NEFROLOGIA. Vol. XVI. Número 1. 1996 Factores de riesgo e incidencia de seroconversiones del virus de la hepatitis C en pacientes hemodializados. Estudio con diferentes técnicas serológicas J. García-Valdecasas, M. C. Bernal*, F. García*, C. Roldán* y S. Cerezo* Servicio de Nefrología* y Servicio de Microbiología. Hospital Universitario. Granada. RESUMEN Este estudio fue realizado en 107 pacientes hemodializados para determinar la prevalencia de anticuerpos frente al virus de la hepatitis C (VHC), investigados con diferentes técnicas serológicas, así como los factores epidemiológicos asociados con la infección por el VHC. Entre estos factores se analizaron el sexo, edad, historia de transfusiones de sangre, tiempo de duración del tratamiento dialítico y la elevación de los niveles de transaminasas. La prevalencia de anticuerpos en estos pacientes fue del 27 %. El sexo y la edad no mostraron asociación significativa con la presencia de estos anticuerpos. Por el contrario, hubo asociación entre la presencia de anticuerpos y los antecedentes de transfusiones de sangre, cuando éstas fuerón realizadas con anterioridad a la investigación de éstos anticuerpos en los donantes de sangre (p < 0,001), así cómo con el tiempo de duración del tratamiento de diálisis (prevalencia inferior en los pacientes tratados menos de sesenta meses frente a aquellos que llevaban tratados más de sesenta meses, p < 0,05). Se realizó un seguimiento durante treinta meses, observandose elevación de transaminasas en el 51,7 % de pacientes seropositivos y en el 21,8 % de seronegativos. Durante este período, 13 de los pacientes negativos seroconvirtieron al V H C , no existiendo asociación entre el sexo, edad o número de transfusiones sanguíneas con cada seroconversión individual. Tres pacientes negativos tuvieron un episodio de hepatitis aguda no relacionada con agente viral hepatotropo conocido, colelitiasis o administración de drogas hepatotóxicas. De las técnicas serológicas estudiados, el inmunoblot RIBA-III es el que ofrece mayor especificidad en el estudio del VHC, superando a las otras técnicas de ELISA (ELISA-II y MONOLISA ANTI-HCV) e inmunoblot de segunda generación (RIBA-II y DECISCAN ANTI-HCV). Palabras clave: VHC. Hemodiálisis. Seroconversiones. Anticuerpos. Recibido: 19-VI-95. En versión definitiva: 20-X-95. Aceptado: 24-X-95. Correspondencia: Dr. J. García-Valdecasas Valverde. Avda. Divina Pastora, 7, Bloque 8, 6.° B. 18012 Granada. 68 VHC EN HEMODIALISIS. SEROCONVERSIONES INCIDENCE AND RISK FACTORS OF VIRUS C SEROCONVERSION IN HEMODIALYSIS PATIENTS SUMMARY T h i s study was carried out in 107 hemodialyzed patients to determine the prevalence of HCV antibodies, and the epidemiological factors associated with HCV infection: sex, age, history of blood transfusion, time on hemodialysis and e l e v a t i o n of transaminases levels. Prevalence of HCV antibodies was 27 %. There was no statistical association of sex and age with seropositivity to HCV ant i b o d i e s . We found a significant association (p < 0.01) between seropositivity and blood transfusions performed before the investigation of these antibodies in blood donors, and with time on dialysis (lower in those who were treated less than 30 months, p < 0.05). Patients were investigated throughout a follow up study of 30 months. Elevation of transaminase levels were found in 51.7 % of positive patients and in 21.8 % of seronegative. During this period of time, 13 seroconversions were observed, showing no relation to sex, age or history of blood transfusion. Three HCV negative patients had acute hepatitis without evidence of hepatotropic virus infection, cholelithiasis neither hepatotoxic drugs. Of the serological tests studied, RIBA-III inmunoblot (ORTHO) was the most specific, compared to the other techniques: ELISA-II (ORTHO), RIBA-II (ORTHO), MONOLISA ANTI-HCV (PASTEUR) or DECISCAN ANTI-HCV (PASTEUR). Key words: HCV. Hemodialysis. Seroconversion. Antibodies. INTRODUCCION El virus de la hepatitis C (VHC), que se identificó e n 1989 1, está considerado actualmente como el agente más importante y frecuente de hepatitis viral en los pacientes hemodializados (HD). Tras su identificación se desarrollaron técnicas serológicas basadas en métodos inmunoenzimáticos (ORTHO HCV ELISA test) y de inmunoblot recombinante (CHIRONRIBA HCV test) para detectar anticuerpos dirigidos contra el VHC (Ac-VHC). La primera generación de técnicas de ELISA y RIBA estaban caracterizadas por frecuentes resultados falsos positivos y falsos negativos, debido a que estas técnicas notifican la presencia de Ac dirigidos contra el péptido viral C100, que aparece en suero de forma tardía en la evolución de la enfermedad y desaparece relativamente pronto de la sangre. Las modificaciones de estas técnicas con objeto de conseguir una mayor especificidad y sensibilidad, dieron como resultado las técnicas de segunda generación. La técnica ELISA-II permite detectar Ac dirigidos contra el péptido estructural C22, y el no estructural C200, y el RIBA-II detecta Ac dirigidos contra el antígeno estructural C22, y tres antígenos no estructurales (C33, 5-1-1 y C100). Existe un nuevo ELISA de segunda generación ( M O N O L I S A ANTI-HCV) que detecta Ac dirigidos contra el antígeno estructural de la cápside viral NC450 y contra un antígeno no estructural de la región NS3 (409-1-1), y una nueva técnica confirmatoria inmunoblot de segunda generación (DECISCAN HCV) que permite detectar Ac frente a los antígenos virales de la cápside C1 y C2, así como contra los antígenos no estructurales de la región NS3 (409-1-1) y de la región NS4. La técnica RIBA-II ha sido considerada como la más sensible y específica para detectar la presencia de infección por el VHC 2, 3, pero últimamente, con el fin de mejorar la sensibilidad de éste, se ha comercializado el RIBA-III, que incluye la detección de Ac frente a la región no estructural NS5. Numerosos estudios han notificando una elevada prevalencia de VHC-Ac en los pacientes tratados con HD 4-6. Esta prevalencia aumenta año tras año, principalmente como consecuencia de las seroconversiones que tienen lugar en pacientes previamente negativos 7. Este estudio ha sido realizado con el fin de determinar la prevalencia de VHC-Ac y los factores epidemiológicos asociados a la misma en pacientes en HD y en pacientes seroconvertidos durante un período de observación prospectivo de treinta meses, así como para evaluar las diferencias existentes en la especificidad y sensibilidad entre las diferentes técnicas serológicas de segunda y tercera generación. 69 J. GARCIA-VALDECASAS y cols. PACIENTES Y METODOS El estudio se realizó en 107 pacientes tratados con HD en el Hospital Universitario de Granada, en los que se realizó un seguimiento durante un período de treinta meses. Ninguno de ellos era portador del antígeno de superficie del VHB o de Ac frente al VIH. Entre los factores epidemiológicos valorados se incluyó el sexo, la edad, el tiempo de duración del tratamiento de diálisis, la historia individual de transfus i o n e s de sangre y la elevación de transaminasas, que se evaluaron mensualmente, considerándose elevadas cuando la alanina amino-transferasa (ALT) est a b a 1,5 veces por encima del valor máximo de la normalidad en al menos dos muestras. N u e s t r o criterio de infección aguda por el VHC incluyó la presencia de Ac-VHC en un paciente previamente negativo, asociado a elevación de ALT en al menos dos determinaciones consecutivas con una semana de intervalo, elevación de aspartato aminot r a n s f e r a s a y/o de gamma glutamil-transpeptidasa, s i n infección por cualquier otro virus hepatotropo (VHA, VHB, CMV, VEB y VHS) 8, 9. Los pacientes que r e c i b í a n alguna droga considerada hepatotóxica o que presentaban colelitiasis no fueron valorados en el estudio. En estos pacientes las transfusiones se realizaron siempre que aparecía anemia sintomática o cuando se utilizaron para mejorar el curso posterior de un posible trasplante renal (hasta 1985, cada paciente recibía de 5 a 10 unidades de 300 ml de sangre previo al trasplante renal). La detección de Ac-VHC en la sangre transfundida se realizó desde abril de 1990, d e s c o n o c i é n d o s e , por tanto, el estado serológico frente al virus C con anterioridad a dicha fecha. L o s VHC-Ac fueron analizados cada dos meses p o r la técnica ELISA-II (ORTHO HCV ELISA test System second generation, Ortho Diagnostic System, Raritan, N. J., EE.UU. Ref. 933940), que detecta Ac frente a los péptidos virales C22 y C200, y los resultados positivos fueron confirmados por RIBA II (CHIR O N RIBA HCV test System second generation, C h i r o n Corporation, Emeryville, CA, EE.UU. Ref. 930780), técnica que detecta Ac dirigidos contra los péptidos víricos C22, C33, C100 y 5-1-1. Alícuotas d e estas muestras de suero fueron almacenadas a - 6 0 oC . Se consideró como criterio de positividad la presencia en suero de dos o más Ac frente a estos antígenos estudiados por RIBA-II. Las muestras de sangre en las que se detectaron Ac por ELISA-II, pero que por RIBA-II sólo se detectaba la presencia de un solo Ac, fueron consideradas indeterminadas. Por el contrario, aquellas muestras de sangre positivas por ELISA-II, pero negativas por RIBA-II, se consideraron falsas positivas. 70 Con el fin de evaluar estos criterios, las muestras consideradas falsas positivas e indeterminadas fueron estudiadas posteriormente por un nuevo ELISA de seg u n d a generación (MONOLISA ANTI-HCV, Sanofi Diagnostic Pasteur, Marnes La Coquette, France, Ref. 7 2 3 0 2 ) , que detecta Ac frente a los antígenos del VHC NC-450 y 409-1-1, y un nuevo inmunoblot de s e g u n d a generación (DECISCAN HCV, Sanofi Diagnostic Pasteur, Marnes La Coquette, France, Ref. 72304), que determina la presencia de Ac dirigidos c o n t r a los antígenos virales C1, C2, 409-1-1 y un péptido de la región NS4, así como por RIBA III, que detecta Ac frente a los péptidos C22, C33, C100 y un péptido de la región NS5. Tras aplicar dichas técnicas, la presencia de dos o más Ac frente a los péptidos del VHC detectados por DECISCAN o por RIBA-III fue criterio de positividad. La ausencia de Ac por MONOLISA, DECISCAN y/o RIBA-III se consideró criterio de negatividad. Por otro lado, un suero positivo con MONOLISA, pero negativo con los confirmatorios DECISCAN y/o RIBA-III, se consideró falso positivo. La valoración serológica de i n d e t e r m i n a d o se basó en la presencia de Ac por MONOLISA junto a la presencia de un solo Ac por DECISCAN y/o RIBA-III. El análisis estadístico fue realizado por el test Chi cuadrado 10. RESULTADOS De los 107 pacientes estudiados, 37 presentaron A c - V H C por ELISA de segunda generación (prevalencia del 34,6 %). Sin embargo, cuando posteriorm e n t e fueron valorados por RIBA-II, solamente 27 de los 37 positivos previos fueron confirmados como p o s i t i v o s (prevalencia del 25,2 %). De los 10 pac i e n t e s restantes, siete fueron considerados falsos positivos, y tres indeterminados. Estos 10 pacientes fueron estudiados por las técnicas MONOLISA, DECISCAN y RIBA-III: los siete falsos positivos, fueron negativos por estas tres técnicas; los tres indetermin a d o s fueron negativos con MONOLISA; uno de ellos resultó positivo por DECISCAN y RIBA-III, otro negativo con ambas técnicas y el tercero resultó indeterminado por DECISCAN y positivo por RIBA-III, lo que permitió considerarlo positivo. Por todo ello, a l comienzo del período de estudio el número de p a c i e n t e s seropositivos fue de 29 (prevalencia del 27,1 %). Durante el período de seguimiento se perdieron un total de 11 pacientes: tres positivos y ocho negativos. D e los 70 negativos, 13 seroconvirtieron (18,5 %) durante el tiempo de observación, ninguno de ellos considerado previamente falso positivo (incidencia de 0,6 pacientes/100 pacientes/mes). VHC EN HEMODIALISIS. SEROCONVERSIONES Por lo que respecta al sexo, no existieron diferencias estadísticas en la prevalencia de anticuerpos (16 positivos/62 hombres, 25,8 %, y 13 positivos/45 mujeres, 28,9 %), así como tampoco en las seroconvers i o n e s (ocho hombres seroconvertidos, 17,3 %), y cinco mujeres, 17,2 %). La tabla I muestra la prevalencia de Ac-VHC con respecto a la edad. No se encontraron diferencias estadísticas entre la edad de los seropositivos (media de edad de 53,4 ± 9,2 años) y seronegativos (media de edad de 47,2 ± 10,5 años); aunque existe un aument o de la prevalencia de Ac-VHC a medida que aumenta la edad, no se observaron diferencias significativas entre los intervalos estudiados. Tabla I. Prevalencia de anticuerpos frente al VHC en relación con la edad. Edad (años) 23 - 29 30 - 39 40 - 49 50 - 59 60 - 69 70 - 79 Pacientes 12 21 18 21 23 12 Ac + 2 4 4 7 8 4 Prevalencia (%) 16,7 19,0 22,2 33,3 34,8 33,3 Tabla II. Prevalencia de anticuerpos frente al VHC en relación con el tiempo de duración del tratamiento de hemodiálisis. Meses 1 - 12 13 - 24 25 - 36 37 - 48 49 - 60 61 - 72 73 - 84 85 - 96 > 97 Global < 60 Global > 60 Pacientes 15 20 15 16 14 9 7 4 7 80 27 Ac + 2 3 3 3 3 4 4 3 4 14 15 Prevalencia (%) 13,3 15,0 20,0 18,7 21,4 44,4 57,1 75,0 57,1 17,5 55,6 Ac + = pacientes con anticuerpos positivos. No existieron diferencias en la prevalencia entre los distintos grupos; sin embargo, si existieron diferencias estadísticas entre los pacientes tratados menos de sesenta meses en comparación con los tratados más de sesenta meses (p < 0,05). Ac + = pacientes con anticuerpos positivos. No existieron diferencias significativas en la prevalencia entre los diferentes grupos. La tabla II muestra la prevalencia de Ac-VHC en relación con la duración del tratamiento de hemodiálisis. Existió una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en la duración del tratamiento entre los pacientes seropositivos (73,3 ± 38,2 meses) frente a los seronegativos (40,3 ± 32,1 meses). Cuando el tiempo de tratamiento es inferior a sesenta meses, la prevalencia de Ac-VHC (14 positivos de 80 pacientes, 17,5 %) es inferior a la obtenida en los pacientes tratados durante más de sesenta meses (15 positivos de 27 pacientes, 51,8 %) (p < 0,05). El número de transfusiones recibidas está relacionada con la prevalencia de Ac: 55 pacientes no fuer o n transfundidos y ocho de ellos fueron positivos (14,5 %), mientras que de 52 que recibieron alguna t r a n s f u s i ó n de sangre, 21 resultaron positivos (40,4 %) (p < 0,01). Respecto al número de transfusiones recibidas, se observó una prevalencia inferior en los pacientes que tuvieron una o dos transfusiones de sangre (tres positivos/19 pacientes, 15,8 %), frente a los que recibieron tres o más transfusiones de sang r e (18 positivos/33 pacientes, 54,5 % (p < 0,01). Cuatro de los pacientes que seroconvertieron habían s i d o transfundidos durante el período de observación, pero en estos casos el producto sanguíneo estuvo siempre investigado para la presencia de Ac-VHC, estudio que se realiza en nuestro hospital desde abril de 1990. L a tabla III muestra el número de pacientes con ALT elevada o normal en los seropositivos, seroconv e r t i d o s y seronegativos. No existieron diferencias significativas en el porcentaje de pacientes con elevación de ALT entre los positivos y los negativos. En 39 pacientes se observó elevación de ALT (36,4 %), 2 1 de los cuales presentaban Ac-VHC (15 de ellos positivos desde el comienzo del estudio y siete que seroconvertieron en el seguimiento), así como en 17 negativos. Por el contrario, 20 positivos no tuvieron en ningún momento elevación de niveles séricos de ALT (14 positivos desde el comienzo del estudio y seis seroconvertidos). En estos últimos seis pacientes se detectó la seroconversión únicamente por su cambio en el estado serológico. Tabla III. Relación entre anticuerpos frente al VHC y elevación de ALT ALT Elevadas Normales Pacientes Ac + SC Ac ­ 39 (36,4 %) 15 (38,5 %) 68 (63,6 %) 14 (20,6 %) 7 (17,9 %) 17 (43,6 %) 6 (8,8 %) 48 (70,6 %) ALT = alanina aminotransferasa; Ac + = pacientes con anticuerpos positivos; SC = pacientes seroconvertidos; Ac ­ = pacientes con anticuerpos negativos. Se ha observado episodio de hepatitis aguda en un total de 10 pacientes previamente negativos; de ellos, siete han seroconvertido y tres continúan siendo negativos. De los siete seroconvertidos, dos normalizaron los niveles de ALT a los tres y cinco meses respectivamente; dos presentaron elevación alternante de ALT, y los tres restantes han mantenido la ALT eleva71 J. GARCIA-VALDECASAS y cols. da durante todo el seguimiento. De los tres pacientes sin seroconversión al VHC, dos normalizaron los niv e l e s de ALT a los diez y doce meses del episodio agudo y en el tercero se observó elevación alternante. Cuando se estudió la sensibilidad y especificidad de las técnicas utilizadas y empleando el RIBA-III como técnica de referencia, se encontró que el ELISA-II tiene una sensibilidad del 100 % (ningún falso negativo) y una especificidad del 90,7 % (ocho falsos positivos). La técnica MONOLISA mostró una sensibilid a d del 90,6 % (tres falsos negativos) y una especificidad del 100 % (ningún falso positivo). Los inmunoblots de segunda generación (DECISCAN y R I B A - I I ) mostraron ambos una especificidad del 100% (ningún falso positivo), pero una sensibilidad del 96,7 % (un falso negativo) y del 90,6% (tres falsos negativos), respectivamente. DISCUSION Desde que se inició la detección sérica de los AcV H C 1 1 h a n sido numerosos los estudios que han mostrado una elevada prevalencia en los pacientes HD 12, 13. En la población estudiada ha sido del 27 %, similar a la encontrada por otros investigadores 4, 14-17 y superior a la observada en la población normal de nuestro medio (donantes de sangre, 1,03 %, y embarazadas, 0,98 %) 18, lo que descarta un factor geográfico asociado a la misma; sin embargo, es inferior a la observada en otros grupos de riesgo, tales como hemofílicos (70 %) y adictos a las drogas (70 %) 4. En este estudio, los factores relacionados con esta prevalencia han sido el tiempo de duración del tratamiento de diálisis y el haber recibido transfusiones de sangre. Quizá ambos factores están relacionados entre sí, ya que son los pacientes con mayor tiempo en hemodiálisis los que tienen una historia superior de transfusiones de sangre, las cuales se realizaron en un período de tiempo donde las técnicas de detección de estos Ac-VHC no estaban disponibles, hecho similar a lo encontrado en otras unidades de diál i s i s en España 5, 19. Aunque la prevalencia estuvo relacionada con el número de transfusiones de sangre, no podemos descartar la posibilidad de que hay a n estado involucradas otras vías de transmisión. Hemos observado seroconversión en 13 pacientes en los que no se puede considerar a la transfusión sanguínea como vector de transmisión, ya que todas las transfusiones realizadas en el período de seguimiento estuvieron investigadas para el VHC. En un estudio previo 7 nosotros hemos mostrado un posible papel de la transmisión intradiálisis en estos pacientes seroconvertidos. Por otro lado, esta elevada prevalencia pudiera estar relacionada con el deterioro de la inm u n i d a d celular y humoral que tiene lugar en pa72 cientes con enfermedad renal crónica, como algunos autores han sugerido 20-23, o asociada con la patología renal (glomerulonefritis) y/o insuficiencia renal sever a , como nosotros hemos sugerido previamente 18. Recientemente, la asociación entre VHC y enfermedad renal mediada inmunológicamente ha sido dem o s t r a d a , especialmente en pacientes con glomerulonefritis membranosa 24, membranoproliferativa 25 y crioglobulinemia 26, aunque la patogénesis de esta asociación permanece aún desconocida. De los 10 pacientes que tuvieron episodio de hepatitis aguda durante el estudio, se pudo demostrar q u e el VHC estaba implicado en el 70 % de ellos, pero aunque esta infección es actualmente la causa más importante de las hepatitis agudas no A - no B en las unidades de diálisis 4, 16, 19, 27, 28, en nuestro estudio existe un sustancial grupo de pacientes que tienen elevación de ALT sin una etiología definida. Este hecho pudiera estar relacionado con niveles muy bajos de Ac-VHC en sangre, no detectable con las técnicas serológicas actuales 29, no pudiéndose descartar que sea debido a la existencia de otros agentes hepatotropos desconocidos. Estos datos sugieren que el hallazgo de transaminasas elevadas en pacientes tratados con hemodiálisis es todavía un dato inespecífico, siempre que se haya descartado la existencia de Ac frente al VHC. El 47,3 % de seropositivos no presentó elevación de ALT, lo que pudiera estar en relación con infección asintomática o evolución natural de la infección VHC en estos pacientes. Respecto a las técnicas que detectan la presencia de Ac-VHC, en el momento actual no existe ninguna que pueda tomarse como técnica de referencia. Por ello, para estudiar la sensibilidad y especificidad, nosotros hemos elegido como patrón el RIBA-III, que d e t e c t a anticuerpos frente a un mayor número de proteínas estructurales y no estructurales del VHC. Cuando se aplican diversas técnicas en el estudio de los pacientes considerados indeterminados, hemos encontrado que la técnica MONOLISA no resuelve e s t a situación serológica. La técnica ELISA-II tiene una especificidad del 90,7 % y una sensibilidad del 1 0 0 %, similar a la observada por otros autores 17. Los confirmatorios inmunoblot RIBA-II y DECISCAN p r e s e n t a n una mayor especificidad (100 %), pero m e n o r sensibilidad que el test ELISA-II (90,6 % y 96,7 %, respectivamente). Las diferencias entre estas técnicas permanecen sin clarificar y pudieran estar relacionadas con el hecho de que algunas de ellas no incluyan los epítopos antigénicos más inmunodominantes de las diferentes proteínas víricas, lo cual impida detectar niveles bajos de anticuerpos. Resumiendo, hemos encontrado una elevada prevalencia de Ac frente al VHC en nuestros pacientes dializados. Esta prevalencia ha estado relacionada VHC EN HEMODIALISIS. SEROCONVERSIONES con historia previa de transfusiones sanguíneas y con la duración del tratamiento dialítico. El hallazgo de test de función hepática anormales es un dato no específico en los pacientes VHC-Ac positivos. Las seroconversiones son en el momento actual un problema importante en los pacientes hemodializados, las cuales no pueden ser consideradas un fenómeno relacionado con las transfusiones de sangre. El conocimiento de los factores epidemiológicos involucrados en la infección por el VHC de los pacientes en diálisis podrá permitir en el futuro disminuir la incidencia de estas complicaciones en nuestros pacientes. Bibliografía 1. C h o o QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradly DW y Houghton M: Isolation of a cDNA clone derived from a bloodb o r n e non A, non B viral hepatitis genome. Science 2 4 4 (4902):359-362, 1989. 2. Van der Poel CL, Reesink HW, Lelie PN, Leentvaar-Kuypers A, Choo QL, Kuo G y Houghton M: Anti-hepatitis C antibodies and non-A, non-B postransfusion hepatitis in the Netherlands. Lancet 2 (8658):297-298, 1989. 3. 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