NEFROLOGIA. Vol. XVIII. Núm. 6. 1998 FORMACION CONTINUADA Factores de crecimiento en la nefropatía diabética B. Gallego, J. M. López-Novoa y F. Pérez-Barriocanal Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica. Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Salamanca. Una de las complicaciones más graves y frecuentes que sufren los pacientes diabéticos, a pesar del tratamiento con insulina, es la insuficiencia renal 1. La nefropatía diabética (ND) se caracteriza histológicamente por engrosamiento y alteración de los componentes de las membranas basales glomerular y tubular y por expansión mesangial, debido a un aumento de las proteínas de la matriz extracelular, lo que acaba produciendo glomeruloesclerosis (GSC) y fibrosis túbulo-intersticial. Además, tienen lugar una serie de lesiones no glomerulares que afectan la función glomerular y tubular. Entre estas lesiones se encuentra la hialinosis exudativa que provocará un daño isquémico y, como consecuencia, obliteración de las arteriolas de pequeño y medio tamaño. El grado de obstrucción de los vasos se correlaciona directamente con la severidad de la GSC y la fibrosis e inversamente con el nivel de función renal. También el porcentaje de riñón ocupado por intersticio se correlaciona inversamente con el grado de función renal. Existen dudas acerca de si la fibrosis intersticial es paralela a la glomerulopatía estructural o inductora de la misma, ya que ambas están íntimamente relacionadas 2. Desde hace años, se sabe que, funcionalmente, la diabetes mellitus cursa con hiperfiltración, aumento del flujo plasmático renal (FPR) y nefromegalia 3. Pasado el tiempo, puede evolucionar a nefropatía diabética establecida, que se caracteriza por proteinuria, hipertensión y disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG). De este estado es muy probable la progresión a insuficiencia renal terminal 4. La patogénesis de las múltiples anomalías estructurales y funcionales de la ND sigue siendo materia de discusión y es probable que sea multifactorial (fig. 1), Correspondencia: Dr. F. Pérez Barriocanal. Departamento de Fisiología y Farmacología. Edificio Departamental. Avda. Campo Charro, s/n. 37007 Salamanca. implicando tanto desórdenes metabólicos básicos debidos a la hiperglucemia como desórdenes hemodinámicos y determinantes genéticos. La influencia de la hiperglucemia en el desarrollo de las lesiones diabéticas ha sido ampliamente demostrada, tanto en estudios in vivo como in vitro 5-7. Además, la hiperglucemia puede actuar a través de mecanismos bioquímicos como son: la vía del poliol, con consecuencias bioquímicas relevantes para el desarrollo de la ND 8; la glicosilación no enzimática de las proteínas, ya sea temprana o avanzada, que por interacción con otras proteínas pueden formar uniones cruzadas con importantes efectos estructurales y funcionales en las proteínas de la matriz y en las células del entorno 9, 10; síntesis de diacilglicerol (DAG) 11, activación de la proteína quinasa C (PKC) 12, activación de la fosfolipasa A2 13, síntesis aumentada de prostanoides 14; formación de especies reactivas de oxígeno y la consiguiente modificación oxidativa de proteínas, lípidos 15, 16. También está alterado el sistema renina an- Hiperglucemia AGEs Vía polioles Alteraciones hemodinámicas NEFROPATIA DIABETICA SRA PKC RLO Fig. 1.--Desórdenes básicos que intervienen en la génesis de la nefropatía diabética. AGEs: productos de la glicosilación avanzada; PKC: proteína quinasa C; RLO: radicales libres de oxígeno; SRA: sistema renina angiotensina. 449 B. GALLEGO y cols. giotensina (SRA) 17 y la síntesis o liberación de citoquinas o factores de crecimiento (FC) 18. Todos estos factores no son excluyentes y, además, pueden influir unos en otros, de manera que prácticamente todos los mecanismos mencionados pueden ser estímulos para la síntesis de FC (fig. 2). Así, por ejemplo, los cambios hemodinámicos provocarán, debido al rozamiento y estiramiento de las células, la síntesis de factores como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) o el factor de crecimiento transformante b (TGF-b) 19, 20. Aunque no directamente, la vía de los polioles también puede intervenir, ya que proporciona sustratos para la síntesis de DAG, que es un activador de la PKC 21 y ésta es estímulo para el TGF-b o el factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF-b) 22, 23. La angiotensina II (Ang II) ejerce sus efectos tróficos a través del TGF-b 24. Los procesos oxidativos se consideran como uno de los principales mecanismos de daño tisular en la diabetes 8 y, como tales, provocan la síntesis de FC 25 como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I). Los productos de la glicosilación avanzada (AGEs), a través de receptores específicos, actúan sobre distintas células como monocitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, mesangiales, sobre las que, además de ejercer efectos directos, provocan la síntesis de factores como factor de necrosis tumoral (TNF), interleuquina 1 (IL1), IGF-I, PDGF o EGF 26-28. La albuminuria, que siempre se ha considerado como un índice del daño renal (consecuencia), puede, a su vez, ser causa del mismo 29, ya que la célula tubular fagocita la albúmina y cambia su fenotipo, aumentando la producAlteraciones hemodinámicas Estiramiento Rozamiento ción de colágeno, la síntesis de FC como el PDGF y, además, produce factores quimiotácticos para macrófagos, que podrán producir más FC 30. Además de todo lo descrito, en la diabetes, al igual que en otras patologías renales tiene lugar una activación autocrina o paracrina de las células del entorno intersticial, y todas ellas, a su vez, pueden modificar la respuesta de las demás a través de una complicada red de citoquinas o FC 31. Dada la complejidad del tema, en esta revisión estudiaremos los factores de crecimiento más importantes que están implicados en la ND, teniendo en cuenta sus estímulos, sus acciones y los lugares en los que ejercen su efecto (tabla I). IGF-I El IGF-I es un péptido de 70 aminoácidos 32. Se produce en el hígado dependiendo de factores como el nivel de hormona del crecimiento (GH) circulante, del estatus nutricional y del nivel de insulina. El IGF-I sintetizado en el hígado tiene una función endocrina, ya Tabla I. Factores de crecimiento más importantes implicados en la nefropatía diabética. Factor de crecimiento PDGF Estímulo Otros factores de crecimiento Hemodinámica RLO Albuminuria AGEs Hemodinámica PK C Células productoras Macrófagos Endoteliales Mesangiales Acciones Proliferación celular Coagulación intravascular FGF-b Vía polioles DAG PK C c-fos/c-jun Endoteliales Proliferativo (para fibroblastos y endoteliales) Angiogénico Proliferativo para mesangiales Síntesis de proteínas de la matriz IGF-I AGEs Daño tubular tóxico Albuminuria FACTORES DE CRECIMIENTO AGEs Ang II EGF RLO TGF-b Daño tubular tóxico por AGEs o RLO PK C Macrófagos Linfocitos Fibroblastos Mesangiales Endoteliales Epiteliales Tubulares Mitogénico para epiteliales Hipertrofia tubular Regenerador tubular (junto con IGF-I) Síntesis de matriz Degradación Inhibe proliferación Hiperglucemia Fig. 2.--Relación de las anomalías que tienen lugar en la diabetes con la síntesis de factores de crecimiento. AGEs: productos de la glicosilación avanzada; Ang II: angiotensina II; DAG: diacilglicerol; PKC: proteína quinasa C; RLO: radicales libres de oxígeno. Hiperglucemia Ang II AGEs Estiramiento PK C Macrófagos Linfocitos Fibroblastos Mesangiales Endoteliales Epiteliales AGEs: productos de la glicosilación avanzada; Ang Ii: angiotensina II; PKC: proteína quinasa C; RLO: radicales libres de oxígeno. 450 FACTORES DE CRECIMIENTO EN NEFROPATIA DIABETICA que está implicado en el crecimiento longitudinal del hueso. También hay una producción local de IGF-I, que no es dependiente de GH y tiene una función local específica, ya sea autocrina o paracrina 33. Mediante estudios de inmunohistoquímica se ha visto que, en el riñón, se localiza en el tubo colector, la rama delgada del asa de Henle y el túbulo distal 34-36 y mediante técnicas de hibridación in situ del ARNm se ha observado que es más abundante en los lugares mencionados, pero que también puede encontrarse en el túbulo proximal y en el glomérulo 37. Se produce en situaciones como la hipertrofia renal compensadora, la diabetes y también en el tejido renal normal adyacente al infartado. Los lugares de producción más relevantes son: tubo colector (donde el ayuno y la restricción calórica inhíben su producción y factores de crecimiento como GH y EGF la estimulan), la rama ascendente gruesa medular del asa de Henle, túbulo proximal (en isquemia aguda) y en mesangiales de rata 33. El receptor de IGF-I consta de dos subunidades a, extracelulares y dos subunidades b, con dominios transmembrana y tirosina quinasa en el citoplasma. Se distribuye ampliamente en el glomérulo (no se ha encontrado en glomérulos controles), en túbulo proximal, rama ascendente gruesa del asa de Henle y tubo colector. La unión específica a este receptor es mayor en la médula interna que en corteza o médula externa38. El IGF-I de la circulación está unido no covalentemente a proteínas de unión específica (IGFBP) 33. Estas proteínas pueden encontrarse circulantes de forma soluble, las cuales están asociadas con la inhibición de los efectos del IGF-I o asociadas a la superficie celular, que potenciarían las acciones del mismo. Tal variedad nos indica el papel tan complejo que deben jugar estas proteínas en la regulación in vivo. Entre las funciones que llevan a cabo las IGFBP podemos destacar que tienen un papel inactivador del IGF-I a través del secuestro, protegen al IGF-I de la degradación y por tanto aumentan su vida media (y si son de tejido «guardan» al IGF-I y aumentan su biodisponibilidad local), transportan a los IGFs fuera de la circulación, los liberan selectivamente en el sitio de acción. Algunas IGFBP pueden unirse a receptores de integrinas de la membrana de la superficie celular. En esta localización pueden servir para colocar al IGF-I cerca del receptor y así inhibir o aumentar el acceso del IGF-I a sus receptores o regular la potencia de traducción de la señal de IGF 33, 39. En la diabetes humana no se ha visto un patrón de descenso o aumento de IGF-I, pero sí se ha visto en ratas. Flyvbjerg 40 demostró un 77% de aumento del IGF-I renal, que fue máximo a las 48 horas después de la inducción y parece que precede al aumento de tamaño renal. Los niveles decrecen hasta la normalidad a los cuatro días. También demostró que ese aumento de los niveles renales no se debe a una producción local sino a una recaptación del circulante. Por el contrario, Bach 41 y Catanese 42 han observado un aumento del ARNm. Además, los niveles hepáticos de ARNm de IGF-I se reducen en la diabetes, lo que indica que la expresión génica está claramente regulada de forma órgano-específica en la diabetes experimental. Estos resultados son difíciles de integrar, pero parece que la regulación de la expresión de IGF-I en el riñón está influida de forma muy compleja por la duración y la severidad de las anormalidades metabólicas que acompañan al estado diabético 33. Recientemente se ha observado que el aumento de IGF-I en el riñón diabético a los dos días de la inducción de la diabetes es un fenómeno dependiente de GH y que hay una relación entre GH/IGF-I y el desarrollo de lesiones renales en la diabetes 43. En la diabetes inducida por STZ, a los dos días se encuentran agrandamiento renal y cambios hemodinámicos, como un aumento de la TFG y del FPR, y esos mismos efectos se logran cuando se inyecta GH o IGF-I 44. El mecanismo por el cual el IGF-I puede contribuir en el desarrollo de la patología diabética puede pensarse que es el siguiente: la acumulación renal de IGF-I, dependiente del nivel de glucosa en sangre, bien directamente, o bien a través de sistemas vasodilatadores como NO o eicosanoides 45, 46, disminuye las resistencias vasculares renales y aumenta la función y el tamaño renal en el diabético. También el sistema calicreína-cinina puede estar involucrado, ya que los efectos hemodinámicos, reproducidos por infusión de IGF-I en ratas normales, pueden ser bloqueados por coinfusión de un antagonista de receptores de cininas 47. También la acumulación de IGF-I renal puede aumentar la actividad del intercambiador Na/H tubular y, este efecto en el túbulo renal podría conducir, secundariamente, a un aumento del FPR y de la TFG, a través de un mecanismo de retroalimentación túbulo-glomerular 48. Por otra parte, el IGF-I, al igual que la insulina, aumenta la síntesis de ADN en células mesangiales 49 y también aumenta la tasa de síntesis de componentes de la matriz extracelular como laminina, fibronectina y colágeno de tipo IV 50. Se ha comprobado, además, que apoya los efectos proliferativos de otros FC, por lo que podría considerarse un factor de progresión 51. Pese a todos estos efectos del IGF-I, se ha observado que ratones transgénicos para GH desarrollan un tipo de glomeruloesclerosis muy parecida a la diabética 52, mientras que transgénicos para IGF-I no 53, 54 por lo que el IGF-I no parece fundamental 451 B. GALLEGO y cols. para el desarrollo de la nefropatía diabética. Sí parece fundamental el aumento del IGF-I local. PDGF El PDGF es un heterodímero de dos cadenas polipeptídicas A y B, unidas por puentes disulfuro. Existen tres formas diméricas posibles del PDGF: AA, AB y BB. Las dos cadenas se sintetizan como largos precursores que, posteriormente, son procesados hasta la molécula funcional 55. Los receptores del PDGF son codificados por dos genes distintos y los receptores ejercen distintas respuestas según el subtipo del PDGF que se una 56. En el glomérulo no se sabe cuáles son las células que expresan el receptor, aunque es probable que sean células mesangiales. Además, las citoquinas de los macrófagos activados desempeñan un papel importante en la inducción de la expresión del receptor B del PDGF 57. Habitualmente se libera de los gránulos de las plaquetas, aunque también se produce en células epiteliales, monocitos, macrófagos, mesangiales y endoteliales. Se libera hacia el entorno extracelular en respuesta a numerosas sustancias: factor activador de plaquetas (PAF), trombina, colágeno e inmunocomplejos 58. Es mitogénico para las células endoteliales, mesangiales, epiteliales y fibroblastos renales del túbulo-intersticio. En las células mesangiales no sólo induce proliferación, sino que regula positivamente su propia liberación 59. Puede, además, ser mediador de la acción de otros FC como EGF, TNF-a, FGF-b que inducen, en células mesangiales en cultivo, la expresión del ARNm que codifica PDGF y su liberación 59. Además, los anticuerpos anti-PDGF inhíben los efectos mitógenos del EGF en células mesangiales, lo que indica que la estimulación del crecimiento celular inducida por el EGF puede ser debida, al menos en parte, al PDGF 60. También puede estimular la liberación de otros FC como IGF-I desde los fibroblastos 61. El PDGF es, además, vasoconstrictor potente62, activador del metabolismo de prostaglandinas 63 y regulador de la síntesis de colágeno tipo III, IV y V 64. Existen estudios in vitro que sugieren un papel del PDGF como indicador de la expresión elevada de colágeno IV en respuesta al aumento de los productos glicosilados 65. FGF El factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGFa) y el básico (FGF-b) son miembros de una gran familia de proteínas relacionadas que se expresan en 452 distintos tejidos 66. De los dos, el FGF-b es el factor angiogénico más potente de los implicados en la angiogénesis diabética 67. Usando técnicas de radioinmunoensayo, se ha visto que el FGF-b se libera de células endoteliales de retina bovina en cultivo 68, pero parece que, normalmente, hay muy poca secreción de FGF-b en células en cultivo 69. Sin embargo, el FGF-b podría ser un factor angiogénico asociado a las células, que se libera sólo bajo circunstancias especiales como isquemia o muerte celular 70. La concentración elevada de glucosa provoca un aumento del ARNm del FGF-b en ojo, corazón, pulmón y cerebro en diabetes experimental a corto plazo 71 y también en células de músculo liso vascular en cultivo 72. En ratas con diabetes inducida por estreptozotocina, a largo plazo, se ha observado un aumento del ARNm del FGF-b glomerular paralelamente al marcador de proliferación, PCNA 73. Schleicher y cols. 4 estudiaron la presencia de FGF-b por técnicas de inmunohistoquímica en el riñón diabético y observaron que no hay expresión en la GSC difusa pero sí en los márgenes de nódulos glomeruloescleróticos. Dado que estos nódulos aparecen tardíamente en la progresión de la diabetes, podría pensarse que no está implicado en la GSC temprana pero sí puede jugar un papel importante en los estados avanzados de la ND. El mecanismo por el que aumenta el FGF-b puede ser una estimulación de la PKC por la glucosa elevada 21, ya que la PKC está activada en glomérulos de ratas diabéticas y la activación de la PKC estimula la expresión de FGF-b en células endoteliales humanas 74 y en otros modelos 23. Estudios en cultivos celulares han demostrado que el FGF-b es un factor de competencia del ciclo celular y podría ser la unión entre los efectos permisivos de GH e IGF-I en la proliferación de células endoteliales de la retina 75. El FGF-b también interacciona con un componente de la matriz extracelular, el proteoglicano heparán-sulfato 76. EGF El EGF de ratón se sintetiza como un proprecursor que se inserta como una proteína transmembrana 77. Después, la acción de proteasas específicas hace que se libere el péptido activo 78. El EGF se expresa en el glomérulo y en células tubulares 73. El receptor del EGF es una proteína con actividad tirosina quinasa 79 y se encuentra localizado en la membrana basal del túbulo proximal 80. Se ha comprobado que la hormona del crecimiento y las ti- FACTORES DE CRECIMIENTO EN NEFROPATIA DIABETICA roideas inducen receptores hepáticos del EGF, lo que puede ser un mecanismo de cómo ciertas hormonas pueden modificar la acción de FC locales 81, 82. La excreción urinaria de EGF disminuye cuando empeora la función renal, tanto en la enfermedad diabética como en la no diabética 83-85. Sin embargo, el mal control de la glucemia está asociado con el aumento de la excreción de EGF en orina en pacientes con función renal buena 83, aunque la excreción renal de EGF no se correlaciona con la de glucosa. La fuente del EGF urinario no está clara, aunque parece que el lugar principal de síntesis es la célula tubular 85. Pese a todo lo dicho, el ARNm del EGF glomerular no se altera entre 4 y 24 semanas después de la instauración de la diabetes, lo que parece indicar que el EGF no tiene un papel muy importante en la ND 73. El EGF participa en la regeneración de las células tubulares después de un daño 86. Análogamente, en la diabetes podría tener también función protectora. TGF-b El factor de crecimiento transformante b pertenece a una familia de citoquinas multifuncionales que participan en la regulación del desarrollo y de la reparación de tejidos. Son proteínas diméricas y, en mamíferos existen 3 isoformas distintas (1, 2 y 3). La regulación de la expresión de los genes del TGF-b implica la transcripción de factores como el complejo AP-1 y la expresión de c-fos y c-jun 87. La propiedad más importante del TGF-b1 es la regulación de la síntesis de proteínas de la matriz y la inmunomodulación, mientras que el TGFb2 coordina los procesos morfogenéticos 88. El TGF-b1 se produce principalmente en las células intersticiales y los macrófagos, aunque las células tubulares también contribuyen, pero en menor proporción. Inicialmente se secreta como una molécula latente, que requiere proteólisis para su activación 89. Se une a receptores específicos de la superficie celular. Los receptores I y II (serina-treonina quinasas) están involucrados en la traducción de la señal y el receptor tipo III (betaglicano) y la endoglina son receptores no señalizantes 90, 91. Para que el TGF-b ejerza sus acciones biológicas es necesario que se una a complejos heterodiméricos de los receptores I y II o a homodímeros del receptor de tipo II. La endoglina se une a las isoformas 1 y 3 del TGF-b y puede formar complejos con los receptores I y II 92, lo que indica que la endoglina puede actuar como un modulador de las interacciones del TGF-b con sus receptores señalizantes. La traducción de la señal inducida por TGF-b y mediada por el receptor lleva a procesos intracelulares como suspensión de la transcripción de c-myc, regulación a la baja de las tirosinas quinasas de la familia src, fosforilación de proteínas, inducción de erg-1, posiblemente mediada por H2O2 estimulada por TGF-b o inducción de otros factores de crecimiento como PDGF 88. Se ha demostrado en estudios experimentales que factores como la Ang II, la hiperglucemia, las proteínas glicosiladas y el estiramiento de las células mesangiales estimulan directamente la expresión de TGF-b 24, 93-95. El daño tisular, en general, provoca un aumento de la expresión del TGF-b por liberación en la degranulación de las plaquetas, por liberación de los depósitos de TGF-b dentro de la matriz extracelular o por ambos 87, 96, 97. En el curso de la reparación tisular normal ese aumento se suprime, pero en la fibrosis, el proceso de supresión puede estar defectuoso. Una deficiencia del proteoglicano decorina puede contribuir a la sobreexpresión del TGF-b 98. La síntesis de decorina se induce por TGF-b y, a su vez, la decorina puede neutralizar la acción del TGF-b 99, 100. A partir de diferentes experimentos realizados in vitro e in vivo, sobre todo en los modelos de glomerulonefritis inducida por anticuerpos antitimocitos 101 y en fibrosis pulmonar inducida por bleomicina 98 puede concluirse que la decorina puede interrumpir el círculo de autoinducción de TGF-b y, por tanto, proteger frente a la acumulación de matriz que sigue el daño tisular. De este modo, la deficiencia en decorina de un determinado tejido puede ser un mecanismo importante en el desarrollo de la fibrosis progresiva 88. La ND es un modelo que ha contribuido a la comprensión de la sobreexpresión sostenida de TGF-b en las enfermedades renales crónicas. En un estudio realizado in vitro se observó que el crecimiento de células mesangiales en suero con glucosa elevada, causa sobreexpresión de TGF-b directamente 93. El mecanismo por el que la hiperglucemia estimula la expresión de TGF-b no está claro, pero la prevención de los episodios de glucemia alta en pacientes diabéticos disminuye las complicaciones de la diabetes en distintos órganos 102. Además, la supresión del SRA por inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina (IECAs) disminuye el deterioro de la función renal en pacientes con ND y también con otras glomerulopatías. La Ang II siempre se ha considerado como un mediador endógeno del daño renal progresivo, principalmente a través de sus efectos en la presión intraglomerular 17. Son varios los autores que han confirmado que la Ang II es un inductor muy potente 453 B. GALLEGO y cols. de la expresión y actividad del TGF-b en células renales en cultivo 24, 103. En células mesangiales en cultivo, la Ang II también provoca hipertrofia y producción de proteínas de la matriz a través de un mecanismo dependiente de TGF-b 24. Este punto de vista ayuda a explicar el efecto superior de los IECAs en las enfermedades renales en comparación a otros antihipertensivos. El TGF-b induce fibrogénesis a través de tres mecanismos distintos 87, 96, 97: Directamente, induce la expresión génica de proteínas de la matriz, como colágeno, fibronectina y proteoglicanos. También regula a la alta los inhibidores de proteinasas (PAI-1, TIMP-1) y, de esta forma, inhíbe la degradación de la matriz acumulada. Además regula la expresión de integrinas implicadas en el control del ensamblaje de la matriz. La activación crónica del TGF-b contribuye a la acumulación patológica de la matriz extracelular en la fibrosis túbulo-intersticial progresiva que tiene lugar en la diabetes 101, 104-108. El TGF-b es, de todos los FC, el que mejor podría explicar la acumulación progresiva de matriz extracelular en la diabetes, dado que es único en estimular la síntesis de componentes de la matriz, en inhibir su degradación y en inhibir la proliferación de células mesangiales. Sin embargo, la acción del TGF-b no explica suficientemente hechos, tan característicos del daño diabético, como la hiperfiltración glomerular, la ausencia de colágeno I (el TGFb normalmente también estimula la síntesis de colágeno intersticial) y la disminución en el contenido glomerular de perlecan en pacientes diabéticos (el TGF-b estimula la expresión del proteoglicano heparan sulfato perlecan) 4. En resumen, las citoquinas y FC implicados en la nefropatía diabética son muy numerosos y sus interacciones son muy complejas. Además, algunos de ellos como el factor de necrosis tumoral (TNF-a), interleukinas, endotelina o la propia Ang II no se han incluido en esta revisión, ya que se extendería demasiado. 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