativamente el tamaño del ateroma. Estos estudios sugieren que la neovascularización de la placa ateromatosa puede jugar un papel determinante durante la patología de arteriosclerosis. La neovascularización requiere el remodelado de la matriz extracelular y la proliferación y migración de células endoteliales. Estudios recientes de nuestro laboratorio sugieren que la CKI p27 es un inhibidor del proceso de neovascularización 11. Mediante la utilización de vectores adenovirales, demostramos que la sobreexpresión inducible de p27 inhibe significativamente la proliferación y migración de células endoteliales de cordón umbilical humano en cultivo. Además, la capacidad de estas células para formar estructuras tubulares sobre Matrigel disminuye en presencia de niveles elevados de p27. De acuerdo con estos resultados, la sobreexpresión inducible de p27 inhibió la recuperación del flujo sanguíneo y la formación de neocapilares en un modelo murino de isquemia quirúrgica. p27 Y RE-ESTENOSIS Se ha demostrado que el remodelado vascular en arterias sometidas a angioplastia se caracteriza por una fase inicial de proliferación del MLV, seguida del re-establecimiento del fenotipo quiescente en un plazo de tiempo variable, dependiendo del modelo animal (típicamente 2-4 semanas). Estudios recientes sugieren que p27 contribuye a este bloqueo proliferativo: 1) cultivos de MLVs quiescentes muestran un gran aumento de los niveles de p27 unida a CDK2, fenómeno que se asocia con la inhibición de la actividad CDK2, represión transcripcional del promotor de ciclina A e inhibición de la proliferación celular 12, 13; 2) el retorno al estado quiescente del MLV en fases posteriores del remodelado vascular post-angioplastia se asocia con la inducción de p27, fenómeno que puede contribuir al cese de proliferación en estas células 12, 14. De acuerdo con esta hipótesis, la terapia génica basada en la sobre-expresión de p27 mediante adenovirus recombinantes reduce el desarrollo de la lesión neoíntima en diversos modelos de angioplastia experimental 12, 15. Lamphere y cols., han demostrado recientemente que proteínas quiméricas p27-p16 muestran una mayor actividad antiproliferativa en comparación con p27 y p16, sugiriendo su mayor eficacia en abordajes de terapia génica para el tratamiento de re-estenosis 16. El factor de crecimiento fibrobástico básico (bFGF) juega un papel clave en la proliferación inicial del MLV de la túnica media en las fases tempranas post-angioplastia 17-19. Por el contrario, el tra18 tamiento con anticuerpos que neutralizan la acción de bFGF no inhibe la proliferación del MLV de la lesión neoíntima que se desarrolla en fases posteriores 20, y la infusión con bFGF sólo aumenta ligeramente la proliferación de MLVs presentes en la lesión 17, 19. Esta respuesta proliferativa atenuada del MLV de la lesión ocurre a pesar de la activación robusta de la vía de señalización de MAPK y de la inducción de reguladores positivos del ciclo celular (por ejemplo, ciclina D, ciclina E, CDK2 y CDK4) 19. La respuesta diferencial del MLV de la media y de la lesión se correlaciona con diferencias en los niveles de p27, de modo que su expresión es muy elevada en MLVs aislados a partir de lesión neoíntima en comparación con MLVs de la túnica media19. Además, la infusión de bFGF no reduce la expresión de p27 en arterias con lesiones establecidas19. p27 y ARTERIOSCLEROSIS La proliferación celular en la pared arterial se ha observado en todas las fases de desarrollo de la lesión arteriosclerótica 1, 21, si bien estudios con conejos hiperlipidémicos han demostrado una correlación inversa entre el tamaño de la lesión y el índice de proliferación arterial 22-24. Estos estudios sugieren que la respuesta proliferativa en la pared arterial ocurre fundamentalmente durante las fases iniciales del proceso aterogénico. Tanner y cols.14 han sugerido la existencia de una correlación inversa entre los niveles de p27 y la tasa de proliferación del MLV en ateroma humano. Ihling y cols.25 también observaron expresión de p27 en lesiones ateromatosas humanas, sugiriendo que p27 puede jugar un papel importante en el efecto antiproliferativo del TGF-1 en la placa arteriosclerótica. Los estudios anteriores sugieren la importancia de p27 en la regulación de la proliferación celular en el ateroma. Estudios recientes de nuestro laboratorio demuestran una relación causa-efecto entre p27 y la arteriosclerosis inducida por dieta hipercolesterolemiante 26. Utilizamos en nuestro estudio ratones deficientes en p27, los cuales presentan un aumento de proliferación celular asociado con gigantismo e hiperplasia de diversos órganos 27-29. Teniendo en cuenta que el ratón es poco susceptible al desarrollo de ateromas 30, cruzamos ratones deficientes en p27 y ratones deficientes en apolipoproteína E (apoE) para obtener animales con diferentes dotaciones de p27 en un entorno de predisposición al desarrollo de ateromas. Estudios previos han demostrado que la ausencia de apoE en el ratón induce hipercolesterolemia y arteriosclerosis espontánea, proceso que se acelera con una dieta aterogénica 30. Los anima- PAPEL DEL INHIBIDOR DEL CICLO CELULAR P27 DURANTE EL REMODELADO VASCULAR les carentes de p27 y con una dotación normal de apoE (apoE+/+p27-/-) no desarrollaron hipercolesterolemia y no mostraron ateromas. Por el contrario, los tres grupos de ratones apoE-/- desarrollaron una hipercolesterolemia severa, que no se vio afectada por la dotación de p27. En concordancia con numerosos estudios previos, la ausencia de apoE provocó la aparición de ateromas, principalmente en el cayado de la aorta. Los ratones apoE-/- con uno o dos alelos de p27 inactivados (apoE-/-p27+/- y apoE/-p27-/-, respectivamente) mostraron un aumento progresivo en la severidad del proceso aterogénico. En conjunto, estos estudios sugieren que el desencadenante de la arteriosclerosis es la hipercolesterolemia, lograda en este modelo animal mediante la inactivación de apoE, y no la ausencia de p27. Así, los ratones apoE+/+p27-/- alimentados con la dieta aterogénica mantienen niveles normales de colesterol y no desarrollan arteriosclerosis. Sin embargo, la inactivación total de p27 en ratones hiperlipidémicos acelera significativamente el proceso aterogénico, observándose un fenotipo intermedio en ratones con un único alelo de p27 inactivo. Por medio de técnicas de inmunohistoquímica comprobamos que el aumento de arteriosclerosis en los ratones apoE/-p27-/- se asocia con un incremento en la tasa de proliferación de macrógafos y MLVs. Estos estudios demuestran una relación causal entre el descenso en el nivel de expresión de p27 y el desarrollo de la placa de ateroma. Estudios futuros deberán investigar la pauta de expresión temporal y espacial de p27 en diferentes fases del desarrollo del ateroma, tanto en modelos de arteriosclerosis experimental como en tejido arterial humano. BIBLIOGRAFÍA 1. Ross R: Atherosclerosis: an inflammatory disease. N Engl J Med 340: 115-126, 1999. 2. Fuster V, Badimón L, Badimón JJ, Chesebro JH: The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engl J Med 326: 242-250, 1992. 3. Libby P, Tanaka H: The molecular basis of restenosis. Prog. Cardiovasc Dis 40: 97-106, 1997. 4. Graña X, Reddy EP: Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 11: 211-219, 1995. 5. Barger AC, Beeuwkes R, 3rd, Lainey LL, Silverman KJ: Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. 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