NEFROLOGÍA. Vol. XXIII. Suplemento 2. 2003 Efecto de la desferrioxamina y de la deferiprona sobre la secreción de osteocalcina en células tipo osteoblasto I. González Suárez, J. L. Fernández Martín, M. Naves Díaz y J. B. Cannata Andía Servicio de Metabolismo Óseo y Mineral. Instituto Reina Sofía de Investigación. Hospital Universitario Central de Asturias. Universidad de Oviedo. Oviedo. RESUMEN La desferrioxamina y la deferiprona son dos drogas quelantes de metales que se emplean en la sobrecarga alumínica de los pacientes en diálisis. Se ha descrito que la desferrioxamina mejora la mineralización ósea, sin descensos importantes de la concentración de aluminio en hueso. Esto sugiere un efecto directo de la desferrioxamina sobre las células óseas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de desferrioxamina y deferiprona sobre células óseas de estirpe osteoblástica. El estudió se realizó en cultivos de células MG-63. Las células se sembraron a una densidad de 15.000 cel/cm2 y se llevaron a confluencia en un medio DMEM con 10% FCS. Tras 72 horas, se reemplazó el medio por el de ensayo: 1% BSA, 10-9M 1,25(OH)2D3 y desferrioxamina 5, 10, 20, 40, 60, 80 µM o deferiprona 15, 30, 60, 120, 180, 240 µM. Como control se utilizó Tris-HCl a pH 7,4. A las 48 horas se recogieron los sobrenadantes y se midió la osteocalcina secretada. La desferrioxamina y la deferiprona inhibieron la secreción de osteocalcina inducida por vitamina D a concentraciones elevadas (desferrioxamina: 60 µM, 80 µM; deferiprona: 180 µM, 240 µM) mientras que la estimularon a bajas concentraciones (desferrioxamina 5 µM; deferiprona 15 µM). Estos resultados sugieren que tanto la desferrioxamina como la deferiprona son capaces de ejercer un efecto directo sobre el metabolismo del hueso independientemente de su capacidad quelante de metales. Palabras clave: Desferrioxamina. Deferiprona. Osteocalcina EFFECT OF DESFERRIOXAMINE AND DETERIPRONE ON THE 1,25(OH)2D3STIMULATED OSTEOCALCIN SECRETION IN OSTEOBLAST-LIKE CELLS SUMMARY Desferrioxamine and deferiprone are both metal-chelating drugs often used in aluminum-overloaded dialysis patients. In these patients, desferrioxamine produces an improvement on bone mineralisation without a relevant decrease in bone aluminum. Thus, desferrioxamine might have a direct effect on bone cells. The aim of this study was to assess the effect of desferrioxamine and deferiprone on 1,25(OH)2D3-stimulated osteocalcin secretion in osteoblast-like cells. Correspondencia: Dr. Jorge B. Cannata Andía Servicio de Metabolismo Óseo y Mineral Instituto Reina Sofía de Investigación. Hospital Central de Asturias C/ Julián Clavería, 6 33006 Oviedo. Asturias E-mail: metoseo@hca.es 27 I. GONZÁLEZ-SUÁREZ y cols. The study was carried out in MG-63 cell cultures. Cells were seeded at a density of 15,000 cel/cm2 and grown to confluence for 72 hours in DMEM supplemented with 10% FCS. The medium was then replaced by another medium containing 1% BSA, 10-9M 1,25(OH)2D3 and desferrioxamine 5, 10, 20, 40, 60, 80 µM or deferiprone 15, 30, 60, 120, 180, 240 µM. Tris-HCl at pH 7.4 was used as control. After 48 hours, supernatants were collected for the measurement of secreted osteocalcin. Desferrioxamine and deferiprone, at high doses (desferrioxamine: 60 µM, 80 µM; deferiprone: 180 µM, 240 µM), inhibited the 1,25(OH)2D3-induced osteocalcin secretion. On the contrary, at lower doses (desferrioxamine 5 µM; deferiprone 15 µM) stimulated the secretion. In summary, these results suggest that desferrioxamine and deferiprone exert a direct effect on bone cell metabolism that might be independent from their metalchelating properties. Key words: Desferrioxamine. Deferiprone. Osteocalcin. INTRODUCCIÓN La desferrioxamina (DFO) y la deferiprona (L1) son dos drogas utilizadas tanto en el tratamiento de la sobrecarga férrica en pacientes talasémicos 1, 2 como en el tratamiento de la intoxicación alumínica 3, 4, en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). En estos últimos, la eliminación del aluminio durante la diálisis se ve muy limitada ya que el metal se encuentra unido a proteínas plasmáticas de elevado peso molecular que no son dializables. Tanto la desferrioxamina como la deferiprona son capaces de desplazar el metal de sus proteínas transportadoras, con lo que se elevan los niveles séricos de Al ultrafiltrable 5. También son capaces de eliminar Al de los tejidos 3. Así, se ha descrito que el tratamiento con desferrioxamina mejora la mineralización ósea en pacientes con osteodistrofia renal inducida por aluminio. Sin embargo, aunque se observa un descenso en los niveles de Al en la superficie de osteoide, la concentración total de aluminio en el hueso no disminuye significativamente 6, 7. Además, se ha descrito que la desferrioxamina es capaz de alterar el metabolismo de las células óseas, incrementando la producción de fosfatasa alcalina y la secreción de osteocalcina en osteoblastos in vivo 8, 9. Todo ello, en conjunto, sugeriría un posible efecto directo de la desferrioxamina sobre el hueso, el cual sería independiente de su capacidad para extraer Al del mismo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la desferrioxamina y la deferiprona sobre la producción de osteocalcina --un conocido marcador de recambio óseo-- estimulada por calcitriol en células tipo osteoblasto. 28 MATERIAL Y MÉTODOS Para llevar a cabo este estudio se utilizó una línea celular de osteosarcoma humano (MG-63). Aunque se trata de una línea de origen tumoral, varios estudios han demostrado su capacidad para proporcionar una respuesta similar a la de osteoblastos diferenciados. Esto es, la capacidad para síntetizar fosfatasa alcalina, osteocalcina y otras proteínas dependientes de vitamina K cuando su diferenciación se ve estimulada con calcitriol 10, 11. Durante el estudio las células se mantuvieron en frascos de cultivo de 75 cm2 (NUNC®) en un medio DMEM suplementado con FCS al 10% (Seromed) según condiciones previamente descritas 9. La desferrioxamina utilizada fue mesilato de desferrioxamina (Ciba-Geigy, Desferal) y la deferiprona (L1 ó 1,2 dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona) fue cedida por el Dr. G. J. Kontoghiorghes. Para estudiar el efecto de ambas drogas sobre la secreción de osteocalcina se sembraron las células en placas de 96 pocillos a una densidad de 15.000 células/cm2 en 200 µl de medio suplementado con un 10% FCS. Las células se mantuvieron en un incubador a 37ºC y en atmósfera húmeda con un 5% de CO2. Las células se llevaron a confluencia manteniéndolas en este medio durante 72 h. En ese momento se sustituyó el medio por otro sin FCS pero con BSA 0,1% y calcitriol 10-9M. Se añadieron las distintas concentraciones a ensayar de desferrioxamina (5, 10, 20, 40, 60, 80 µM) y deferiprona (15, 30, 60, 120, 180, 240 µM) diluidas en Tris-HCl 5 mM, pH 7,4. Como control se utilizó Tris-HCl 5 mM, pH 7,4. Para cada una de las concentraciones se realizaron 6 replicados y cada experimento se llevó a cabo por triplicado. EFECTO DE LA DESFERRIOXAMINA Y DE LA DEFERIPRONA SOBRE LA SECRECIÓN... 50 ** 40 30 Tratamiento con L1 50 ng OC/mg proteína Total 40 30 20 10 0 * Tratamiento con DFO ng IC/mg proteína Total ** ** ** 20 10 0 15 µM 30µM 60µM 120 µM ** 180 µM 240 µM 15 µM 30µM 60µM 120 µM 180 µM 240 µM ** p < 0,005 (frente al control) ** p < 0,005 (frente al control) Fig. 1.--Secreción de osteocalcina en cultivos tratados con Deferiprona (valores normalizados frente a mg de proteína total). La línea central representa la secreción de osteocalcina en el grupo control. Fig. 2.--Secreción de osteocalcina en cultivos tratados con Desferrioxamina (valores normalizados frente a mg de proteína total). La línea central representa la secreción de osteocalcina en el grupo control. La osteocalcina secretada se determinó mediante ensayo inmunorradiométrico (IRMA) (Human Osteocalcin Kit, Nichols Institute). Los valores se expresaron como ng de osteocalcina corregidos frente a los mg de proteína total determinados mediante el método de Bradford 12. El análisis estadístico de los resultados, expresado como media ± desviación estándar se llevó a cabo utilizando el paquete informático SPSS 8.0 para Windows. RESULTADOS Tanto la desferrioxamina como la deferiprona fueron capaces de inhibir la secreción de osteocalcina inducida por calcitriol a concentraciones elevadas (desferrioxamina: 60µM, 80µM; deferiprona: 180 µM, 240 µM). Dicha inhibición fue máxima con las concentraciones mas elevadas de ambos quelantes, (desferrioxamina: 14,11 ± 5,93 vs 28,14 ± 7,43 ng osteocalcina/mg de proteína y deferiprona: 13,02 ± 9,58 vs 28,14 ± 7,43 ng osteocalcina/mg de proteína; p < 0,005) con las que se logró reducir la síntesis de osteocalcina a la mitad (desferrioxamina 80 µM y deferiprona 240 µM, p < 0,005) (figs. 1 y 2). Por el contrario, a bajas concentraciones ambas estimularon la secreción de osteocalcina. Se observó un incremento de un 25% con desferrioxamina 5 µM (35,48 ± 4,79 vs 28,14 ± 7,43 ng osteocalcina/mg de proteína total, p < 0,024) y de un 50% con deferiprona 15 µM (42,30 ± 2,15 vs 28,14 ± 7,43 ng osteocalcina/mg de proteína total, p < 0,005). DISCUSIÓN El aluminio es un elemento capaz de alterar la mineralización ósea en pacientes de diálisis provocando osteomalacia. Se ha descrito que este metal es capaz de inhibir la secreción y/o síntesis de osteocalcina en líneas celulares tipo osteoblasto 13, 14 y en ratas sobrecargadas con aluminio 15. La desferrioxamina es una droga quelante que es capaz de extraer aluminio de los depósitos tisulares así como de liberar al mismo de su principal transportador plasmático (la transferrina) incrementando los niveles de Al ultrafiltrable (dializable) 16 incluso cuando se emplea a dosis muy bajas 17. Si bien la desferrioxamina fundamentalmente a esos dos niveles, su mayor efecto beneficioso sería a través de la eliminación de aluminio del frente de mineralización del hueso permitiendo de nuevo la mineralización del mismo, y tal vez, también disminuyendo la concentración de aluminio de los osteoblastos favoreciendo su actividad y su capacidad de mejorar el remodelado óseo. Es probable que éste no sea el único mecanismo de acción de los quelantes, dado que si bien tras su utilización se ha observado mejoría de los parámetros histológicos, que a su vez se correlacionan con el descenso significativo de Al en hueso 18. Otros estudios, clínicos 19 y experimentales 20, han demostrado una mejoría en los mismos parámetros con descensos mínimos del contenido total de aluminio en hueso. Estos hallazgos 29 I. GONZÁLEZ-SUÁREZ y cols. sugieren que los quelantes podrían tener un efecto adicional sobre el metabolismo de las células óseas independientemente de su capacidad para extraer aluminio. En nuestro estudio, hemos observado que tanto desferrioxamina como deferiprona a baja dosis son capaces de estimular la secreción de osteocalcina en osteoblastos, mientras que a dosis elevadas ambas drogas inhiben la secreción de osteocalcina. El efecto a baja dosis estaría de acuerdo con lo descrito in vivo por otros autores 8 que han observado un incremento anómalo de los niveles de osteocalcina sérica tras el tratamiento con desferrioxamina en pacientes en diálisis. Sin embargo, en dicho estudio, el incremento de osteocalcina sérica no se debió a un incremento de la actividad osteoblástica sino a un incremento de fragmentos de osteocalcina procedentes de la degradación de la osteocalcina intacta circulante y de la matriz proteica del hueso como consecuencia de un aumento de la resorción ósea. Dichos incrementos, no se observaron cuando se empleó un kit IRMA que detecta solo osteocalcina intacta y no fragmentos de la misma. En estudios previos de nuestro grupo se observó que la desferrioxamina fue capaz de incrementar la actividad fosfatasa alcalina en células MG-63, los resultados aportados en el presente estudio corroboran que tanto esta droga como, así también, la deferiprona son capaces de incrementar la actividad osteoblástica a bajas dosis 9. Este comportamiento bimodal de los quelantes observado en nuestros estudios podría estar debido al efecto quelante que tanto desferrioxamina como deferiprona tienen sobre el hierro. El hierro actúa como cofactor de la ribonucleótido reductasa, un enzima implicado en la síntesis de DNA. A dosis bajas de desferrioxamina y deferiprona se produciría una inhibición de la proliferación celular 9, sin embargo, el metabolismo celular no se vería afectado, por lo que se favorecería la diferenciación celular y la secreción de osteocalcina aumentaría. A concentraciones elevadas de ambas drogas, el metabolismo celular sí se vería afectado (el hierro es un elemento esencial para las células eucariotas) por lo que la secreción de osteocalcina disminuiría. En resumen, estos resultados apoyan la hipótesis de que el efecto beneficioso que tienen los quelantes administrados a baja dosis como tratamiento de la sobrecarga alumínica podría no ser debido exclusivamente a la capacidad de extracción de aluminio del hueso sino también a un incremento de la actividad osteoblástica inducida de forma directa por estos fármacos. 30 Agradecimientos Este estudio ha sido posible gracias a la ayuda de la Sociedad Española de Nefrología (Beca SEN) y al Dr. G. J. Kontoghiorghes por haber cedido la Deferiprona. Ignacio González Suárez ha disfrutado de una beca predoctoral de la Fundación Renal (IRSFRIAT) y de la Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y de la Tecnología (FICYT). En la actualidad disfruta de una beca BEFI del Fondo de Investigaciones sanitarias (Instituto de Salud Carlos III). BIBLIOGRAFÍA 1. Moeschlin S, Schnider U: Treatment of primary and secondary hemochromatosis and acute iron poisoning with a new potent iron eliminating agent (Desferroxamine B). N Engl J Med 269: 57-66, 1963. 2. Olivieri NF, Templeton DM, Koren G y cols.: Evaluation of the oral iron chelator 1,2-dimethyl-3-hydroxypyrid-4-one (L1) in iron-loaded patients. Ann N Y Acad Sci 612: 369-377, 1990. 3. Ackrill P, Ralston AJ, Day JP: Role of desferrioxamine in the treatment of dialysis encephalopathy. Kidney Int Suppl 18: S104-S107, 1986. 4. Kontoghiorghes GJ: Chemical, pharmacological, toxicological and therapeutic advances of deferiprone (L1) and other iron and aluminium chelators. Arch Toxicol Suppl 18: 202-214, 1996. 5. 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