NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Número 5. 2001 ORIGINALES Enfermedad de Bartter neonatal diagnosticada mediante la detección de una mutación en el gen KCNJ1 que codifica la síntesis del canal renal de potasio ROMK1 V. García Nieto, D. Müller*, W. van der Vliet* y F. Claverie-Martín** Unidades de Nefrología Pediátrica y de **Investigación. Hospital Ntra. Sra. de Candelaria. Santa Cruz de Tenerife. *Department of Cell Physiology. University of Nijmegen. Nijmegen. The Netherlands. RESUMEN Se comunican los datos clínicos de una paciente diagnosticada de síndrome de Bartter aunque, inicialmente se sospechó que estuviera afecta de hipercalciuria idiopática y, posteriormente, de síndrome de hiperprostaglandinismo E2. Fue producto de un embarazo pretérmino en el que se constató polihidramnios. Durante los dos primeros años de vida, a pesar de evidenciarse retraso ponderal importante, poliuria y tendencia especial a la deshidratación, no tenía hipopotasemia. El equilibrio ácido-base durante ese tiempo fue normal, salvo acidosis metabólica en los primeros días de vida. Tras apreciarse hipercalciuria, fue tratada con tiazidas y dieta pobre en sal. Con este tratamiento se observó con frecuencia alcalosis hipopotasémica. Posteriormente, la posibilidad técnica de determinar los niveles de renina y de aldosterona y la eliminación urinaria de PGE2 permitió sospechar el diagnóstico. El análisis de la secuencia del DNA mostró que la paciente es portadora de una mutación homocigota en el gen KCNJ1, que codifica la síntesis del canal renal de potasio ROMK1. Esta mutación cambia una C por una T en el nucleótido 1537 (CGA > TGA) que hace que el codón de arginina en la posición 338 se convierta en un codón de terminación (Arg338Stop) y da lugar a una proteína truncada. Esta mutación es la primera vez que se describe en España. La detección de esta mutación confirmó una enfermedad de diagnóstico confuso en los primeros años de vida. Palabras clave: Síndrome de Bartter. Gen KCNJ1. Mutación. Canal de potasio ROMK1. Recibido: 13-XII-2000. En versión definitiva: 15-V-2001. Aceptado: 17-V-2001. Correspondencia: Dr. Víctor García Nieto Unidad de Nefrología Pediátrica Hospital Ntra. Sra. de Candelaria Ctra. del Rosario, s/n. 38010 Santa Cruz de Tenerife 448 ENFERMEDAD DE BARTTER NEONATAL NEONATAL BARTTER'S DISEASE DIAGNOSED BY DETECTING A MUTATION IN THE KCNJ1 GENE WHICH CODES FOR THE RENAL POTASSIUM CHANNEL ROMK1 SUMMARY We report clinical data of a female patient with Bartter's syndrome who was initially diagnosed with idiophatic hypercalciuria and, subsequently, with hyperprostaglandin E, syndrome. The patient was born after premature delivery with a history of polyhydramnios. During the first two years of life, in spite of evidence for significant failure to thrive, polyuria and special tendency to dehydration, she had no hypokalemia. The acid-base balance was normal except metabolic acidosis during the first few days after she was born. When hypercalciuria was observed, she was treated with thiazides and a low-salt diet. With such treatment she frequently showed hypokalemic alkalosis. Afterwards, once it was possible to determine the levels of renin and aldosterone and the urinary excretion of PGE2, we suspected the diagnosis. DNA sequencing analysis showed that the patient carried a homozygotic mutation in the KCNJ1 gene, coding for the potassium channel ROMK, which results in the premature termination of the protein. It is the first time that this mutation has been found in Spain. The detection of this mutation confirmed a disease that was initially of uncertain diagnosis. Key words: Neonatal Bartter's disease. KCNJ1 gen. Renal potassium channel ROMK1. INTRODUCCIÓN En 1962, Bartter y cols. comunicaron los datos clínicos correspondientes a dos pacientes afectos de un nuevo síndrome caracterizado por hipertrofia e hiperplasia del aparato yuxtaglomerular, hiperaldosteronismo con presión arterial normal, alcalosis metabólica hipopotasémica y defecto de la capacidad de concentración renal resistente a la acción de la pitresina. En ambos sujetos, se demostró un incremento de los niveles circulantes de angiotensina; además, la infusión de angiotensina II produjo un aumento de la tensión arterial considerablemente menor que el incremento inducido por dosis similares en sujetos normales 1. En los pacientes afectos, los síntomas clínicos corresponden principalmente a los relacionados con la hipopotasemia, como debilidad muscular que puede llegar a tetraparesia fláccida. Otros síntomas son poliuria y enuresis nocturna, vómitos, estreñimiento, apetencia por la sal y retraso del crecimiento. Desde hace años se suponía que la causa primaria debía ser un defecto en el cotransportador tubular de sodio, potasio y cloro (Na-K-2Cl) localizado en la rama ascendente gruesa del asa de Henle 2, sobre el que actúan algunos diuréticos como furosemida y bumetanida. Hallazgos recientes han establecido la heterogeneidad genética del síndrome de Bartter permitiendo distinguir entre una forma muy grave de presentación antenatal (enfermedad de Bartter neonatal) y una forma de aparición algo más tardía, durante los primeros años de la vida (enfermedad de Bartter «clásica»). En la enfermedad de Bartter neonatal se han identificado mutaciones en el gen SLC12A1 (NKCC2), localizado en 15q15-21, que codifica el cotransportador luminal Na-K2CI sensible a bumetanida o NKCC2 3 (Bartter neonatal tipo I) y en el gen KCNJ1, localizado en el cromosoma 11q24-25, que codifica la síntesis del canal renal de potasio ROMK1 (Bartter neonatal tipo II) 4-8. En la enfermedad de Bartter «clásica» (tipo III) se han identificado mutaciones en el gen CLCNKB situado en 1p36, codificador del canal renal de cloro CIC-Kb 9. No obstante, existe otra variedad de enfermedad de Bartter que se asocia a sordera nerviosa y que depende de mutaciones de un gen, aún desconocido, situado en 1p31 10. La mayoría de las mutaciones del gen KCNJ1 de pacientes con la enfermedad de Bartter neonatal tipo II 4, 5 están localizadas en el exón 5. Este gen, localizado en 11q24-25, ha sido clonado y secuenciado 6, 7. Contiene cinco exones que se utilizan en distintas combinaciones para producir cinco isoformas 449 V. GARCÍA NIETO y cols. Tabla I. Determinaciones plasmáticas y urinarias en distintas edades 16 meses Pcr (mg/dl) Ccr (ml/min/1,73 m2) PNa+ (mEq/l) PK+ (mEq/l) PCI­ (mEq/l) PCOH3­ (mEq/l) PMg (mg/dl) Purico (mg/dl) Uvolumen (mI/día) Uvolumen (ml/100 ml GFR) EFNa (%) EFK (%) EFCl (%) TRP (%) UCa (mg/kg/día) UMg (mg/kg/día) 0,45 142 4,4 101 21-24 2,1 6,0 1.200 ­ ­ ­ ­ 71,6 7,86 1,3 5 años 0,8 135 135 2,7 90 32 2,3 6,4 3.215 4,4 2,7 19,2 2,3 85,6 11,7 3,7 11 años 0,9 92,8 143 3,9 106 ­ 2,4 7,2 3.060 5,06 0,78 27,4 0,74 83,6 12,7 3,5 24 años 1,05 75,2 143,7 3,59 107,7 ­ 2,02 7,8 5.200 6,77 1,42 26,7 1,41 84,1 9,9 4,5 Ccr: aclaramiento de creatinina. Pcr, PNa, PK, PCl, PHC03­, PMg, Purico: Niveles plasmáticos de creatinina, sodio, potasio, cloro, bicarbonato y ácido úrico, respectivamente. EFNa, EFK, EFCl: Excreciones fraccionales de sodio, potasio y cloro, respectivamente. TRP: Reabsorción tubular de fosfato. UCa y UMg: eliminación urinaria de calcio y magnesio, respectivamente. del canal renal de potasio ROMK1 que difieren en el extremo amino. Todas las isoformas comparten los 372 aminoácidos codificados por el exón 5, y se expresan en el riñón, específicamente en la membrana apical de las células de la rama ascendente del asa de Henle así como también en la nefrona distal 8. ROMK1 es una proteína con dos dominios intramembranarios que contienen el poro o canal y dos segmentos citosólicos amino y carboxi terminales 5. Presentamos una paciente afecta de enfermedad de Bartter neonatal tipo II cuyo diagnóstico, inicialmente incierto, ha sido confirmado tras el hallazgo de una mutación en uno de los genes implicados en la enfermedad. PACIENTE, MATERIAL Y MÉTODOS Paciente Recién nacida producto de un embarazo de 30-31 semanas de gestación, tercero de su madre, en el que se constató la presencia de polihidramnios (abril de 1976). Los padres son primos segundos. El primer embarazo concluyó con un feto muerto comprobándose, asimismo, la existencia de un gran polihidramnios. El segundo embarazo transcurrió normalmente. El peso de la paciente al nacer fue de 1.240 g. Desde los primeros días de vida se observó una tendencia manifiesta a la intolerancia alimenticia con pérdida de peso y cuadros frecuentes de deshidratación, en los que se comprobó acidosis metabólica. 450 Se constató proteinuria moderada y glucosuria con niveles normales de glucemia. Al mes de vida, persistía la glucosuria; los niveles de creatinina y de iones eran normales, así como el equilibrio ácidobase. A partir de los dos meses de vida, varios urocultivos fueron positivos a Proteus y Klebsiella. A los tres meses de vida comenzó a presentar cuadros de fiebre elevada que cedían a la administración de agua. En este momento, se objetivó la existencia de poliuria y de orinas alcalinas y de densidad reducida. El ascenso de peso era muy lento, de tal modo que a los seis meses de vida el peso era únicamente de 2.400 g; en este momento, los iones y la bicarbonatemia eran normales, detectándose una eliminación urinaria de calcio muy incrementada (18,9 mg/kg/día) e hiperaminoaciduria, persistiendo las agujas febriles esporádicas. La urografía endovenosa mostró una buena capacidad de eliminación del contraste y la presencia de megavejiga. A los 16 meses de vida se realizó un estudio más amplio de función renal en un Centro especializado en nefrología pediátrica (septiembre de 1977). En este momento, el peso era de 5.100 g. En los exámenes bioquímicos, los niveles de creatinina, iones y equilibrio ácidobase también fueron normales y se confirmó la hipercalciuria (tabla I). La capacidad de acidificación fue normal (pH mínimo tras estímulo con cloruro amónico: 5) y en la sobrecarga hiposalina existía una oferta salina incrementada a partir del túbulo proximal a las porciones distales de la nefrona (tabla II). Se diagnosticó de hipercalciuria idiopática y se recomendó tratamiento con hidroclorotiacida y dieta pobre en sal. A los dos años y ENFERMEDAD DE BARTTER NEONATAL Tabla II. Valores obtenidos en las diversas sobrecargas hiposalinas realizadas 17 meses Ccr (ml/min/1,73m2) UOsm (mOsm/kg) CH2O + CNa % CH20 % RDNa % CK % ­ ­ 23,5 14,0 81,1 36,0 3 años 115,6 110 43,7 27,3 62,5 ­ 4,5 años* 121,8 50 16,2 13,6 83,6 19,6 5 años 120,8 75 21,2 11,7 55,0 41,4 15 años 98,3 92 15,0 10,7 71,0 43,9 Valores normales** 124,8 48,00 11,58 10,13 88,36 7,99 ± ± ± ± ± ± 25,2 14,76 2,92 2,5 1,92 3,48 Ccr: aclaramiento de creatinina. UOsm: osmolalidad urinaria mínima. CH20 + CNa %: aclaramiento de agua libre + sodio (oferta de sodio del túbulo proximal a las porciones distales de la nefrona). CH2O: aclaramiento de agua libre. RDNA %: reabsorción de sodio en las porciones distales de la nefrona (CH2Ox 100/CH2O+CNa). CK: aclaramiento de potasio. *Dieta estricta sin sal. **Valores de normalidad en niños de más de dos años de edad de la Unidad de Pruebas Funcionales del Hospital Ntra. Sra. de Candelaria. medio de edad, se suspendió el tratamiento tiazídico (febrero de 1979) por presentar varios episodios de descenso brusco de peso e hipopotasemia intensa (1,7-2,1 mEq/l) coincidiendo con cuadros respiratorios vanales. Tras la suspensión del fármaco, se normalizaron tanto la kaliemia como el equilibrio ácido-base, recibiendo tratamiento con una dieta estricta sin sal, como se recomendaba en ese momento para niños afectos de hipercalciuria idiopática severa 11. Con ese tipo de dieta, se observó disminución de la poliuria y de la polidipsia, la calciuria descendió desde 27 a 9,2 mg/kg/día, oscilando la kaliemia entre 3,2 y 4,4 mEq/l. El desarrollo ponderoestatura y psicomotor se observó deficiente, junto con un retraso en la edad ósea 12. A los cinco años (mayo de 1981) se pudo realizar una prueba de concentración con desmopresina (DDAVP), siendo la osmolalidad urinaria máxima de 178 mOsm/kg. El manejo renal del sodio investigado mediante la realización de varias sobrecargas hiposalinas ha sido publicado parcialmente en forma de resumen 13. La pérdida proximal de sodio persistía a los cinco años, aunque ya no estaba presente en la sobrecarga realizada a los 15 años (tabla II). Con respecto al defecto de reabsorción distal de sodio, pudo ponerse claramente de manifiesto en la segunda sobrecarga hiposalina, realizada a los tres años. Son llamativos los resultados alcanzados en la tercera sobrecarga, realizada con dieta estricta sin sal. En este caso, la oferta de sodio del túbulo proximal a las porciones distales de la nefrona y la reabsorción de sodio en ese último nivel, mejoraron notablemente alcanzando valores en el límite de la normalidad (tabla II). En fin, al detectarse niveles de renina (114,3 ng/ml/h) y de aldosterona (4.820 pg/ml) muy elevados así como una eliminación urinaria de prostaglandina E2 (PGE2) incrementada (118,4 ng/hora/1,73 m2; normal: < 35), la paciente fue diagnosticada de síndrome de hiperprostaglandinismo E2. Una ecografía renal realizada a los nueve años de edad (julio de 1985) mostró la presencia de nefrocalcinosis. El tratamiento con indometacina y sales de potasio fue discontinuo por problemas familiares. Las determinaciones plasmáticas y urinarias en distintos momentos de la vida figuran en la tabla I. En la actualidad, la paciente tiene una insuficiencia renal crónica leve. Amplificación y secuenciación del DNA En nuestro estudio secuenciamos las regiones codificadoras del gen KCNJ1. El DNA genómico se puri- Fig. 1.--Mutación en el gen KCNJ1. Se muestra la secuencia parcial de la hebra de DNA con sentido de un individuo normal y del paciente afecto. La base cambiada está indicada con una flecha. Esta sustitución cambia el codón CGA (Arg 283) a TGA (STOP 283). 451 V. GARCÍA NIETO y cols. Tabla III. Mutaciones del gen KCNJ1 identificadas en pacientes con el síndrome de Bartter neonatal Mutaciones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Nucleótidos afectados T a A en 776 G a T en 781 C a G en 798 G a T en 858 G a C en 883 C a T en 890 T a A en 926 T a A en 933 G a A en 1062 G a A en 1153 C a T en 1202 C a G en 1218 T a G en 1505 C a T en 1573 T a C en 1631 Inserción de una T entre 652 y 659 Inserción de una C entre 1055 y 1056 Deleción de AAAG en 1557-1560 Deleción de los exones 1y2 Codón 72 74 79 99 108 110 122 124 167 198 214 219 315 338 357 32-33 Consecuencia Val Glu Asp Tyr Tyr STOP Trp Cys Asp His Pro Leu Val Glu Asn Lys Gly Glu Ala Thr Ala Val Ser Arg Val Gly Arg STOP Met Thr Cambio de pauta de lectura a partir del codón 34 Cambio de pauta de lectura a partir del codón 354 Cambio de pauta de lectura a partir del codón 333 ROMK2 y ROMK3 no se expresan (?) Referencia 5 5 4 5 5 5 5 37 5 5 4 4 5 5 4 4 17 332 37 18 332-333 4 19 -- 38 ficó a partir de sangre del paciente afecto utilizando el kit QlAamp DNA Blood y siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los exones 4 y 5 del gen KCNJ1 se amplificaron mediante PCR utilizando DNA genómico y pares de cebadores diseñados a partir de la secuencia publicada del gen 5, 7. El análisis de la secuencia del DNA de los productos de la PCR se realizó mediante el método de terminación de la cadena con dideoxinucleótidos utilizando un secuenciador automático ABI Prism modelo 3700 (Applied Biosystems). La mutación se confirmó secuenciando varios productos de PCR amplificados de manera independiente a partir del DNA genómico. RESULTADOS El gen que codifica la proteína humana ROMK (KCNJ1) produce cinco mRNAs distintos por «splicing» alternativo de sus cinco exones 7. Estos cinco mRNAs comparten un exón común, el exón 5, que codifica la mayor parte de la proteína. El producto mayor, ROMK1, comienza en un codón de iniciación presente en el exón 4 y contiene 391 aminoá452 cidos. Basándonos en la secuencia de ROMK1, hemos utilizado cebadores para amplificar la secuencia codificadora de los exones 4 y 5 a partir de DNA genómico de nuestro paciente. El análisis de la secuencia del DNA amplificado mostró la presencia de una mutación homocigótica que cambia una C por una T en el nucleótido 1573 (fig. 1). Esta mutación hace que el codón de la arginina en la posición 338 de ROMK1 se convierta en un codón de terminación prematura (CGA-TGA). La proteína ROMK1 sintetizada en este caso carecería de 53 aminoácidos del extremo carboxilo. DISCUSIÓN Inicialmente, la paciente presentaba varios datos clínicos compatibles con el diagnóstico de enfermedad de Bartter neonatal como parto prematuro, polihidramnios retraso ponderal, poliuria con tendencia fácil a la deshidratación e hipercalciuria. El retraso en el diagnóstico de la paciente obedece a varios factores. En su año de nacimiento, era difícil tanto la determinación de los niveles de renina y de ENFERMEDAD DE BARTTER NEONATAL aldosterona como la cuantificación de la eliminación urinaria de PGE2. Tampoco se había implantado en nuestros hospitales la práctica de la ecografía renal que hubiera demostrado la existencia de nefrocalcinosis. No obstante, la principal objeción al diagnóstico era la ausencia tanto de alcalosis hipopotasémica en situación basal como de un manejo distal de cloro y sodio alterado en las porciones distales de la nefrona. Incluso, en los primeros días de vida tuvo acidosis metabólica. En publicaciones previas, se cita como algunos pacientes afectos de síndrome de Bartter debutaron con acidosis metabólica en lugar de alcalosis 14-18 e, incluso, fueron diagnosticados de acidosis tubular renal 14, 15, 18. La presencia de acidosis metabólica, al menos en las primeras semanas de la vida, ha sido observada en pacientes con enfermedad de Bartter neonatal tanto en el tipo I 18 como en el II 19. Además, algunos de los pacientes con síndrome de Bartter tenían normo o hiperkaliemia 16, 18,20,21. En algunos casos, incluso, la hipopotasemia apareció a los 4 o a los 11 años de edad 18. Por otra parte, la alteración en el manejo proximal renal del sodio observada en nuestra paciente, al menos, en los cinco primeros años de vida, ha sido descrita en algunos sujetos diagnosticados de síndrome de Bartter, asociada 15 o no 22 a un defecto de reabsorción distal. Esa situación de acidosis metabólica y pérdida salina, incluso con hiperpotasemia, que se ha comunicado en algún paciente con enfermedad de Bartter neonatal tipo II 19 es similar a la descrita en el pseudohipoaldosteronismo primario. Antes de tener constancia de los hallazgos genéticos que han explicado la diversidad fisiopatológica del síndrome de Bartter, a mediados de los años 80 se intentó definir un nuevo trastorno denominado como síndrome de hiperprostaglandinismo E2 23-26 en el que se incluirían los recién nacidos con características clínicas y bioquímicas de enfermedad de Bartter neonatal. Seyberth y cols. sugirieron que la anomalía fundamental, en estos casos, sería una hiperproducción renal y sistémica de prostaglandinas 23. Las diferencias con el síndrome de Bartter radicarían en un defecto llamativo en la capacidad de concentración consistente en isostenuria 23, una marcada reducción de la síntesis de la proteína de Tamm-Horsfall 24 y una reabsorción distal de cloro normal 23. Curiosamente, tres de los cinco pacientes de la publicación original 23 tendrían valores de reabsorción distal de cloro por debajo de lo normal si los comparamos con los registrados en nuestros propios controles ( < 85,2%) 27. En todo caso, Rodríguez Soriano considera que los diferentes mecanismos fisiopatológicos observados en niños con enfermedad de Bartter neonatal obedecerían a mutaciones en los genes que codifican las proteínas NKCC2 y ROMK1, por lo que no estaría justificado emplear el término de síndrome de hiperprostaglandinismo E2 19. La hiperproducción de prostaglandinas en esos pacientes sería secundaria a la hipokaliemia crónica y al exceso de angiotensina II 19, 28. La pérdida de función de ROMK1, debida a mutaciones en el gen KCNJ1 (tabla III), altera la capacidad para reciclar el potasio desde las células hacia la luz tubular, con lo que la concentración del potasio luminal es demasiado baja para mantener la actividad del cotransportador luminal Na-K-2CI 29. La consecuencia es pérdida salina, contracción de volumen, incremento de la síntesis de renina, hiperaldosteronismo secundario e incremento de la reabsorción de sodio en las porciones distales de la nefrona en intercambio por potasio e hidrógeno que son secretados, con la consecuencia de alcalosis hipotasémica e hiperproducción de prostaglandinas. El incremento de secreción de PGE2 agravaría la situación mediante la estimulación por una vía independiente del eje renina-aldosterona 30, 31 y la inhibición tanto de la actividad del canal ROMK1 32 como del transporte de cloro y sodio en la rama ascendente gruesa del asa de Henle 33. Nuestra paciente es portadora de una mutación homocigótica que cambia una C por una T en el nucleótido 1573 (fig. 1). Esta mutación hace que la arginina en la posición 338 de ROMK1 se convierta en un codón de terminación prematura, por lo que se suprimen 53 residuos de la porción carboxiterminal. Dicha mutación, descrita previamente en una familia de origen belga, puede alterar la fosforilación por parte de la tirosina kinasa de la tirosina 337 5. La importancia de esta fosforilación se desconoce hasta el momento. Sin embargo, estudios recientes indican que el extremo carboxilo de ROMK1 (aminoácidos 332 al 391) constituye un dominio necesario para la función del canal 34. Los hallazgos genéticos que han explicado la diversidad fisiopatológica del síndrome de Bartter justifican que, en sentido estricto, en los casos en los que se ha encontrado una mutación causal, deba emplearse, con mayor propiedad, el termino enfermedad de Bartter 35, por lo que debería reservarse la expresión síndrome de Bartter para aquellos casos en los que aún no se ha detectado ninguna mutación 36 Las muestras de DNA obtenidas de pacientes clínicamente diagnosticados de síndrome de Bartter, permiten realizar el diagnóstico molecular que previsiblemente, en un futuro próximo, permitirá ofrecer alternativas terapéuticas a estos enfermos. En fin, es posible que esta alternativa diagnóstica sea útil, asimismo, para realizar el diagnóstico prenatal de esta enfermedad tubular renal. 453 V. GARCÍA NIETO y cols. Agradecimientos Los autores deseamos expresar nuestro agradecimiento a los miembros de la familia afectada por su colaboración y a Hilaria González Acosta por su asistencia en las extracciones de sangre y DNA. FCM y VGN recibieron financiación del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) del Ministerio de Sanidad y Consumo, proyecto 98/1179, y de la Consejería de Educación, Cultura y Deportes del Gobierno de Canarias, proyecto 97/051. BIBLIOGRAFÍA 1. Bartter FC, Pronove P, Gill JR Jr, MacCardle RC, Diller E: Hyperplasia of the yuxtaglomerular complex with hyperaldosteronism and hypokalemic alkalosis. Am J Med 33: 811-828, 1962. 2. Kurtzman NA, Gutiérrez LF: The pathophysiology of Bartter's sindrome. JAMA 234: 758-759, 1975. 3. Simon DB, Karet FE, Hamdan JM, DiPietro A, Sanjad SA, Lifton RP: Bartter's syndrome, hypokalaemic alkalosis with hypercalciuria, is caused by mutations in the NaK-20 cotransporter NKCC2. Nat Genet 13: 183-188, 1996. 4. 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