La muestra utilizada fue sangre venosa, obteniéndose un mínimo de 6ml (un tubo). Para la toma de la muestra no se requirió ayuno ni condiciones especiales. Teniendo en cuenta que los principales anticoagulantes utilizados en la literatura son heparina y ácido cítrico-dextrosa (ACD)7,12–14, se compararon estos 2 anticoagulantes utilizando tubos Vacutainer conteniendo heparina de sodio o ACD solución B. Adicionalmente, se evaluó la estabilidad de la muestra de sangre total conservada a 4̊C durante 8 y 24h.

Se estandarizó un protocolo de aislamiento de polimorfonucleares a partir de sangre total basado en lo descrito por Levtchenko et al. y las recomendaciones del programa de la European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism7,15. Brevemente, el método consiste en un esquema de separación secuencial utilizando primero dextrano al 5% y posteriormente Ficoll 1119, seguido de la eliminación de glóbulos rojos presentes en la muestra mediante lisis osmótica. El botón obtenido finalmente se resuspendió en una solución de N-etilmaleimida (Sigma 04259) 5,2mM en agua destilada, la cual debe procesarse inmediatamente.

Antes del análisis por cromatografía el botón celular obtenido se somete a rotura por ultrasonido aplicando 4 ciclos de 15s, cada uno a intensidad baja (20%). Posteriormente, la muestra fue desproteinizada mediante adición de solución de ácido sulfosalicílico al 12%. La cuantificación de cistina se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución utilizando un analizador de aminoácidos Biochrom 30. La cuantificación se realiza utilizando como estándar una solución comercial de aminoácidos que contiene cisteína en una concentración de 125μM (Sigma A6282). El control de corrida se realiza utilizando como estándar interno N-leucina (Sigma N6877). El equipo realiza la separación por intercambio aniónico y derivatización poscolumna con ninhidrina realizando lecturas a 537nm. Teniendo en cuenta que se cuantifican las moléculas de cisteína liberadas de los leucocitos, el informe se realiza en nmol 1/2 cistina y se normaliza por la concentración de proteína de la muestra.

El pellet obtenido después de la desproteinización de la muestra se resuspende en NaOH 0.1N y se cuantifica la proteína total utilizando el método de Folin-Lowry frente a la curva de calibración de albúmina sérica bovina (Sigma A2153) entre 0,125 y 3mg/ml16.

Con el fin de establecer valores de referencia en nuestra población, se seleccionaron mediante convocatoria abierta 50 voluntarios sanos adultos sin perjuicio de edad o género, a quienes antes del consentimiento informado se les tomó una muestra de sangre para cuantificar la cistina intraleucocitaria empleando el método establecido. Adicionalmente se validaron los resultados utilizando muestras de 4 pacientes con diagnóstico confirmado de cistinosis.

En los análisis realizados se observó que utilizando como anticoagulante ACD se obtiene una mejor recuperación de los picos cromatográficos y una mejor resolución de fases en la etapa del gradiente de dextrano. Con base en estos resultados, se seleccionó ACD como anticoagulante para el desarrollo del proceso de cuantificación.

Se evaluó la estabilidad de la conservación de la muestra de sangre en 2 condiciones de almacenamiento: 8 y 24h a 4̊C. Los resultados muestran que el almacenamiento de las muestras lleva a falsas disminuciones de la cisteína, la cual se torna indetectable en la mayoría de los casos (tabla 1). Solo la muestra 1, que es la que presenta una concentración más alta de cisteína, mostró valores detectables después de 30h de almacenamiento.

Adicionalmente, en algunas muestras se observó una pérdida en la calidad de la misma, evidenciada por una disminución de la cantidad de proteína total (tabla 1).

Los resultados obtenidos permiten concluir que la muestra de sangre total no es estable, por lo cual debe ser tomada en el lugar donde se realizará el proceso.

Para confirmar la obtención de células polinucleares vs. mononucleares en el paso del ficol se llevó a cabo la cuantificación de fracciones celulares mediante citometría con un equipo DxH 800 de Beckman Coulter, evidenciándose que en la fracción de trabajo para cuantificación la población de células polimorfonucleadas supera el 90% del total celular (91,35-99,44; n=4).

Utilizando el método estándar de cuantificación por HPLC se procesaron estándares de cisteína comercial con concentraciones entre 0 y 0,5mM, rango que cubre incluso las concentraciones de individuos afectados (nivel nmol). La curva final de calibración obtenida muestra una correlación de 99,84% entre concentración de cistina real (preparada) y cistina calculada por HPLC, lo que valida la capacidad de HPLC para detectar con exactitud la concentración de cistina presente en una muestra.

Una vez determinada la concentración de cistina de los voluntarios sanos, se estableció el histograma de frecuencia y se consideró el percentil 90 para establecer como punto de corte 0,34 nmol 1/2 cistina/mg. La dispersión observada es comparable con lo reportado previamente por Gertsman et al., quienes trabajaron con una muestra de 10 pacientes14 (fig. 1A). Adicionalmente, los valores reportados en diferentes estudios oscilan entre 0 y 0,2nmol 1/2 cistina/mg prot aproximadamente, lo que coincide con los resultados de alrededor del 70% de nuestra población2,3,6,15. Es de importancia resaltar que los reportes en literatura en general utilizan poblaciones con muy bajo número de individuos (entre 2 y 30, aproximadamente), lo cual disminuye la probabilidad de encontrar los valores altos vistos en este estudio y que corresponden a solo el 10% de nuestra población.

Figura 1.

Valores de referencia para la población estudiada. A. Histograma de distribución de la concentración de cistina en individuos normales (n=50). B. Concentración de cistina intraleucocitaria en población sana y población afectada.

(0.07MB).

Una vez establecido el protocolo de cuantificación, se determinó la concentración de cistina intraleucocitaria en 4 individuos afectados, un individuo con sospecha de estar afectado y otro individuo heterocigoto (uno de los padres de uno de los pacientes incluidos en el estudio).

Como se muestra en la figura 1B, mientras los niveles de la población sana llegan hasta 0,7nmol 1/2 cistina/mg prot, los valores de los pacientes están por encima, encontrándose niveles entre 1 y 12nmol 1/2 cistina/mg prot. Estos resultados son comparables con lo observado en otros estudios6,7,14,17. Vale la pena aclarar que el paciente cuyo valor fue 1 se encuentra en tratamiento, es más, estos valores son similares a lo reportado por otros autores en pacientes tratados7,17.

Por su parte, la muestra del individuo heterocigoto procesado mostró valores intermedios (1,06nmol 1/2 cistina/mg prot), los cuales caen en la zona gris establecida según los valores de referencia previamente establecidos. Esto concuerda con lo reportado en la literatura, donde los heterocigotos pueden presentar valores que oscilan entre la normalidad y valores que superan hasta 5 veces los puntos de corte, siendo aun así valores más bajos que los observados en pacientes (usualmente más de 10 veces por encima del punto de corte). Finalmente, el individuo en estudio de cistinosis arrojó resultados considerados como normales.

De forma adicional se comprobó la validez de la metodología propuesta, realizando de forma simultánea la determinación de cistina en muestras procesadas por nosotros (laboratorio 1) y por un laboratorio de referencia comúnmente usado para la remisión de muestras desde nuestro país (laboratorio 2). Los resultados que se presentan en la tabla 2 muestran una buena concordancia entre laboratorios, lo que valida el método empleado.