NEFROLOGÍA. Vol. XXV. Número 2. 2005 Estrés oxidativo de las lipoproteínas y efecto antioxidante de la vitamina C un año después de iniciar hemodiálisis R. Ramos*, N. Gómez-Geriqué** y A. Martínez-Castelao* *Servicio de Nefrología y **Unitat de Recerca Experimental (URE). Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge. L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona. RESUMEN Hemos estudiado el perfil lipídico y el estado oxidativo de las lipoproteínas en pacientes con insuficiencia renal crónica terminal (IRCT) que inician programa de hemodiálisis, evaluando el posible efecto de la hemodiálisis y de la administración de un antioxidante, como la vitamina C, al cabo de un año. Métodos: Se incluyeron 41 pacientes con IRCT que iniciaron programa de hemodiálisis crónica entre enero del 1999 y enero del 2000 y que fueron randomizados para recibir 1.000 mg /día de vitamina C o placebo antes del inicio del tratamiento sustitutivo renal (TSR). Se analizó el perfil lipídico y la susceptibilidad de la LDL y de la HDL a la oxidación, utilizando sulfato de cobre, en el momento de la inclusión y un año después de haber empezado el TSR y el antioxidante. Resultados: No se hallaron diferencias significativas en cuanto al estado oxidativo entre los pacientes tratados y los que no recibieron tratamiento con vitamina C. En nuestros pacientes, la hemodiálisis por sí, no sólo no provocó efectos deletéreos sobre el perfil lipídico sino que incluso, éste mejoró discretamente, paralelamente a la corrección parcial de la uremia, observándose descenso de colesterol LDL y de los fosfolípidos en todos los pacientes al cabo de un año de TSR. Respecto a los productos derivados de la oxidación, aunque las diferencias no resultaron significativas, los parámetros descendieron discretamente en aquellos pacientes que habían recibido el tratamiento antioxidante. Conclusiones: La corrección parcial de la uremia mediante el inicio de hemodiálisis puede mejorar el perfil lipídico de los pacientes con Insuficiencia renal crónica terminal, los cuales presentan un estado pro-oxidativo atribuible a la uremia per se. Aunque nuestros resultados no mostraron diferencias significativas entre aquéllos tratados con vitamina C frente a los que recibieron placebo, pareció existir una tendencia al cabo de un año a la disminución de los productos derivados de la oxidación en nuestros pacientes, lo que podría implicar un efecto beneficioso sobre la peroxidación lipídica. Palabras clave: Antioxidantes. Estrés oxidativo. Vitamina C. Oxidación de LDL. Hemodiálisis. Recibido: 4-V-2004. En versión definitiva: 10-IX-2004. Aceptado: 19-IX-2004. Correspondencia: Alberto M. Castelao, MD Servicio de Nefrología Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge C/ Feixa Llarga, s/n 08907 l'Hospitalet del Llobregat (Barcelona) E-mail: amcastel@terra.es 178 ESTRÉS OXIDATIVO DE LAS LIPOPROTEÍNAS LIPOPROTEIN OXIDATION PROFILE IN END STAGE RENAL DISEASE PATIENTS. ROLE OF VITAMIN C SUPPLEMENTATION SUMMARY Background: The aim of the study was to analyze the lipid and lipoprotein oxidation profile in patients with end stage renal disease who started haemodialysis and also to evaluate the possible effect of haemodialysis and vitamin C supplementation on lipoprotein oxidation one year after the initiation of the therapy. Methods: Forty-one end stage renal disease patients who started haemodialysis between january 1999 and january 2000 were enrolled in the study. The patients were randomised to receive 1,000 mg /day of vitamin C or placebo and then hemodialysis was initiated. We measured the lipid profile and the susceptibility of LDL and HDL to oxidation using cooper ions, at the moment of inclusion and oneyear after the treatment. Results: No significant differences were observed among the vitamin-C treated patients and those who received placebo. Our results show that haemodialysis by itself did not induce deletereous effects on the lipid profile, which was slightly improved. A small decrease in total cholesterol - 183 to 164 mg/dl (group A), 170 to 144 mg/dl (group B); in LDL cholesterol (100 mg/dl to 79 mg/dl (group A), 88 mg/dl to 73 mg/dl (Group B); and in phospholipids [198 to 188 mg/dl, group A (Group A), 195 mg/dl to 178 mg/dl (Group B)], was observed in all the patients one year after starting haemodialysis. When considering oxidation-derivative products, the lag phase of LDL-cholesterol and HDL-cholesterol was enlarged but without statistical significance. A tendency to increase the vitamin E generation in HDL and LDL lipoproteins was observed in vitamin-C treated patients, but the difference still remained not significant. Conclusions: Haemodialysis by itself could improve lipid profile in patients with a previous pro-oxidative state such as uraemia. Although our results have failed to demonstrate significant differences between vitamin C-treated and not treated patients, the tendency to decrease oxidation products by supplementation of vitamin C could mean a beneficial effect on oxidation parameters. In order to improve oxidative stress, the use of lipophylic more than hydrophilic vitamins could be evaluated in randomized studies with a more important number of patients. Key words: Antioxidants. Oxidative stress. Vitamin C. LDL oxidation. Haemodialysis. INTRODUCCIÓN El estrés oxidativo define un desequilibrio entre la formación de especies reactivas al oxígeno (ROS) y los mecanismos de defensa antioxidante. En los últimos años se están acumulando evidencias que muestran la asociación entre uremia, incremento del estrés oxidativo y una alta incidencia de aterosclerosis prematura 1. La uremia asociada a dislipemia, hipertensión arterial o a la propia causa de la enfermedad renal, como por ejemplo la diabetes, han sido implicados como mecanismos subyacentes. Algunos estudios refieren un riesgo relativo de muerte por infarto como mínimo cinco veces mayor en los pacientes en tratamiento renal sustitutivo con respecto a la población general 2. Se ha sugerido también que el tratamiento sustitutivo en los pacientes urémicos mediante hemodiálisis o diálisis peritoneal puede contribuir particularmente al estrés oxidativo y a reducir los niveles de antioxidantes en estos pacientes. La pérdida o el déficit de la actividad antioxidante, por ejemplo de vitamina E, puede también contribuir al aumento del estrés oxidativo en la uremia. Boaz y cols. 3 han demostrado que en pacientes en programa de hemodiálisis periódica y con enfermedad cardiovascular, los suplementos de 800 IU/día de vitamina E reducen los episodios cardiovascula179 R. RAMOS y cols. res totales y el infarto de miocardio. También se ha demostrado que los episodios cardiovasculares en pacientes en hemodiálisis pueden ser prevenidos con la administración de acetilcisteína 4. Sin embargo estos hallazgos no han sido confirmados por otros autores. Schulz y cols., en un estudio con 12 pacientes, han analizado el posible efecto acelerador de la ateroesclerosis atribuido a las membranas de cuprofán, no encontrando reducción alguna de las defensas antioxidantes de las lipoproteínas en células activadas durante las sesiones de hemodiálisis 5. El interés del análisis del estrés oxidativo se ha incrementado notablemente en los últimos tiempos, debido a diversos estudios que han valorado el efecto de tratamientos antioxidantes para prevenir las enfermedades cardiovasculares, con resultados variados y controvertidos. El objetivo de nuestro estudio fue analizar el perfil lipídico y el estado de peroxidación lipídica de los pacientes que inician tratamiento sustitutivo renal mediante hemodiálisis y valorar si el efecto antioxidante de la vitamina C puede ser efectivo y contribuir así a la prevención de la aterosclerosis en estos pacientes. PACIENTES Y MÉTODOS Pacientes Se estudiaron varios parámetros de la oxidación lipídica en pacientes con insuficiencia renal terminal de forma basal (antes del inicio del programa de hemodiálisis periódica) y al cabo de un año del inicio, comparando los resultados después de la administración de 1 g/día de vitamina C versus placebo. La administración de vitamina C se iniciaba el primer día del comienzo de la terapia sustitutiva. Se recogieron también algunos parámetros nutricionales (albúmina en plasma) e inflamatorios (Proteína C reactiva, PCR). Se incluyeron 41 pacientes consecutivos que iniciaron hemodiálisis en nuestro centro entre enero de 1999 y enero del 2000. Todos ellos firmaron el consentimiento informado, antes de ser randomizados para recibir 1 g de vitamina C al día (n = 21, grupo A) o placebo (n = 20, grupo B). Sólo 34 pacientes finalizaron el estudio (11 mujeres y 23 hombres). La media de edad fue de 57 ± 17años. Los restantes 7 pacientes no finalizaron el estudio por fallecimiento (2 pacientes, como resultado de complicaciones cardiovasculares), trasplante renal (3 pacientes) y pérdida de seguimiento (2 pacientes fueron transferidos a otro hospital). El índice de masa corporal medio fue 180 de 23,11 ± 2,1 kg/m2. Todos los pacientes fueron tratados con hierro endovenoso desde el inicio de la terapia hemodialítica con dosis media de hierro entre 62,5 mg y 125 mg semanales. Las características de hemodiálisis se mantuvieron constantes a lo largo del estudio. Se utilizaron membranas de polisulfona y recibieron 3 sesiones de hemodiálisis por semana de 225 minutos de media cada una de ellas. El flujo del baño de diálisis se mantuvo estable a lo largo del período estudiado (500 ml/min) y el flujo de sangre (Qb) fue entre 270 y 330 ml/minuto. Todos los pacientes recibieron dosis estándar de heparina de bajo peso molecular durante las sesiones de hemodiálisis. 20 pacientes iniciaron hemodiálisis mediante fístula arteriovenosa nativa (59%) y 14 lo hicieron mediante catéter temporal (14%). Veintiocho pacientes recibían tratamiento antihipertensivo (-bloqueantes: n = 6; Calcio antagonistas: n = 10; inhibidores del enzima conversor de la angiotensina, IECA: n = 5; otros: n = 7). Se excluyeron del estudio los pacientes diabéticos, los que presentaban tumores malignos o aquéllos que recibían tratamiento hipolipemiante con estatinas. Métodos La muestra de sangre fue obtenida durante la última visita de los pacientes a Consultas, antes de iniciar la primera sesión de hemodiálisis y del inicio del tratamiento con la vitamina C. El período de seguimiento fue de 365 días y durante este tiempo todos los pacientes recibieron 3 sesiones de hemodiálisis a la semana, con membranas de hemofán o acetato de celulosa. Una nueva muestra de sangre fue obtenida al finalizar este período. En cada muestra se recogía un volumen de 10 ml de sangre total en tubos de gelosa standard y eran centrifugados a 3.000 × g, 4 ºC, 10 minutos. Posteriormente se analizaba en plasma bioquímica, hematología y hemostasia mediante HITACHI 747 y reactivos Boehringer Mannheim (Alemania). Se determinaron apolipoproteína A y B, lipoproteína (a) y lipoperóxidos (LPO). Se midieron las sustancias reactivas al ácido thiobarbitúrico (TBARS), definidos como la cantidad de productos de condensación cromógena que se forman en el plasma después de añadir ácido thiobarbitúrico frente una curva elaborada con malondialdehído Standard. LDL y HDL aislamiento Las fracciones lipoproteicas de alta y baja densidad (HDL y LDL) fueron obtenidas mediante una ultracentrifugación preparativa de las lipoproteínas con ESTRÉS OXIDATIVO DE LAS LIPOPROTEÍNAS Tabla I. Perfil lipídico antes y un año después del inicio de hemodiálisis Grupo A (Vit. C) Antes HD Colesterol total (mg(dl) Triglicéridos (mg/dl) Fosfolípidos (mg/dl) LDL colesterol (mg/dl LDL) HDL colesterol (mg/gHDL) LPO (mg/dl) Lp (a) (mg/dl) 183,31 ± 57,3 132,63 ± 86,5 198,31 ± 44,7 100,34 ± 50,58 50,27 ± 23,10 20,97 ± 15,71 48,47 ± 49,29 Un año post HD 164,81 ± 30,6 ns 151,35 ± 171 ns 188,39 ± 44,5 ns 79,40 ± 30,97 ns 47,18 ± 31,3 ns 85,84 ± 96,11 ns 52,97 ± 62,52 ns Grupo B (placebo) Antes HD 170,22 ± 39,1 144,78 ± 60,8 195 ± 29,22 88,60 ± 27,03 48,7 ± 16,8 26,6 ± 30,91 38,33 ± 52 Un año post HD 144,83 ± 24,2 ns 114,78 ± 46 ns 178,11 ± 27,02 ns 73,19 ± 22,66 ns 40,05 ± 15,59 ns 47,37 ± 26,70 ns 31,46 ± 45,58 ns un rotor Beckman SW 41 a 40.000-rpm y 10 ºC durante 24 horas. (Lipid Research Clinics-Quanlitop, Immuno, Viena.) Composición de las lipoproteínas El contenido de proteínas, colesterol total, colesterol libre, triglicéridos y fosfolípidos fue medido tanto en las LDL como en las HDL de todas las muestras. TBARs y LPO se determinaron también para cada fracción de lipoproteínas. Oxidación de las lipoproteínas Las fracciones aisladas de LDL y HDL fueron diluidas con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a concentración de 50 µg de proteína/ml. Se añadió ión clorhidro de cobre (I) hasta obtener una concentración de 2 µM iones de Cu2+ y fueron incubados a 37 ºC. Se monitorizó la producción de compuestos diénicos (CD) de forma continuada grabándose en un espectrofotómetro con una absorbancia de 234 nm. A su vez, se utilizó una salida del espectrofotómetro para analizar la fase lag al inicio de la oxidación. Contenido de vitamina E en LDL y HDL Muestras de LDL y HDL fueron analizadas para la vitamina E siguiendo la metodología de Tsen. Análisis estadístico Los resultados se expresan como media ± desviación standard. El utilizó el test de Student-Fischer para estimar las diferencias entre los dos grupos (A = tratados con vitamina C; B = placebo) antes del inicio de la terapia sustitutiva con hemodiálisis y un año después. La significación aceptada fue de < 0,05. El análisis descriptivo fue realizado con el programa estadístico SPSS. RESULTADOS Las características de hemodiálisis se mantuvieron estables a lo largo del estudio respecto a dosis de hemodiálisis, flujo de sangre (Qb), tratamiento con hierro y dosis de heparina utilizada. No se observaron diferencias entre los pacientes dializados mediante fístula arteriovenosa respecto a los que la iniciaron mediante catéter en los resultados finales. Solamente 13% de los pacientes incluidos mantuvieron función renal residual al año del inicio del tratamiento sustitutivo. No existieron diferencias significativas cuando se comparó el perfil lipídico de los pacientes tratados con vitamina C (grupo A) frente a los no tratados (grupo B), ni respecto a la analítica basal ni un año después del inicio de la hemodiálisis. En la tabla I se resume el perfil lipídico de ambos grupos. Respecto a la lipoproteína (a) no se mostraron diferencias entre los grupos, observándose un incremento no significativo en el grupo tratado con vitamina C y un descenso no significativo en el grupo placebo al cabo de un año en todos los pacientes. No se constataron diferencias significativas en las absorbancias iniciales de la fase lag en las LDL ni HDL, así como tampoco en los conjugados diénico (tabla II). Los TBARS (productos derivados de la oxidación) se elevaron no significativamente al cabo de un año en ambos grupos, si bien dicha elevación fue ligeramente menor en los pacientes tratados con vitamina C (tabla III). Los niveles de vitamina E en las LDL se incrementaron de forma significativa, en los pacientes tra181 R. RAMOS y cols. Tabla II. Fase Lag y compuestos diénicos Grupo A (Vitamina C) Antes HD Fase LAG/LDL (min) Fase LAG/HDL (min) Tmax/LDL (min) Tmax/HDL (min) CD iniciales/LDL CD iniciales/HDL Tasa propagación/LDL Tasa propagación/HDL 42' 27' 86' 63' 49 64 1,94 1,88 Después 1a-HD 46' 17' 93' 59' 48 52 1,75 1,35 Antes HD 37' 20' 63' 68' 46 46 2,20 1,41 Grupo B (placebo) Después 1a-HD 41 18' 59' 66' 49 51 1,87 1,46 p ns ns ns ns ns ns ns 0,042 Tmax = tasa máxima oxidación. CD = compuestos diénicos. tados con vitamina C. El contenido de vitamina E en las HDL se incrementó de forma significativa en los pacientes tratados con vitamina C y disminuyó en el grupo placebo, al cabo de un año de TSR. (tabla IV), No existieron diferencias significativas respecto a la Proteína C reactiva y la albúmina entre ambos grupos, no existiendo correlación entre los marcadores de estrés oxidativo y el estado inflamatorio (PCR) al final del estudio (tabla V). Aunque en el presente estudio no se evaluaron los niveles de oxalato, ninguno de los pacientes tratados con vitamina C presentó clínica de litiasis ni otras complicaciones atribuibles a la misma a lo largo del estudio. DISCUSIÓN Recientemente Himmelfarb y cols. 6 han propuesto que el estrés oxidativo podría ser el nexo de unión entre las complicaciones cardiovasculares y la uremia. El estrés oxidativo está considerado como la «cantidad total de productos de la oxidación» frente a la «cantidad total de antioxidantes». Como bien des- cribe Wratten 7, esta definición puede llevar a errores en la estimación de la importancia fisiológica del estrés oxidativo. En contra de lo que sugiere Toborek 8 afirmando que existe una intensificación de la lipo-peroxidación lipídica en aquellos pacientes con insuficiencia renal crónica que reciben hemodiálisis y que dicha terapia sustitutiva puede acelerar la aterosclerosis debido a un aumento de la peroxidación, nosotros no hemos encontrado diferencias significativas en nuestros pacientes que iniciaron hemodiálisis con respecto a dicho perfil un año después de tratamiento, si bien existió una tendencia a disminuir los niveles de colesterol total, colesterol LDL y fosfolípidos en los dos grupos, en concordancia con los resultados de Heimann9 y Sakurai 10. Himmelfarb y cols.6 afirman que el estado proaterogénico existente en la uremia puede mejorar con la terapia dialítica. En nuestro caso no hubo diferencias entre los parámetros derivados de la oxidación antes y después del inicio de la hemodiálisis, independientemente de si habían sido tratados o no con vitamina C (tabla I). Aunque sí variaron algunos parámetros del perfil lipídico, como el colesterol total (en ambos grupos: tratados y no tratados), fosfolípidos, y colesterol de las LDL, también disminu- Tabla III. Niveles de TBARs antes de iniciar HD y un año después de HD Grupo A (Vitamina C) Antes HD TBARS LDL (ng/gLDL) TBARS HDL (ng/gHDL) 0,25 0,21 Año después HD 0,38 0,31 Antes HD 0,28 0,20 Grupo B (placebo) Año después HD 0,46 0,27 p ns ns TBARS = sustancias reactivas al ácido thiobarbitúrico. 182 ESTRÉS OXIDATIVO DE LAS LIPOPROTEÍNAS Tabla IV. Niveles de Vitamina E Grupo A (Vitamina C) Antes HD Vitamina E (µmol)/ gr LDL Vitamina E (µmol)/ gr HDL 1,82 1,10 1 año después HD 2,96 1,60 Antes HD 0,98 1,59 Grupo B (placebo) 1 año después HD 1,05 0,59 p ns ns yó el colesterol de las HDL. Ninguno de estos cambios tuvo significación estadística. Ello no nos permite corroborar la hipótesis de Himmelfarb. Algunos estudios han demostrado que la modificación oxidativa de las LDL podría explicar la aterosclerosis acelerada que presentan los pacientes en hemodiálisis, en ausencia de mayores elevaciones de LDL nativa. Por consiguiente cabría esperar una reducción de la fase lag en estos pacientes 11. En el presente estudio observamos un acortamiento muy discreto y no significativo de la fase lag de las LDL, así como un discreto alargamiento, no significativo, en la fase lag de las HDL, 12 meses después de iniciado el tratamiento hemodialítico. Y ello fue similar en ambos grupos. De estos datos podríamos deducir que la hemodiálisis per se no ha conllevado un aumento del estado oxidativo en nuestros pacientes. Tampoco las diferencias entre Proteína C reactiva antes y después del inicio de la hemodiálisis (independientemente del tratamiento o no con vitamina C, demuestran que ésta sea causa del mantenimiento del estado inflamatorio y pro-oxidativo en el paciente hemodializado. Con respecto al total de substancias reactivas al ácido thiobarbitúrico (TBARS), que constituyen uno de los marcadores de estrés oxidativo, algunos autores han encontrado que este producto de la lipoperoxidación está elevado en pacientes en hemodiálisis y que a su vez, se produce un aumento de LPO 12-15. En nuestro trabajo hemos hallado un aumento no significativo de TBARS junto con un incremento de los LPO tras 12 meses de haber iniciado hemodiálisis. No obstante, los niveles de TBARs se incrementaron en menor medida al cabo de un año del inicio de hemodiálisis en nuestros pacientes tratados con vitamina C, mientras que sí lo hicieron en el grupo placebo. Este hallazgo constituiría un argumento en favor del tratamiento con vitamina C en este tipo de pacientes. Aunque las diferencias entre los LPOs, antes y después del inicio del tratamiento sustitutivo eran mayores que las de los TBARs, éstas se equiparaban si excluíamos un caso de «outside» (valor extremo que correspondía al paciente nº 27). Por otra parte, durante la sesión de hemodiálisis, la concentración de antioxidantes hidrosolubles como la vitamina C es muy baja16 siendo muy difícil en esta situación conseguir niveles efectivos de los mismos. Aunque algunos autores han detectado un descenso en los niveles de TBARs en plasma usando suplementos de vitamina C en la dieta, en comparación con controles, los resultados son tan controvertidos, que creemos que la utilidad de la la vitamina C debería ser cuidadosamente evaluada 17. Por otro lado, es bien conocido que la vitamina E es el mayor antioxidante de fase lipídica y que para frenar el estado pro-oxidativo cabría alcanzar altos contenidos de vitamina E en las LDL. Nuestros resultados muestran que el contenido de vitamina E de las lipoproteínas fue más elevado al cabo de 1 año de iniciar tratamiento substitutivo sólo en aquellos pacientes que habían sido tratados con vitamina C. Este hecho podría explicarse como consecuencia de las propiedades de regeneración de la vitamina C incrementando la vitamina E; proceso que tendría lugar durante el recambio acuoso de la hemodiálisis. Aunque la vitamina E está localizada en las membranas y la vitamina C en las fases acuo- Tabla V. Parámetros de nutrición y de inflamación Grupo A Antes HD Albúmina plasma(g/dl) PCR (mg/l) PCR = proteína C reactiva. Grupo B Antes HD 38 + 3 6,9 + 4 1 año después HD 40 + 3 7,4 + 3 p ns ns 1 año después HD 40 + 4 6,3 + 4 39 + 4 6,1 + 3 183 R. RAMOS y cols. sas, la vitamina C es capaz de regenerarse en vitamina E, permitiendo que rompa la cadena del estrés oxidativo y que el efecto scavenger de la propia vitamina E durante la lipoperoxidación sea mantenido mientras el ácido ascórbico de la vitamina C esté presente 18-20. En conclusión, creemos que la hemodiálisis, por sí misma, no empeora, sino que podría parcialmente contribuir a mejorar el perfil lipídico de los pacientes urémicos con insuficiencia renal crónica terminal, que además presentan un estado pro-oxidativo en esa fase avanzada de la enfermedad renal. Aunque nuestros resultados no demuestran diferencias significativas en cuanto al estrés oxidativo, la tendencia a disminuir productos resultantes de la oxidación --como los TBARs--, en aquellos pacientes tratados con vitamina C y el incremento de los niveles de vitamina E en las LDL podría significar una tendencia a mejorar los parámetros de la peroxidación lipídica. Nuestros hallazgos, en concordancia con los de algunos autores, podrían plantear la conveniencia de tratamiento con suplementos de vitaminas antioxidantes lipofílicas, como la vitamina E, mejor que con las hidrofílicas, como la vitamina C. Para ello serían necesarios estudios randomizados, con un número suficiente de pacientes, que ayudaran a confirmar estas hipótesis. BIBLIOGRAFÍA 1. Loughrey CM, Young IS, McEneny J, McDowell FW, McMaster C, McNamee P, Trimble ER: Oxidation of low-density lipoprotein in patients on regular haemodialysis. Atherosclerosis 110: 185-193, 1994. 2. Raine AEG, MacMahon SH, Selwood NH, Wing AJ and Brunner FP: Mortality from myocardical infarction in patients on renal replacement therapy. Nephrol Dial Transplant 6: 902, 1991. 3. 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