NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Número 1. 2001 La ciclosporina A inhibe la respuesta de la permeabilidad osmótica al agua a la hormona antidiurética en la vejiga del sapo y a la angiotensina II y hormona antidiurética en piel de sapo J. C. Santos, M. Peral de Bruno1, S. Jerez y A. Coviello Fundación INELCO, Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo. 1Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO). Universidad Nacional de Tucumán. Tucumán. Argentina. RESUMEN El objeto del presente trabajo fue evaluar los efectos de la ciclosporina A (CyA) en la respuesta del flujo osmótico de agua de la vejiga aislada de sapo a la arginina-vasotocina (AVT) y a la angiotensina II (Ang II) y AVT en piel aislada de sapo. La CyA añadida al lado dérmico de la piel aislada de sapo o al lado seroso de la vejiga en concentraciones de 0,42. 10-6M a 0,42. 10-7M no tuvo efecto en la permeabilidad osmótica basal (Posm) pero inhibió la respuesta hormonal a la AVT en ambas membranas (AVT 10-10M en vejiga de sapo y 10-8 a 10-9M en piel de sapo). La CyA también inhibió la respuesta de la Posm a la Ang II (10-7M) en piel de sapo en concentraciones de 0,42. 10-6M y 0,42. 10-7M. En vejiga de sapo pudo demostrarse que el efecto inhibitorio fue reversible. La CyA en concentraciones de 0,42. 10-6M inhibió la respuesta de la Posm en piel de sapo a la teofilina (3,2. 10-3M) y al dibutiril AMP cíclico (6,2. 10-3M) sugiriendo un efecto distal a la generación de AMP cíclico. Estas respuestas apoyarían la posibilidad de un efecto diurético en el nefrón de los mamíferos. Palabras clave: Ciclosporina A. Hormona antidiurética. Angiotensina II. Permeabilidad osmótica. Vejiga y piel de sapo. CICLOSPORINE A INHIBITS THE OSMOTIC WATER FLOW RESPONSE OF ISOLATED TOAD BLADDER TO ARGININE-VASOTOCIN AND TO ANGIOTENSIN II AND ARGININE-VASOTOCIN IN ISOLATED TOAD SKIN SUMMARY The purpose of the present study was to assess the effects of cyclosporine A (CyA) in the osmotic water flow response of isolated toad bladder to arginine-va- Recibido: 27-IV-2000. En versión definitiva: 24-X-2000. Aceptado: 27-X-2000. Correspondencia: Dr. Alfredo Coviello Fundación INELCO Av. Mitre, 35 4000 Tucumán (Argentina) E-mail: acoviello@tucbbs.com.ar 59 J. C. SANTOS y cols. sotocin (AVT) and to angiotensin II (Ang II) and AVT in isolated toad skin. CyA added to the dermal side of isolated toad skin or to the serosal side of toad bladder in concentrations of 0.42. 10-6M to 0.42. 10-7M had no effect on basal osmotic water permeability (Posm) but inhibited the hormonal response to AVT in both membranes (AVT 10-10M in toad bladder and 10-8 to 10-9M in toad skin). CyA also inhibited the Posm response to Ang II (10-7M) in toad skin in concentrations of 0.42. 10-6M and 0.42. 10-7M. In toad bladder it could be demonstrated that the inhibitory effect was reversible. CyA in concentrations of 0.42. 10-6M inhibited the Posm response of toad skin to theophylline (3.2. 10-3M) and to dibutyryl cyclic AMP (6.3. 10-3M) suggesting an effect distal to the generation of cyclic AMP. These responses would support the possibility of a diuretic effect in the mammalian nephron. Key words: Cyclosporine A. Antidiuretic hormone. Angiotensin II. Osmotic permeability. Toad bladder and skin. INTRODUCCIÓN La ciclosporina A (CyA), una droga inmunosupresora potente que es ampliamente usada, ha mejorado grandemente la sobrevida de los pacientes trasplantados 1. La droga produce hipertensión 2 y tiene efectos nefrotóxicos 3. Estos efectos están en parte mediados por la liberación de endotelina 4-6 y efectos tóxicos directos en las células tubulares proximales 7, 8. Los efectos renales de la CyA en el transporte tubular incluyen inhibición de la ATPasa-Na+, K+, el cotransportador Na+, K+, 2Cl- en células MDCK 9 y estimulación del transporte de Na+ en la piel aislada de rana 10. En voluntarios humanos con repleción salina 11 una dosis terapéutica de 12 mg/kg y otra supraterapéutica de 30 mg/kg administradas por vía oral produjeron en forma aguda un aumento de la presión arterial acompañado por un efecto antidiurético con disminución de la excreción de agua libre. No hubo cambios en la excreción de sodio, filtración glomerular, flujo plasmático renal o niveles plasmáticos de vasopresina sugiriendo un efecto tubular. En experimentos realizados en perros 12 una dosis de 20 mg/kg/día de ciclosporina por vía oral durante 8 días redujo, ante una expansión de volumen con solución salina durante una hora el flujo máximo de orina, la depuración de alguna libre y la excreción fraccional de sodio sin cambios en la filtración glomerular pero con aumento del flujo sanguíneo renal en los animales tratados con ciclosporina. El propósito del presente trabajo fue evaluar los efectos de la CyA en un modelo funcional del nefrón distal de los mamíferos, la piel y vejiga del sapo 13. En la piel del sapo la angiotensina II (Ang II) y la arginina vasotocina (AVT, la hormona antidiurética que se encuentra naturalmente en los Anfibios) aumentan la permeabilidad osmótica al agua (Posm) 14 a través 60 de un receptor común 15, 17 acoplado a la producción de AMP cíclico 16 que difiere del receptor de la vejiga en el cual solamente la AVT tiene efecto. MATERIAL Y MÉTODOS Se usaron sapos (Bufo arenarum) hidratados por inmersión en agua corriente la noche antes del experimento. Después de la destrucción encefalomedular mediante un estilete se disecó la piel ventral pélvica y se la dividió en dos mitades simétricas que se montaron (con la parte dérmica hacia fuera) en el extremo de tubos plásticos (área de la superficie 1,77 cm2) y se los sumergió en un baño de 10 ml de solución de Ringer en la cual se hacía burbujear aire. La superficie epidérmica interna se bañó con la misma solución diluida 1/5 en agua destilada y la Posm se midió gravimétricamente pesando el tubo después de un cuidadoso secado en una balanza (Mettler H10) con una aproximación de 0,1 miligramo. Una de las mitades de la piel quedó como control para observar la respuesta a la Ang II, AVT, teofilina o dibutiril AMP cíclico y la otra mitad como experimental para estudiar el efecto de la CyA en la respuesta a las hormonas y drogas mencionados (fig. 1). Previamente se realizó un período de equilibración de una hora durante el cual los baños se cambiaron dos veces y luego dos períodos control de 20 minutos. A continuación se añadió la hormona o droga a ambas mitades al lado dérmico de la preparación. En la mitad experimental se añadió CyA 10 minutos antes durante el período control previo también al lado dérmico. El efecto de las hormonas y drogas se siguió hasta tres períodos de 20 minutos. Una concentración similar de etanol usada para disolver la CyA se añadió al baño externo de la preparación control. CICLOSPORINA A EN VEJIGA Y PIEL DE SAPO CONTROL Equilibración 60 min Control 20 min Control 20 min Alcohol 20 min Angiotensina II Arginina-vasotocina Teofilina AMP cíclico 20 min 20 min EXPERIMENTAL Equilibración 60 min Control 20 min Control 20 min CyA 20 min Angiotensina II Arginina-vasotocina Teofilina AMP cíclico 20 min 20 min Fig. 1.--Esquema del diseño experimental. CyA, ciclosporina A. En los experimentos con vejiga, se montaron cada una de las dos hemivejigas en tubos separados con la superficie serosa hacia fuera. El interior fue llenado con 1 ó 2 ml de Ringer diluido 1/5 en agua destilada y la preparación sumergida en un baño de 10 ml de Ringer aereado. Se siguió un protocolo similar al de la piel, quedando una hemivejiga como control y la otra como experimental a la que se añadió CyA. Después de registrar el efecto de la AVT se procedió a lavar la preparación dos veces durante una hora. Se realizó un nuevo período control para verificar el retorno de la permeabilidad basal a los valores previos y se añadió nuevamente AVT a ambas hemivejigas, puede verificar la recuperación de la respuesta hormonal. Este protocolo no pudo ser seguido en piel por la taquifilaxia de la misma a una segunda estimulación con Ang II o AVT. En piel los resultados se expresan en mg.cm-2.h-1 y en vejiga en ml.min. El efecto hormonal (Ang II o AVT) o de la droga (teofilina o dibutiril AMP cíclico) fue obtenido entre la diferencia del período después del añadido de la misma y el período control precedente para cada par de piel o hemivejiga. Ambos efectos, uno sin y el otro con el añadido de CyA fueron comparados con test de t de Student para muestras pareadas (nivel de significación p < 0,05) y los resultados expresados como media y error estándar (E.S.). La solución de Ringer usada contenía (mM) NaCl 90, KCI 2, MgSO4 1, CaCl2 1, Tris-HCI buffer 25, glucosa 5; pH 7,4; 220 mOsm/kg H2O. Drogas. Angiotensina II (angiotensina II de piel de rana) (Ala-Pro-Gly [IIe3, Val5] angiotensina II, hormona antidiurética (arginina-vasotocina), teofilina y dibutiril AMP cíclico fueron obtenidos de Sigma, St. Louis, Mo, USA. La ciclosporina A fue donada por Novartis Pharma AG, Basel, Suiza. RESULTADOS La CyA (0,42. 10-6M) produjo una inhibición significativa (p < 0,01) del 24% en la respuesta de la Posm a la AVT (10-10M) en la vejiga aislada del sapo. Después de una hora de lavado ambas hemivejigas tuvieron una respuesta similar (fig. 2) mostrando una recuperación total de la inhibición. En este tejido la Ang II no tiene efecto en la Posm. La CyA en estas concentraciones no tuvo efecto en la Posm basal en la vejiga (control 0,1 ± 0,1, experimental 0,2 ± 0,2 mg. min, diferencia 0,1 ± 0,2, N.S., N = 14) y en la piel del sapo (control 1,2 ± 3,2, experimental 4,2 ± 3,9 mg.cm-2.h-1, diferencia 5,4 ± 4,1, N.S., N = 21). En la piel aislada del sapo la CyA (0,42. 10-10M) inhibió significativamente en un 24% a los 20 min (p < 0,001) y en un 20% a los 40 min (p < 0,01) 61 J. C. SANTOS y cols. EFECTO MEDIO ± ES (mg.min) 14 12 10 8 6 4 2 0 (11) < 0,01 (11) N.S. EFECTO MEDIO ± E.S. (mg.cm-2.h-1) 20 15 < 0,05 10 5 0 -5 -10 20 (15) N.S. AVT 10-9M IDEM + CyA 0,42 10-5M AVT 10-10M IDEM+ CyA 0,42 10-6M 1 L AVA D O 2 Período 40 MIN Fig. 2.--Efecto de la ciclosporina A (CyA 0,42. 10-6M) en la respuesta de la vejiga aislada del sapo a la hormona antidiurética (AVT 10-10M) en la permeabilidad osmótica al agua. Después del lavado la respuesta de ambas hemivejigas fue probada con una concentración similar de AVT en ausencia de CyA. Número de experimentos entre paréntesis. Fig. 4.--Efecto de la ciclosporina A (CyA 0,42. 10-5M) en la respuesta de la piel aislada del sapo a la hormona antidiurética (AVT 10-9M) en la permeabilidad osmótica al agua. El efecto fue seguido durante dos períodos de 20 minutos. Número de experimentos entre paréntesis. EFECTO MEDIO ± E.S. (mg.cm-2.h-1) EFECTO MEDIO ± E.S. (mg.cm-2.h-1) 200 175 150 125 100 75 50 25 0 20 (9) < 0,01 < 0,001 AVT 10-8M IDEM + CyA 0,42 10-6M 20 (17) 15 10 5 0 -5 -10 < 0,01 (15) < 0,05 ANG II 10-7M IDEM + CyA 0,42 10-6M IDEM + CyA 0,42 10-7M 40 MIN Fig. 3.--Efecto de la ciclosporina A (CyA 0,42. 10-6M) en la respuesta de la piel aislada del sapo a la hormona antidiurética (AVT 10-8M) en la permeabilidad osmótica al agua. El efecto fue seguido durante dos períodos de 20 minutos. Número de experimentos entre paréntesis. Fig. 5.--Efecto de dos concentraciones de ciclosporina A (CyA 0,42. 10-6M y 0,42. 10-7M) en la respuesta de la piel aislada del sapo a la angiotensina II (Ang II 10-7M) en la permeabilidad osmótica al agua. El efecto fue seguido durante 20 minutos. Número de experimentos entre paréntesis. el efecto de la AVT (10-8M) en la Posm (fig. 3). Una concentración 10 veces superior de CyA (0,42. 10-5M) produjo una inhibición del 95% (p < 0,05) de la respuesta de la Posm a una concentración de ACT de 10-9M en los primeros 20 min pero en los 40 min siguientes el efecto de la AVT en la mitad control en estas concentraciones disminuyó notablemente y la inhibición no fue estadísticamente significativa (fig. 4). 62 La respuesta de la Posm en la piel aislada del sapo a la Ang II (10-7M) fue completamente inhibida por la CyA a una concentración de 0,42. 10-6M, mientras que una concentración diez veces menor de CyA produjo una inhibición menor (62%) pero estadísticamente significativa (p < 0,05) del efecto de la Ang II (fig. 5). En la piel aislada del sapo la respuesta de la Posm a la teofilina (3,2. 10-3M) fue inhibida significativa- CICLOSPORINA A EN VEJIGA Y PIEL DE SAPO mente por la CyA (0,42. 10-6M) a los 40 min (55%), la inhibición desapareció en el período siguiente de 20 min (fig. 6). La teofilina no tuvo efecto en la Posm en los primeros 20 min. La respuesta de la Posm de la piel aislada de sapo al dibutiril AMP cíclico (6,3. 10-3M) fue inhibida significativamente a los 20 min en un 72% por la CyA (0,42. 10-6M). La inhibición desapareció en los siguientes 40 min cuando el efecto del AMP cíclico fue mayor (fig. 7). DISCUSIÓN Los presentes resultados muestran un efecto inhibitorio de la CyA en la respuesta de la Posm a la AVT en vejiga de sapo y a la AVT y Ang II en piel de sapo. Estos tejidos son un modelo funcional del nefrón distal de los mamíferos 13. La Ang II estimula la Posm solamente en la piel del sapo a través de un receptor común con la AVT 15, 17. Estos efectos inhibitorios de la CyA en la respuesta hormonal de la Posm en la piel y vejiga de sapo significarían un efecto diurético en el nefrón de los mamíferos. Sin embargo, un efecto antidiurético temprano de la CyA fue comunicado en el hombre 11 y una atenuación de la respuesta diurética a una expansión aguda de volumen en perros 12. Estas diferencias pueden estar relacionadas a los efectos hemodinámicos de la CyA mediados por la liberación de endotelina 6 en el animal entero. La concentración de CyA más baja usada (0,42. 10-7M) que produjo una inhibición de la respuesta a la Ang II en piel de sapo, alrededor de 50 µ/l, es casi la mitad de los niveles terapéuticos usados en los pacientes trasplantados 18. En la vejiga de sapo la respuesta a la AVT se recupera rápidamente después de una hora de lavado, por lo tanto, pudo demostrarse la reversibilidad de la acción inhibitoria de la CyA en esta respuesta. En piel de sapo no pudo seguirse este protocolo debido a la falta de respuesta a una segunda estimulación con AVT o Ang II (taquifilaxia). La CyA en concentraciones de 5,10-6M, una concentración casi diez veces mayor a la máxima usada en los presentes experimentos, estimuló el transporte de Na+ a través de la piel aislada de la Rana esculenta a través de la liberación de prostaglandinas ya que este efecto fue inhibido por un bloqueador de la ciclooxigenasa 10. No se comunicaron efectos en las respuestas hormonales en este tejido. En células MDCK, un modelo del túbulo distal/tubo colector, la CyA en concentraciones elevadas 10-4M y 10-5M aumentó la resistencia paracelular, lo que puede contribuir a la pérdida de soluto y de agua 19. La respuesta de la piel del sapo a la AVT y Ang II es mediada por el AMP cíclico 16. El AMP cíclico es producido por la adenilatociclasa e inactivado por la fosfodiesterasa. La teofilina inhibe la fosfodiesterasa aumentando los niveles de AMP cíclico y produciendo un aumento de la Posm20. Una inhibición de esta respuesta significaría un efecto en la generación de MAP cíclico por la adenilatociclasa. Un efecto inhibitorio de la respuesta de la Posm al AMP cíclico exógeno indicaría una interferencia con los efectos del nucleótido cíclico en la membrana lu63 60 EFECTO MEDIO ± E.S. (mg.cm-2.h-1) 50 40 < 0,01 30 20 10 0 20 40 50 MIN N.S. N.S. TEOFILINA 3,2 10-3M IDEM + CyA 0,42 10-6M Fig. 6.--Efecto de la ciclosporina A (CyA 0,42. 10-6M) en la respuesta de la piel aislada de sapo a la teofinila (3,2. 10-3M) en la permeabilidad osmótica al agua. El efecto fue seguido durante tres períodos de 20 minutos. Número de experimentos entre paréntesis. 60 EFECTO MEDIO ± E.S. (mg.cm-2.h-1) 50 40 30 20 10 0 20 <0 01 11 n s dbampc 6 3 10-3m idem cya 0 42 10-6m 40 min fig 7 --efecto de la ciclosporina a en respuesta piel aislada del sapo al dibutiril amp cíclico permeabilidad osmótica agua el efecto fue seguido durante dos períodos 20 minutos número experimentos entre paréntesis j c santos y cols minal nuestros resultados produjo inhibiciones transitorias teofilina sugiriendo efectos después generación administración crónica rata una reducción reactividad presora vascular ang ii norepinefrina un que puede estar mediado por interferencia con los canales calcio 21 presentes sin embargo inhibición posm avt parece relacionada sistema adenilatociclasa-amp muestran primera vez inhibitorio hormonal vejiga tejidos propiedades funcionales similares nefrón distal mamíferos agradecimientos este trabajo subvencionado subsidios consejo nacional investigaciones científicas técnicas conicet república argentina p i 3008 universidad tucumán 261 106 bibliografía 1 kahan bd: cyclosproine: the agent and its actions transpl proc 27 supl : 5-18 1985 2 bennet wm porter ga: cyclosporine-associated hypertension am med 85: 131-133 1988 koop jb klotman pe: cellular molecular mechanisms of cyclosporin nephrotoxicity soc nephrol 1: 162-179 1990 4 clavell burnett jr jc: physiologic pathophysiologic roles endothelin in kidney curr opin hypertens 3: 66-72 1994 5 haug grill ch schmid-kotsas gruenert jehle pm: endotelin release by rabbit proximal tubule cells: modulatory effect cyclosporine tacrolimus hgf egf int 54: 1626-1636 1998 nassart gm badr kf: disease 86-91 sokol capodagli lc dixon m holohan pd ross cr couldson r jones db: vehicle toxicity primary cultures renal cells physiol 259: c897-c903 8 takeda kobayashi shirato endoud h: induces apoptosis mouse terminal straight tube nephron 80: 121-122 9 deppe ce heering pj tinel h kinne-saffran e grabensee b kinne rk: on na k -atpase 2cl- cotransporter mdck two subtypes ct c11 exp 5: 471-489 1997 10 lippe bellantuono v quaranta castronuovo g cassano ardizzone c: stimulats transport across isolated skin rana esculenta arch biochem 105: 596-602 sturrock nd lang cc struthers ad: cyclosporin-induced precedes disfunction sodium retention man 11: 1209-1216 1993 12 ciresi dl lloyd ma sandberg sm heublein dm edwards bs: retaining effects 41: 1599-1605 1992 13 dicker se: bladder amphibians as models for mammalian hormones 352-363 1970 14 coviello brauckmann es: hydrosmotic angiotensin ii: toad acta latinoam 23: 18-25 1973 15 peral bruno romano l a: interaction between antagonists antidiuretic hormone tissues comp 113a: 307314 1996 16 raisman elso orce g: role cyclic iii response to pharmacol 27: 611-612 1978 17 losartán inhibe hormona antidiurética modelo funcional rev argen cardiol 65 35-38 18 danovitch gm: immunosuppressive medications protocols transplantation in: ed handbook 2nd edition boston: little brown company 88 19 zimmerhackl lb mesa kramer f kohmel wiegele brandis m: tubular influence endothelin-1 culture llc-pk1 pediatr 778-783 orloff handler js: similarity vasopressin adenosine -5 -phosphate theophylline clin invest 702-709 1962 textor sc smith-powll telles t: altered pressor responses ne during administration conscious rats 258: h854-h860 64