NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Número 2. 2001 FORMACIÓN CONTINUADA El gen del angiotensinógeno en la hipertensión arterial esencial J. M. Zabay*, J. E. Marco**, J. M. Mulet*, M. A. Munar**, R. Bernabéu** y C. Viader* *Fundación Balear Transplant. Palma de Mallorca. **Servicio de Nefrología. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. INTRODUCCIÓN La hipertensión arterial es una enfermedad muy frecuente, que afecta aproximadamente al 20% de la población adulta en las sociedades del mundo occidental 1. A su vez, aproximadamente en el 95% de los casos con hipertensión arterial ésta es esencial. En esta revisión trataremos exclusivamente de esta forma de hipertensión arterial, a la que designaremos con la abreviatura HTA. Diversos estudios epidemiológicos han demostrado que en el origen de la HTA hay una susceptibilidad genética 2, 3. Desde el punto de vista genético, la HTA es un ejemplo paradigmático de los denominados «rasgos complejos» 4. El término «rasgo complejo» define un fenotipo que no se comporta según un patrón de herencia mendeliano clásico, dominante o recesivo, atribuible a alelos de un único locus. Ello puede ser debido a uno o varios de los siguientes fenómenos: penetrancia incompleta, fenocopia, heterogeneidad genética, herencia poligénica; y presencia de otros mecanismos de transmisión 5. En el desarrollo de HTA influyen indudablemente factores no genéticos. La susceptibilidad genética al padecimiento de HTA se ha cuantificado mediante epidemilogía genética en términos de la proporción de las variaciones en la presión arterial que tiene origen genético, y en términos del riesgo relativo [riesgo de un pariente de un enfermo dividido por el riesgo en la población general ()]. Sólo aproximadamente el 30% de la variación de la presión arterial es de origen genético 2, y el riesgo relativo para hermanos de afectados (s) es también solamente moderado (de 2,46 Correspondencia: Dr. Julio E. Marco Franco Jefe del Servicio de Nefrología Hospital Son Dureta Andrea Doria, 55 07014 Palma de Mallorca E-mail: jmarco@hsd.es ó 3,5 3, dependiendo de las poblaciones analizadas). Entre los factores no genéticos que influyen en el desarrollo de HTA están, al menos, la edad, el sexo, y factores ambientales tales como la ingesta de sodio. Además de sus posibles influencias individuales, estos factores no genéticos pueden interactuar de forma compleja con los factores de susceptibilidad genética 1. Todo ello explica que en la genética de la HTA puedan darse los fenómenos de penetrancia genética incompleta y de fenocopia. Por otra parte, la presión arterial es el resultado de complejas interacciones entre el gasto cardíaco, las resistencias vasculares periféricas y el control del balance de sal y de agua por el riñón, y, a su vez, cada uno de estos factores depende de múltiples y complejos fenómenos fisiológicos. No es de extrañar, por lo tanto, que en la genética de la HTA puedan darse los fenómenos de heterogeneidad genética y/o de herencia poligénica, incluso con posibles interacciones gen-gen que podrían ser sinérgicas, aditivas o sustractivas 1. Para localizar el(los) gen(es) asociado(s) a una determinada enfermedad con base genética se cuenta, afortunadamente, con la existencia de marcadores genéticos polimórficos que ocurren de manera espontánea, de los cuales, gracias a las técnicas de genética molecular, se han identificado ya muchos y se siguen encontrando cada vez más. A la hora de seleccionar los marcadores genéticos que se analizarán en relación con una determinada enfermedad, se pueden seguir dos tipos de estrategias: 1) hacer una búsqueda sistemática por todo el genoma, utilizando marcadores que se distribuyen al azar a lo largo del mismo; 2) utilizar marcadores de genes candidatos, es decir, de genes que bien pertenecen a una región previamente detectada en una búsqueda sistemática, bien tienen una significación fisiológica por la que se supone, a priori, que pueden estar relacionados con la enfermedad 7. Los genes de los componentes del sistema reninaangiotensina (RAS) han sido considerados prioritariamente como genes candidatos a estar asociados con la HTA, ya que dicho sistema desempeña un 115 J. M. ZABAY y cols. papel crucial en la homeostasis de las sales y del agua y en el mantenimiento del tono vascular 8. Dentro de los genes del RAS ha sido el del angiotensinógeno (AGT) el primero 9 y el más ampliamente estudiado, dado que existen varias observaciones compatibles con una relación directa entre el AGT y la presión arterial: correlación significativa entre las concentraciones plasmáticas de AGT y los niveles de presión arterial 10, descenso de la presión arterial tras la administración de anticuerpos anti-AGT 11, expresión del gen del AGT en tejidos directamente implicados en la regulación de la presión arterial 12, y el hecho de que la inducción de cambios en la expresión del gen del AGT en ratones de lugar a cambios en la presión arterial 13. Jeunemaitre y cols. 9 encontraron en 1992 evidencia de ligamento entre el gen del AGT y la HTA en dos poblaciones (una de Utah y otra de París), utilizando un marcador microsatélite altamente polimórfico localizado en el lado 3' del gen 14 y un método estadístico de sib pair analysis basado en la identificación de alelos IBS (ver después, apartado Métodos estadísticos utilizados). Tras este hallazgo, identificaron 15 polimorfismos dialélicos en el gen del AGT, de los cuales dos mostraron relación con la HTA en un estudio de asociación (ver después, apartado Métodos estadísticos utilizados) llevado a cabo en las mismas poblaciones. Estos dos polimorfismos dialélicos fueron el T174M (presencia de treonina o de metionina en la posición 174 de la proteína debida a la presencia de C o de T en la posición +521 del gen) y, sobre todo, el M235T (presencia de metionina o de treonina en la posición 235 de la proteína debida a la presencia de T o de C en la posición +704 del gen). Las variantes 235T y 174M fueron las que se asociaban con HTA. Ambos polimorfismos estuvieron en desequilibrio de ligamiento completo, siendo la variante 174M un subgrupo de la variante 235T. Autores de este mismo grupo llevaron a cabo posteriormente trabajos15, 16 en los cuales encontraron otro polimorfismo dialélico del gen del AGT que afecta in vitro la expresión del gen; en las poblaciones estudiadas, este nuevo polimorfismo estaba en desequilibrio de ligamiento completo con M235T y ocurría prácticamente con la misma frecuencia que éste. Los autores concluyeron, por lo tanto, que este nuevo polimorfismo podría tener una implicación directa en los niveles de presión arterial, y podría explicar la relación previamente observada entre la HTA y el polimorfismo M235T. Dicho nuevo polimorfismo es el G-6A (presencia de G o de A en la posición 6 a partir del sitio de iniciación de la transcripción, hacia el lado 5' del gen). Su relación con el polimorfismo M235T es tal que en las poblaciones estudiadas (caucasiana, japonesa y afro-caribeña) había más del 97% de concordancia 116 entre los alelos G-6 y M235, y más del 99% de concordancia entre los alelos ­6A y 235T. En cuanto a la influencia del polimorfismo G-6A en la expresión del gen del AGT, se observó que afecta al grado de transcripción basal in vitro del gen y que el nivel de transcripción más alto correspondía al alelo ­6A15. Apoyando la posibilidad de que este efecto in vitro tenga relevancia fisiológica in vivo, se ha observado en un trabajo posterior que la presencia en pacientes hipertensos del alelo ­6A se asocia a niveles más altos de aldosterona en plasma y en orina y a valores más altos de la razón aldosterona/actividad de renina en plasma 17. El polimorfismo G-6A afecta a la expresión del gen del AGT porque está localizado en una región que es crítica para la regulación de la transcripción del gen. Esta región se llama AGCE 1 (angiotensinogen core promoter element 1), y va de las posiciones 1 a 25 a partir del sitio de iniciación de la transcripción, hacia el lado 5' del gen 18. Se han descrito otros polimorfismos del gen del AGT en esta misma región (A-20C, C-18T), los cuales también tienen relevancia en la transcripción del gen, pero la información disponible acerca de la posible relación de estos polimorfismos con la HTA es todavía escasa 19, 20. A pesar del gran número de trabajos realizados después de los estudios iniciales a los que nos hemos referido, todavía no está claramente establecido si en la susceptibilidad genética a la HTA está o no implicado el gen del AGT. En este artículo trataremos de revisar las posibles causas por las que aún no se ha llegado a conclusiones definitivas a este respecto, circunscribiéndonos para ello a los trabajos realizados con los marcadores acerca de los que hay más información: marcadores microsatélite, polimorfismo G-6A y, especialmente, polimorfismo M235T. MÉTODOS ESTADÍSTICOS UTILIZADOS Breve recordatorio de los métodos estadísticos aplicables a «rasgos complejos» Una de las dificultades que existe para demostrar estadísticamente que un marcador genético está relacionado con una enfermedad, especialmente cuando ésta es un «rasgo complejo», es la falta de un método que tenga validez universal. Análisis de ligamiento Un grupo de métodos es el de los llamados análisis de ligamiento. Ligamiento entre una enfermedad y un marcador genético significa que las transmisiones de ambos en familias no son independientes. GEN DEL ANGIOTENSINÓGENO E HTA El método que más ampliamente se ha utilizado durante mucho tiempo para averiguar si hay ligamento entre una enfermedad y un marcador genético es el análisis paramétrico de ligamiento. Este análisis se basa en valorar el logaritmo del cociente probabilidad de ligamiento/probabilidad de no ligamiento, es decir, el logaritmo de la razón de probabilidades [logarithmic odds ratio (lod score)] 21. El cálculo del lod score se hace a partir de toda una serie de parámetros genéticos de la enfermedad y del marcador, que hay que especificar. El problema de este método es que su fiabilidad depende de manera crítica de que los valores de los parámetros que se introducen en el cálculo sean correctos; si no es así, tanto se pueden obtener ligamientos falsos como pasar desapercibidos ligamientos verdaderos 5, 7. Esta es una de las razones por las que este método tiene muy poca aplicabilidad en los «rasgos complejos»: en ellos raramente se conocen con certeza dichos parámetros. Actualmente hay disponibles también otros métodos estadísticos de ligamiento, llamados no paramétricos, en los cuales no hay que especificar los parámetros genéticos de la enfermedad ni del marcador genético que se esté estudiando. Estos métodos se basan en la demostración de que los parientes afectados por una enfermedad dentro de una familia heredan una misma copia del marcador genético con más frecuencia de la que sería esperable si la transmisión de la enfermedad y del marcador fueran independientes. Ello se traduce en el hecho de que los parientes afectados presentan los mismos alelos del marcador con más frecuencia de la que corresponde al caso de transmisiones independientes de la enfermedad y del marcador, o, dicho de otro modo, en que hay un exceso de alelos compartidos por dichos parientes. Por ello, los métodos no paramétricos de ligamiento se llaman también allele-sharing methods. Estos métodos se utilizan mucho en el análisis de «rasgos complejos», puesto que pueden ser aplicados sin conocer los parámetros genéticos de la enfermedad ni del marcador genético que se esté estudiando. Los métodos de análisis no paramétricos de ligamiento que fueron primeramente descritos valoran como alelos compartidos los alelos IBD (identical by descent), es decir, aquellos alelos que proceden del mismo gen progenitor 22. Los parientes afectados que se analizan pueden ser hermanos (sib pair analysis) o parientes con otro grado de parentesco, aplicándose en cada caso distintas pruebas estadísticas para saber si son o no significativas las desviaciones del número de alelos compartidos por los parientes con respecto a lo esperado cuando la enfermedad y el marcador no están relacionados 23-25. Para poder asegurar directamente que dos alelos en un par de parientes son IBD es imprescindible conocer el genotipo de los ascendientes para el marcador en cuestión. Esto no siempre es posible, sobre todo cuando se estudian enfermedades de comienzo tardío como la HTA 9. Pero incluso conociendo el genotipo de los ascendientes puede no ser posible asegurar que dos alelos en un par de descendientes son IBD si el marcador genético estudiado es poco polimórfico: en estas circunstancias son más altas las probabilidades de que los ascendientes tengan los mismos genotipos y de que, por lo tanto, cada uno de los alelos de los ascendientes no pueda ser seguido inequívocamente en los descendientes. Cuando dos parientes comparten un alelo de un marcador, pero no se puede saber si ambos alelos son IBD, lo que es frecuente, se habla de una identidad alélica IBS (identical by state); afortunadamente, se han desarrollado métodos estadísticos para poder hacer en estas circunstancias análisis no paramétricos de ligamiento. En algunos de estos métodos se hace una estimación matemática del número de alelos IBD 26. Otros de estos métodos utilizan pruebas estadísticas diseñadas específicamente para trabajar con el número de alelos IBS 27; estos métodos han sido llamados APM (affected pedigree member). Para llevar a cabo cualquiera de estos métodos estadísticos es preciso conocer la frecuencia de los alelos del marcador genético correspondiente en la población que se esté analizando, siendo los métodos APM especialmente sensibles a dicho parámetro 6. Estudios de asociación El objetivo de los estudios de asociación es identificar qué alelo específico de un marcador genético está relacionado con una enfermedad. En su forma convencional los estudios de asociación son estudios de tipo caso-control, en los cuales se comparan las frecuencias con las que los alelos del marcador genético en cuestión se presentan en grupos no relacionados de individuos afectados y de individuos no afectados por la enfermedad. Alternativamente, se puede comparar la presencia de enfermedad en los portadores de los distintos genotipos del marcador, bien cualitativamente, bien cuantitativamente si la enfermedad tiene un «rasgo» fenotípico continuo 5. La principal dificultad de este método estriba en conseguir grupos de individuos afectados y de individuos no afectados que sean homogéneos, excepto, como es obvio, por lo que respecta a la presencia de la enfermedad. Esta homogeneidad puede ser más o menos importante en cuanto a factores tales 117 J. M. ZABAY y cols. como la edad, el sexo, etc., pero es crítica por lo que respecta al origen étnico de ambos grupos. SI los dos grupos no tienen el mismo origen étnico puede ocurrir que haya entre ambos diferencias en las frecuencias de los alelos del marcador genético debidas simplemente a este hecho, y no a la presencia o a la ausencia de la enfermedad; esto sería, evidentemente, causa de una asociación falsa 5. Para evitar este problema, se recomienda tomar con reservas los resultados que muestran una asociación positiva hasta que se demuestra que son reproducibles en diferentes poblaciones 1, 5. Mejor aún, se recomienda que los estudios de asociación convencionales se validen utilizando métodos de asociación basados en familias (family-based association studies) 5. Estos family-based association studies pueden ser considerados como métodos mixtos de asociación y de ligamiento, ya que por una parte permiten identificar qué alelo específico de un marcador genético está relacionado con una enfermedad, y por otra parte se basan en la transmisión de dicho alelo en familias. Uno de los métodos de family-based association es el llamado HRR (haplotype relative risk) 28, 29. El fundamento de este método es que en que cada familia en la que la transmisión de cualquiera de los genes parentales a un hijo enfermo pueda ser seguida inequívocamente, se puede «crear» un «individuo control artificial» al que se le asignan los alelos que no han sido transmitidos por los padres al hijo enfermo. De este modo se consiguen un grupo de afectados y un grupo control que son absolutamente homogéneos desde el punto de vista étnico, aunque el grupo control sea virtual. Otro de los métodos de family-based association es el test de desequilibrio en la transmisión [transmission disequilibrium test (TDT)]. Suponiendo que un marcador tenga dos alelos (que es la situación para la que el test fue inicialmente descrito 30), y que no haya asociación de ninguno de los dos alelos con la enfermedad, sería esperable que la frecuencia con la que padres heterozigotos transmiten cada alelo a los hijos enfermos fuera del 50%; si alguno de los alelos se transmite con una frecuencia significativamente superior, se concluye que hay una asociación entre dicho alelo y la enfermedad. Actualmente este método se puede utilizar también con marcadores genéticos más polimórficos 31. Comparación entre los distintos métodos estadísticos En suma, los análisis de ligamiento y los estudios de asociación tienen entre sí bastantes diferencias importantes, tanto desde el punto de vista conceptual como desde el punto de vista del rendimiento estadístico. 118 Conceptualmente, el objetivo de los estudios de asociación es identificar qué alelo específico de un marcador está relacionado con una enfermedad. Sin embargo, el objetivo de los análisis de ligamiento es comprobar si una enfermedad y un marcador genético muestran una herencia concordante en familias; por ejemplo, los métodos no paramétricos de ligamiento se basan en conocer cuantos alelos de un marcador comparten pares de parientes afectados, independientemente de cuales sean los alelos compartidos 32. Desde el punto de vista del poder estadístico, los estudios de asociación resultan más efectivos y más prácticos cuando la susceptibilidad genética de la enfermedad está controlada por varios loci con poco efecto cada uno y/o cuando la enfermedad tiene valores pequeños de , mientras que cuando se dan las circunstancias contrarias resultan más eficaces los análisis de ligamiento 32-34. Dentro de los análisis de ligamiento, los métodos no paramétricos son más robustos que el análisis paramétrico de ligamiento, ya que este último no se puede aplicar más que cuando los parámetros genéticos de una enfermedad y de un marcador genético pueden ser especificados. Sin embargo, los métodos no paramétricos tienen menor poder estadístico que un análisis paramétrico de ligamiento llevado a cabo correctamente. Por otra parte, los métodos no paramétricos tienen algunos problemas, todavía resueltos, de tipo estadístico y de tipo informático 5. Métodos estadísticos aplicados a la temática del polimorfismo del gen del angiotensinógeno en la HTA La posible relación entre marcadores microsatélite del gen del AGT y la HTA se ha abordado mediante métodos no paramétricos de ligamiento basados en la estimación matemática de alelos IBD 6,35-38, mediante métodos APM6, 9, 37-40, y mediante métodos de asociación convencionales16, 39, 40. Algunos de estos estudios han obtenido resultados positivos 9, 16, 39, 40, mientras que en otros los resultados han sido negativos 6, 35-38. La relación entre el polimorfismo M235T del gen del AGT y la HTA se ha abordado mediante métodos no paramétricos de ligamiento basados en la estimación matemática de alelos IBD 6, mediante métdos APM 6, mediante el método de TDT 41, y, muy especialmente, mediante métodos de asociación convencionales 9, 16, 20, 38-40, 42-64. También en este caso se han obtenido resultados positivos en algunos estudios (aproximadamente la mitad) 9, 16, 20, 43, 47, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 61, mientras que en el resto de los trabajos los resultados han sido negativos. En un trabajo aislado se ha empleado GEN DEL ANGIOTENSINÓGENO E HTA un método de análisis diferente de los referidos 65; en él se comparan en distintas poblaciones de raza negra las frecuencias de HTA y las frecuencias del alelo 235T, y puesto que se observan grandes diferencias en las frecuencias de HTA y muy pequeñas diferencias en las frecuencias del alelo 235T se concluye que no debe existir influencia de este alelo en la HTA en dichas poblaciones. Como compendio de los estudios realizados, varios meta-análisis recientes sustentan la existencia de una asociación entre el alelo 235T del gen del AGT y la HTA en poblaciones blancas 66, 67 y en poblaciones japonesas 54, aunque esta asociación parece cuantitativamente modesta [odds ratios (ORs) de 1,20 (95% IC = 1,11-1,29), de 1,31 (95% IC = 1,17-1,46) y de 1,22 (95% IC = 1,05-1,42), respectivamente]. Una limitación de los meta-análisis es la posibilidad de que la existencia de publicaciones esté sesgada a favor de las que obtienen resultados positivos y en contra de las que obtienen resultados negativos; sin embargo, posiblemente esto no sea un problema en el caso de los meta-análisis referidos al gen del AGT en la HTA, ya que los autores de uno de ellos han calculado que para revertir sus resultados harían falta nada menos que otras 38 publicaciones con resultados negativos 66. La relación entre el polimorfismo G-6A del gen del AGT y la HTA se ha abordado mediante métodos convencionales de asociación. Nuevamente, algunos estudios han obtenido resultados positivos 16 y otros han obtenido resultados negativos 38, 54. En un trabajo aislado se ha empleado un método de análisis diferente de los referidos 68. Este trabajo consiste en un estudio longitudinal, en el que se analiza la relación entre el polimorfismo G-6A y el desarrollo de HTA durante el seguimiento de sujetos que al comienzo del estudio eran normotensos, observándose una tendencia a una mayor frecuencia de desarrollo de HTA en los sujetos con el genotipo AA; el resultado de este estudio puede, así, considerarse como positivo. En todos los trabajos que han empleado métodos no paramétricos de ligamiento, los sujetos de estudio han sido parejas de hermanos afectados por la HTA. Para ilustrar la posible influencia del método estadístico empleado en los resultados obtenidos, se pueden poner algunos ejemplos. En relación con los marcadores microsatélite del gen del AGT, se han obtenido resultados positivos en población francesa 9, 16 y en población inglesa 39 empleando métodos APM y métodos convencionales de asociación; sin embargo, un estudio realizado con población de varios países europeos, incluyendo Francia e Inglaterra, ha obtenido resultados negativos empleando métodos no paramétricos de ligamiento basados en la estimación matemática de los alelos IBD 35. En rela- ción con el polimorfismo M235T, se han obtenido resultados positivos en población china empleando métodos convencionales de asociación 43, mientras que se han obtenido resultados negativos en población también china empleando métodos no paramétricos de ligamiento basados en la estimación matemática de alelos IBD 6, métodos APM 6 y un método de TDT 41. Por otra parte, en la serie de trabajos citados se pueden encontrar determinadas limitaciones estadísticas que pueden hacer cuestionables algunos de los resultados obtenidos. Una de estas limitaciones es el pequeño número de pacientes y de controles que se han utilizado en varios de los estudios de asociación que han obtenido resultados negativos. Jeunemaitre ha calculado que, dadas las frecuencias medias de los alelos M235 y 235T en las poblaciones caucasianas con y sin HTA (ver después apartado Variaciones étnicas), es necesario estudiar más de 400 hipertensos y más de 400 controles para poder hallar diferencias entre ellos que sean significativas 16. El número de individuos necesarios para poder hallar diferencias entre pacientes y controles debe ser todavía mayor en otras poblaciones en las que el alelo 235T es más frecuente (ver después apartado Variaciones étnicas). Sin embargo, muchos de los estudios de asociación realizados no llegan a muestras de estas dimensiones, y algunos están francamente alejados de las mismas 39, 45, 46, 59. Otra limitación es que algunos estudios convencionales de asociación califican de positivos resultados que están en los límites de la significación. Por ejemplo, hay un estudio en el que se concluye que el alelo 235T está asociado a HTA sobre la base de un coeficiente de correlación de Pearson significativo, pero en cambio mediante un test de 2 no se encontraron diferencias entre pacientes y controles 47. Por otra parte, ninguno de los estudios convencionales de asociación que han obtenido resultados positivos ha sido sometido a validación con métodos de family-based association, por lo que no se puede descartar en ningún caso que dicha positividad sea debida, al menos parcialmente, a falta de homogeneidad entre los pacientes y los controles. Por lo que respecta a los estudios que han utilizado métodos no paramétricos de ligamiento, todos están basados en el número de alelos IBD estimados matemáticamente o en la identificación de alelos IBS; por lo tanto, los resultados de todos ellos dependen en última instancia de la frecuencia que se haya determinado que tienen los alelos del marcador genético correspondiente en la población analizada, lo que es una limitación porque dicho parámetro es susceptible de ser incorrectamente especificado. Por otra 119 J. M. ZABAY y cols. parte, los estudios que han utilizado métodos no paramétricos de ligamiento tienen probablemente, en general, una limitación en su poder estadístico. El número de parejas de hermanos afectados que es necesario reclutar para hacer un estudio de ligamiento no paramétrico que tenga un poder estadístico suficiente es función del de la enfermedad, de la frecuencia del alelo asociado a la misma, y del riesgo que comporta poseer dicho alelo 32, 33. Dados los valores de s de la HTA (2,4 6 o 3,5 3), las frecuencias de los alelos del gen del AGT (ver después apartado Variaciones étnicas), y el hecho de que el riesgo de HTA asociado al gen del AGT no es excesivamente alto, como hemos dicho antes, lo más probable es que en ninguno de los trabajos que han utilizado métodos no paramétricos de ligamiento se haya estudiado un número suficiente de parejas de hermanos con HTA, con la posible excepción del trabajo de Brand 35, en el que se ha analizado un total de 630 parejas. VARIACIONES ÉTNICAS Para analizar la influencia de las variaciones étnicas en la relación entre el gen del AGT y la HTA nos fijaremos en el polimorfismo M235T, que es aquel acerca del cual hay información suficiente. En primer lugar, es obvio que el genotipo del gen del AGT tiene importantes variaciones étnicas. En poblaciones europeas, norteamericanas y australianas normales de origen caucasiano la frecuencia del alelo 235T oscila entre el 28% 56 y el 50% 45, 46. Sin embargo, en poblaciones normales asiáticas y negras las frecuencias de dicho alelo son mucho mayores: en poblaciones japonesas oscila entre el 60% 58 y el 83% 54, en poblaciones chinas es del 79% 6 y del 84% 43, y en poblaciones negras es del 83% 59, del 87% 69, y del 90% 60. Dentro de este rango se pueden incluir también algunas poblaciones peculiares aisladas, como una comunidad aborigen canadiense que ha estudiado Hegele 50. Con valores intermedios entre las poblaciones caucasianas y las poblaciones asiáticas y negras hay poblaciones especiales, tales como una población de los Emiratos Árabes Unidos 47, y la población de Chile, que tiene en parte origen español y en parte origen amerindio 44; en ambos casos la frecuencia del alelo 235T en individuos normales es del 52%. A su vez, dentro de los dos bloques principales de población mencionados (poblaciones europeas, norteamericanas y australianas de origen caucasiano por una parte, y poblaciones asiáticas y negras por otra parte) la frecuencia del alelo 235T entre sujetos normales varía, como se puede ver, dentro de intervalos muy amplios. Aunque hay otras causas que pueden contribuir a estas variaciones (azar, sesgo 120 en la elección de los controles, diferencias en las técnicas de biología molecular utilizadas, etc.), la razón principal de las mismas es, seguramente, la existencia de diferencias étnicas entre las poblaciones incluidas en cada bloque 54, 66; dentro de la población japonesa esta posibilidad se ha documentado mediante diversos estudios filogenéticos 54. Es importante observar que en los dos bloques principales de población a los que nos estamos refiriendo se da la circunstancia de que, en general, los estudios que han encontrado frecuencias más bajas del alelo 235T en la población normal son los que han observado asociación entre este alelo y la HTA. Hemos revisado 17 estudios hechos con población caucasiana. Dentro de los 8 estudios en los que la frecuencia del alelo 235T oscila entre el 28% y el 40% 9, 16, 42, 52, 53, 56, 61, 62, 6 (75%) observan asociación entre este alelo y la HTA; esta proporción baja al 11% (1/9) entre los estudios en los que la frecuencia del alelo 235T oscila entre el 41% y el 50%38, 39, 45, 46, 49, 51, 55, 57, 68. Hechos con poblaciones asiáticas y negras hemos revisado 11 trabajos. Dentro de los 6 estudios en los que la frecuencia del alelo 235T oscila entre el 60% y el 80% 6, 16, 20, 48, 58, 64, 4 (67%) observan asociación entre este alelo y la HTA, mientras esta proporción baja al 20% (1/5) entre los estudios en los que la frecuencia del alelo 235T oscila entre el 83% y el 90% 40, 43, 54, 59, 60. La observación de que hay una «correlación negativa» entre frecuencia del alelo 235T del AGT y asociación de dicho alelo con la HTA ilustra una de las dificultades que puede tener la demostración de que un marcador genético está relacionado con una enfermedad, especialmente cuando ésta es un «rasgo complejo». Esta dificultad radica en que el alelo potencialmente relacionado con la enfermedad se de con una frecuencia alta 5. El hecho de que un alelo potencialmente relacionado con una enfermedad se de con una frecuencia alta en una población normal tiene varias consecuencias: 1) se dan con frecuencia individuos homozigotos para dicho alelo; esto se traduce en una mayor dificultad para llevar a cabo estudios de ligamiento, ya que si un individuo es homozigoto para un marcador es menos probable poder seguir inequívocamente cada uno de sus cromosomas en sus descendientes; 2) el número de alelos que cabe esperar que compartan pares de parientes afectados es ya alto en el supuesto de transmisión independiente de la enfermedad y del marcador; por lo tanto, será más difícil documentar una situación de exceso de alelos idénticos en el caso de que la enfermedad y el marcador no se transmitan independientemente; 3) es también alta la frecuencia con la que el alelo potencialmente relacionado con la enfermedad aparece en individuos que no la padecen; GEN DEL ANGIOTENSINÓGENO E HTA por lo tanto, es más difícil que lleguen a ser significativas las diferencias entre pacientes y controles por lo que respecta a la frecuencia del alelo. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD Problemática de la definición fenotípica de los «rasgos complejos» Otra de las dificultades que existen para demostrar estadísticamente que un marcador genético está relacionado con una enfermedad, especialmente cuando ésta es un «rasgo complejo», es la propia definición de la enfermedad. La situación ideal para identificar un marcador genético de una enfermedad es aquella en la que dicha enfermedad tiene un rasgo fenotípico único y concreto, ya que entonces tanto los grupos de pacientes como los grupos de individuos sanos son siempre homogéneos por lo que respecta a la enfermedad. Desgraciadamente, este no es el caso de muchos «rasgos complejos», entre los que se incluye la HTA 1. En estos casos, dependiendo de como se defina la enfermedad y de otros criterios de selección de los casos que se incluyen en el estudio, tales como la edad, la presencia o no de historia familiar, y la gravedad de la enfermedad, se pueden obtener, para la misma enfermedad, mayores o menores. Puesto que la probabilidad de encontrar cosegregación de un marcador genético y una enfermedad es tanto mayor cuanto mayor sea para dicha enfermedad 24, es deseable poder «descomponer» cualquier «rasgo complejo» en «rasgos» más simples para los que el sea mayor que el correspondiente al «rasgo» original; estos «rasgos» más simples se llaman fenotipos intermedios. Por la misma razón es obvio que: 1) aquellos estudios en los que la definición de una enfermedad y/o los criterios de selección de los pacientes no sean los mismos, pueden dar lugar a resultados discordantes por lo que respecta a la relación de esa enfermedad con un marcador genético; 2) dichos estudios no serán directamente comparables. Características de los pacientes con HTA que pueden influir en la relación entre el gen del AGT y la enfermedad En algunos trabajos acerca de la relación entre el gen del AGT y la HTA se ha observado que ésta se da sólo o predominantemente en varones 9, 49, 56; sin embargo, esto no ha sido confirmado por otros estudios 38, 39, 41, 51-53, 55. En otro trabajo se ha observado que el alelo 235T del gen del AGT está asociado sólo a los casos de HTA de comienzo precoz (menos de 50 y, especialmente, menos de 40 años) 61; sin embargo, en otros trabajos no se ha encontrado relación alguna entre el gen del AGT y la edad de comienzo de la HTA 6, 35, 36, 38, 45-47, 51, 52. Hay también trabajos en los que se ha observado que la asociación enre el gen del AGT y la HTA se da predominantemente en casos con HTA grave 9, 50; sin embargo, otros estudios no han confirmado esta relación entre el gen del AGT y la gravedad de la HTA 6, 35, 36, 39, 41, 45. De los factores mencionados (sexo, edad de comienzo de la HTA, gravedad de la enfermedad), la gravedad de la enfermedad ha sido analizada en un meta-análisis reciente acerca de la asociación entre el alelo 235T y la HTA, habiéndose concluido que influye en dicha asociación: la OR pasa de 1,20 (IC 95% = 1,11 - 1,29) si se consideran todos los casos a 1,34 (IC 95% = 1,22 - 1,47) si se consideran sólo los casos con HTA más grave 66. Teniendo en cuenta todos estos datos, parece que está claramente indicado que en los trabajos acerca de la relación entre el gen del AGT y la HTA se consideren, al menos, el sexo de los casos, la edad de comienzo de la enfermedad y la gravedad de la misma. Sin embargo, sólo algunos de los trabajos analizados para hacer esta revisión (los citados antes) han tenido en cuenta alguno de estos factores, y ninguno ha tenido en cuenta los tres. La toma en consideración de estos factores se puede hacer mediante la estratificación de la población objeto del estudio, o mediante el ajuste por dichos factores al hacer el tratamiento estadístico de los datos; sólo los métodos convencionales de asociación permiten esta segunda posibilidad. Un fenómeno de especial interés, por la repercusión que puede tener a la hora de estudiar la relación entre el gen del AGT y la HTA, es el de la llamada no modulación. En la mayoría de los individuos la ingesta de sodio modula la respuesta a la angiotensina II de sus órganos diana, pero hay personas en las cuales esta modulación es defectuosa 70. Este fenómeno es notablemente más frecuente en los pacientes con HTA (aproximadamente el 25%) que en la población normal, y se admite que puede constituir un fenotipo intermedio que define una subpoblación de hipertensos esenciales71. Uno de los protocolos que existen para explorar la no modulación consiste en medir la variación del flujo renal en respuesta a la infusión de angiotensina II en individuos sometidos a una ingesta elevada de sodio. En un estudio realizado empleando este protocolo en un grupo de individuos con cifras variables de presión arterial (de normotensión a HTA), se vio que en los varones homozigotos para el alelo 235T del gen del AGT tiene lugar una respuesta significativamente más pobre a la infusión de angiotensina II (es decir, una no modula121 J. M. ZABAY y cols. ción), mientras que los niveles de presión arterial fueron similares para los distintos genotipos del gen del AGT 72. No existe ningún otro estudio que haya relacionado el fenómeno de la no modulación con polimorfismos del gen del AGT. Si el alelo 235T del gen del AGT está asociado no con la HTA en general, sino con el fenómeno de la no modulación, y la frecuencia de éste no se ha controlado en los distintos trabajos sobre el gen del AGT en la HTA, es lógico pensar que la variabilidad de los resultados de dichos trabajos puede ser debida a una representación desigual en los mismos de individuos no moduladores. En todo caso, el definir fenotipos intermedios de HTA tiene un gran interés de cara a facilitar el hallazgo de marcadores genéticos de la enfermedad, por las razones expuestas antes. Recientemente se han hecho estudios tratando de relacionar el polimorfismo M235T del gen del AGT con otro fenotipo de definición fácilmente asequible, como es la respuesta de la presión arterial a variaciones en la ingesta de sodio, pero los resultados han sido negativos tanto en individuos normotensos 73 como en pacientes con HTA 74. Factores personales y ambientales que pueden influir en el desarrollo de HTA Existen unas cuantas variables personales y ambientales que pueden afectar a la presión arterial y pueden, por lo tanto, influir en el desarrollo de HTA. Algunas, tales como edad, peso, consumo de alcohol, hábito de fumar, y tratamiento con estrógenos, son ajenas, en principio, al gen del AGT; otras, tales como el sexo, pueden tener además relación con polimorfismos del gen del AGT, como acabamos de ver. Es obvio que estas características de los sujetos de estudio deben ser tenidas en cuenta en todo trabajo sobre genética de la HTA. La influencia de algunos de estos factores, como el consumo de alcohol, el hábito de fumar, y el tratamiento con estrógenos, se puede eliminar simplemente excluyendo del estudio a los sujetos que los presenten, pero esta estrategia se ha seguido sólo en algunos de los trabajos consultados para hacer la presente revisión. La influencia individual de estos factores cuanto están presentes, y de otros, tales como la edad, el peso y el sexo, que están presentes siempre por razones obvias, se puede controlar estratificando los sujetos de estudio por dichos factores. Sin embargo, la toma en consideración de todos o de varios de estos factores simultáneamente, así como de las posibles interacciones entre los mismos, requiere hacer un ajuste por dichos factores al realizar el tratamiento estadístico de los datos, posibilidad que sólo admiten los métodos estadísticos de asociación convencional. Sólo algunos de los trabajos analizados para hacer esta revisión han llevado a cabo este 122 tipo de ajustes, y no en todos los casos para los mismos factores29, 49-51, 53-55, 57, 59, 62; por lo tanto, es lógico pensar que la variabilidad de los resultados obtenidos con respecto a la relación entre el gen del AGT y la HTA puede ser debida, en parte, a la falta de control de factores personales y ambientales que pueden influir en el desarrollo de la HTA. Clasificación de los sujetos de estudio como hipertensos La consideración como rasgo fenotípico de la HTA tiene el problema de que para la distinción entre hipertensión y normotensión no hay un punto de corte inequívoco. De hecho, en la población general la presión arterial adopta una distribución normal, de modo que los umbrales que se utilizan para separar hipertensión y normotensión tienen que ser escogidos más o menos arbitrariamente sobre la base de la conveniencia de instaurar tratamiento para reducir los riesgos de accidente vascular cerebral o de infarto de miocardio1. Para obviar problemas relacionados con este aspecto, en algunos estudios de asociación se han utilizado dos estrategias. Por una parte, se ha considerado la HTA como una variable dicotómica y se han comparado las frecuencias de los alelos o de los genotipos del gen del AGT en hipertensos y en normotensos, utilizando para distinguir ambos grupos de individuos puntos de corte de presión arterial aceptados generalmente. Por otra parte, se ha tomado la presión arterial como una variable continua, y se han comparado los valores de la misma en los distintos grupos de individuos definidos por los alelos o los genotipos del gen del AGT. En uno de estos trabajos 50 hubo discordancia entre ambos procedimientos, ya que por el primero no se demostró asociación entre el alelo 235T e HTA, mientras que si se observó por el segundo procedimiento. En todos los demás trabajos los resultados de ambos procedimientos fueron concordantes 38, 46, 51, 54, 55, 57, 58, 62. Por lo tanto, parece poco probable que la variabilidad de los resultados obtenidos con respecto a la relación entre polimorfismos del gen del AGT e HTA sea debida a problemas en la clasificación de los individuos como hipertensos o como normotensos. DIFERENCIAS EN LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR UTILIZADAS PARA DETECTAR LOS POLIMORFISMOS DEL GEN DEL ANGIOTENSINÓGENO Para analizar la posible influencia de las técnicas de biología molecular utilizadas para detectar los po- GEN DEL ANGIOTENSINÓGENO E HTA limorfismos del gen del AGT en la relación entre este gen y la HTA, nos fijaremos nuevamente en el polimorfismo M235T por ser aquel acerca del que hay suficiente información. Con algunas excepciones 43, 61, los métodos empleados han consistido en amplificar por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) el fragmento de DNA de interés y, a continuación, identificar los alelos bien por hibridación del amplificado con oligonucleótidos específicos de alelo (PCR-ASO) 9, 16, 48, 52, 59, 60, 62, 64, bien mediante digestión del amplificado con enzimas de restricción (PCR-RFLP) 6, 20, 38-42, 44-47, 49-51, 53-55, 57, 58, 61. Las enzimas de restricción empleadas han sido SfaNI, que digiere el amplificado cuando el alelo es el M235, y Tth111-I o BstUI, que digieren el amplificado cuando el alelo es el 235T. En un estudio reciente 75, en el que se comparan los resultados de la PCR-ASO y de la PCR-RFLP con Tth111 aplicadas a sólo 10 muestras de DNA, se ha observado que la PCR-RFLP puede dar lugar a una estimación falsamente elevada de la frecuencia del alelo M235 debido a la existencia en algunos casos de digestión incompleta de los amplificados. Cabe pensar que este mismo fenómeno puede darse en las digestiones con SfaNI. Sin embargo, dentro del bloque de poblaciones europeas, norteamericanas y australianas de origen caucasiano que estamos analizando en esta revisión, hay valores en los extremos de la distribución de frecuencias de los alelos M235 y 235T que corresponden, precisamente, a estudios hechos con PCRRFLP (69% y 31% respectivamente 53; 50% y 50% respectivamente 46). Lo mismo sucede dentro del bloque de poblaciones asiáticas y negras (40% M235 y 60% 235T 58, 16% M235 y 84% 235T 40). En ambos bloques de población, se observan intercalados entre estos extremos tanto trabajos hechos con PCR-ASO como trabajos hechos con PCR-RFLP. Por lo tanto, parece poco probable que la variabilidad de los resultados publicados acerca de la relación entre el polimorfismo M235T del gen del AGT y la HTA sea debida a diferencias en los métodos de biología molecular empleados. Nuestra observación extiende una observación previa en el mismo sentido, hecha en un meta-análisis realizado sobre trabajos exclusivamente con poblaciones blancas 66. PERSPECTIVAS DE FUTURO Tras la consideración de todo lo anteriormente expuesto, se puede llegar a la conclusión de que la variabilidad de los resultados publicados con respecto a la relación entre polimorfismos del gen del AGT e HTA tiene que ver, básicamente, con cues- tiones estadísticas y con variaciones étnicas, adquiriendo las primeras una relevancia especial por el hecho de que el riesgo de HTA atribuible a variantes del gen del AGT parece que es cuantitativamente modesto 54, 66, 67. Quizá la HTA sea una enfermedad especialmente difícil de abordar desde el punto de vista genéticoestadístico: por una parte tiene un s relativamente alto (de 2,4 6 o de 3,5 3, dependiendo de las poblaciones), lo que indicaría la conveniencia de hacer análisis de ligamiento, pero por otra parte la susceptibilidad genética a la HTA es multifactorial, lo que iría a favor de realizar estudios de asociación 3234 . Trabajos recientes 54, 66 recomiendan la realización de family-based association studies, que, como se dijo antes, se pueden considerar como métodos mixtos de ligamiento y de asociación. Los family-based association studies solventan, además, el problema de la falta de homogeneidad étnica de pacientes y controles que se puede dar en los estudios de asociación convencionales. Sin embargo, los familybased association studies tienen el inconveniente de que carecen de una población control real. Nosotros estamos llevando a cabo un estudio sobre polimorfismos del gen del AGT y riesgo de HTA empleando un método estadístico no utilizado hasta ahora en el área de la genética de la HTA, que combina metodología de los análisis de ligamiento y metodología de los análisis de asociación convencionale. En este método, llamado análisis de ligamiento sib pair con diseño caso-control 76, los hermanos enfermos de cada probando son los casos y los hermanos sanos de cada probando son los controles. Los casos y los controles de cada familia se comparan con respecto al número de alelos que comparten con su probando, y, a continuación, se calcula la OR del grupo de individuos que comparte alelos tomando como grupo de referencia el conjunto de sujetos que no comparten ningún alelo. Las ORs que son significativamente altas se consideran indicativas de ligamiento entre el marcador genético y la enfermedad. Este método tiene varias ventajas, además de la de garantizar la homogeneidad étnica de pacientes y de controles, que creemos que lo hacen adecuado para solventar algunos de los problemas estadísticos de la genética de la HTA que hemos ido viendo a lo largo de esta revisión. Si las transmisiones de una enfermedad y de un marcador genético no son independientes, los pares de hermanos afectados deben compartir un exceso de alelos sobre lo esperado en el caso de transmisiones independientes, pero al mismo tiempo el número de alelos compartidos por los pares (hermano no afectado - probando) debe ser inferior al número esperado si las transmisiones son independientes. Así, en este método las comparaciones 123 J. M. ZABAY y cols. se establecen entre dos magnitudes más diferentes entre sí que en un sib pair analysis convencional, ya que en éste se comparan el número de alelos compartidos por pares de hermanos afectados y el número esperado si las transmisiones de la enfermedad y el marcador genético son independientes. Por lo tanto, es de esperar que el poder estadístico del método de análisis de ligamiento sib pair con diseño caso-control sea superior al de un método convencional de sib pair analysis. Por otra parte, la prueba estadística que se utiliza en el método de análisis de ligamiento sib pair con diseño caso-control (cálculo de ORs con sus correspondientes intervalos de confianza del 95%) es más sencilla que varias de las pruebas que hay que llevar a cabo en los métodos convencionales de sib pair analysis para saber si son o no significativos los excesos del número de alelos compartidos por pares de hermanos afectados. Por último, en el método de análisis de ligamiento sib pair con diseño caso-control se cuenta con controles reales, por lo que se pueden aplicar en él métodos estadísticos de ajuste para controlar los efectos de factores tales como el sexo, la edad, diversos factores ambientales, etc. De acuerdo con el hecho de que las variaciones étnicas de las poblaciones estudiadas en los distintos trabajos contribuyen notablemente a la variabilidad de los resultados publicados con respecto a la relación entre polimorfismos del gen del AGT e HTA, se ha recomendado como una directriz para futuros trabajos en esta área el estudio de «islas» de población, en las cuales es más probable que los individuos posean las mismas variantes genéticas que predisponen a la HTA y estén expuestos al mismos ambiente 4. En el trabajo que nosotros estamos llevando a cabo, al cual nos acabamos de referir, la población de estudio es población autóctona de la isla de Mallorca, que procede, además de las zonas de la isla con elevada consanguinidad. Esta población está expuesta a un ambiente relativamente homogéneo, dadas la pequeña extensión del territorio del que procede y la uniformidad de sus hábitos sociales y culturales. Creemos que un buen ejemplo de una «isla» de población, como las recomendadas por Schork 4, puede ser, si se admite el juego de palabras, la población de nuestra isla. AGRADECIMIENTOS Este trabajo forma parte del desarrollo del Proyecto de Investigación titulado «Factores genéticos de riesgo de la hipertensión arterial esencial: análisis en la población autóctona balear», que está financiado por el FIS (ayuda 99/0442). 124 BIBLIOGRAFÍA 1. O'Byrne S, Caulfield M: Genetics of hypertension. Therapeutic implications. Drugs 56: 203-214, 1998. 2. 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