NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 5. 1994 Biología molecular de los mecanismos de transporte reguladores del pH intracelular R. López, R. Muñoz, A. Carciandía, A. Alonso, A. Fortuño, A. Arrázola y J. Díez Departamento de Medicina Interna, Centro de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra. *Departamento de Bioquímica, Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud, Universidad Pública de Navarra. INTRODUCCION El organismo cuenta con varios sistemas que intervienen en el mantenimiento del equilibrio ácido-bas e global. Si se producen variaciones en la concentración de iones hidrógeno (H+), éstas son rápid a m e n t e amortiguadas por los tampones pres e n t e s en los líquidos corporales: el sistema H2CO3/NaHCO3, el sistema NaH2PO4/Na2HPO4 y las proteínas solubles del plasma sanguíneo. Si las alteraciones persisten, la ventilación pulmonar, la composición de la orina y el metabolismo hepático se modifican hasta alcanzar de nuevo el equilibrio ácido-base en el organismo. La célula necesita, asimismo, mecanismos propios reguladores del pH, porque en el interior celular también se producen alteraciones en el equilibrio entre ácidos y bases por una tendencia a la sobrecarga ácida intracitoplasmática como consecuencia de los siguientes precesos: 1) la entrada pasiva de H+; 2) la entrada de ácidos débiles, ; como el ion NH4+ 3) la salida de bases débiles, como el lactato o el acetato; 4) la salida del ion CO3H-; y 5) las reacciones catabólicas/anabólicas del metabolismo celular 1 (fig. 1). Por todo ello, es necesaria la existencia de mecanismos con una actividad reguladora de la concentración intracelular de H+ en situación basal. Así se logra mantener el pHintra-celular (pHi) en los valores fisiológicos, que en células de vertebrados está entre 7,1 y 7,2 2. L o s mecanismos implicados en la regulación y mantenimiento del pHi basal se clasifican de acuerdo a su tiempo de respuesta ante las variaciones en éste: 1) un mecanismo de acción inmediata ante las alteraciones agudas del pHi, mediado por la propia capacidad tamponadora de la célula, gracias a proteínas Correspondencia: Dr. Javier Díez. Laboratorio de Transporte Celular e Hipertensión Arterial. Departamento de Medicina Interna. Centro de Investigaciones Biomédicas. Facultad de Medicina. 31080 Pamplona. libres, así como a determinadas estructuras intracelulares capaces de secuestrar H+ presentes en el citosol, y 2) unos mecanismos de acción más lenta que corrigen las alteraciones crónicas y a largo plazo del pHi, o mediados por unas proteínas transportadoras de la membrana plasmática. Entre ellas, las más importantes por su actividad y por su número son: el i n t e r c a m b i a d o r Na+/H+ (fig. 2) , que extrae H+ del citoplasma a cambio de Na+ extracelular, actuando como un basificador celular; y una familia de proteínas que son capaces de transportar bicarbonato a ambos lados de la membrana celular, los intercambiadores C I - / C 0 3 H - (fig. 2). De esta familia de intercambiadores se han descrito, hasta la fecha, tres formas: 1) un intercambiador Cl-/CO3H- independiente de Na+, que actúa extrayendo CO3H- intracelular en intercambio por Cl- extracelular, por lo que acidifica el citoplasma y promueve la recuperación del pHi tras una sobrecarga alcalina intracelular; 2) un intercambiador Cl-/CO3H- dependiente de Na+, que saca Cl- y H+ de la célula en intercambio por CO3H- y Na+ extracelulares, cuyo efecto es la alcalinización celular, y 3) el (2) EH+ H+ - Fig. 1.-El balance en las concentraciones de ácidos y bases dentro de la célula tiende a desequilibrarse porque existe una tendencia a la acumulación de ácidos en el citoplasma, que acaece como consecuencia de los siguientes procesos: 1) la entrada pasiva de protones; 2) la entrada de ácidos débiles; 3) la salida de bases débiles; 4) la salida del ión CO3H-, y 5) los productos generados en las reacciones del metabolismo celular. 543 R. LOPEZ y cols. CIH Fig. 2.-Mecanismos de transporte de iones sitos en la membrana p l a s m á t i c a reguladores del pH intracelular: 1) intercambiador Na+/H+; 2) Ca2+-ATPasa; 3) bomba de H+; 4) intercambiador Cl-/ CO3H- independiente de Na +; 5) intercambiador CI-/CO3Hdependiente de Na+, y 6) cotransportador CO3H-; Na+. cotransportador CO3H--Na+, que transporta ambos iones acoplados hacia el interior o hacia el exterior de la célula, dependiendo de las condiciones iónicas de ésta, aunque su importancia en la regulación del pHi es escasa. Además de los mecansimos señalados, existen otros sistemas involucrados también en el ajuste del pHi, aunque su papel es poco relevante: las bombas de H+, los canales de H+ y la Ca 2+- A T P a s a (fig. 2). Se conocen dos tipos de bombas de H+ que pueden estar implicadas en la regulación del pHi: la H+-ATPasa electrogénica y la K+-H+-ATPasa electroneutra. Ambas son importantes en los procesos de secreción ácida en riñón, estómago y colon, pero no se han descrito en células distintas de las de los epitelios secretores. Los canales de H+ sí han sido hallados en la mayoría de las células, aunque todavía no está clara su función fisiológica. Por último, la Ca2+-ATPasa, que en condiciones fisiológicas es activada principalmente por la concentración de Ca2+ intracelular y que en diversas células podría actúar como un mecanismo de intercambio obligatorio de Ca2+ intracelular por H+ extracelular. En esta revisión nos ceñiremos al estudio molecular de los transportadores Cl-/CO3H- y Na+/H+, que, como hemos referido antes, constituyen los principales sistemas de membrana con los que cuenta la célula para regular su pHi, y cuyo conocimiento ha aumentado notablemente gracias a los últimos avances producidos en biología molecular. LOS INTERCAMBIADORES Cl-/CO3HAspectos generales El transportador CI-/CO3H- fue descrito y estudiado 544 por primera vez en la membrana del eritrocito, donde el intercambio de ambos iones posibilita al hematíe no sólo regular la concentración de ácidos y bases en su citoplasma, sino también aumentar en cinco veces la capacidad de transporte de gases por la sangre. Esta proteína fue originalmente bautizada con el nombre de proteína de la banda 3, nombre que deriva de su posición relativa a otras glicoproteínas de la membrana del eritrocito tras una electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida 3. Aunque tras el descubrimiento de que existen otras proteínas relacionadas estructural y funcionalmente con la proteína de la banda 3, y que han sido denominadas con el nombre de Anion Exchangers (AE) 4, la proteína de la banda 3 se conoce también como AE1. Esta proteína ha sido una de las mejor estudiadas y caracterizadas, no solamente por el hecho de que es fácilmente accesible a los investigadores y por el alto número en que está presente -aproximadamente 1'21O6 copias/célula en eritrocitos de mamíferos 3, lo que significa que una de cada cuatro proteínas de la membrana de los eritrocitos es una proteína AE1 5 - , sino por las importantes funciones que realiza en la célula. En la estructura de AE1 existen dos dominios f u n c i o n a l e s segregados en los extremos NH2 y COOH de la proteína. El primero, el dominio NH2terminal, cumple una función eminentemente estructural, pues sirve de punto de anclaje entre el citoesqueleto celular y la membrana plasmática; mientras que el segundo, el dominio COOH-terminal, cataliza el intercambio de aniones Cl- y CO3H- a través de la membrana, lo que comporta un aumento de la capacidad del transporte de gases en la sangre, ayuda a regular el pHi 6 y la concentración celular del ion Cl- 7 e interviene en el control del volumen celular 8. Estructura primaria y dominios funcionales de la proteína Una vez aislada la proteína AE1 de la membrana del eritrocito, el siguiente paso fue determinar su estructura primaria. La secuencia completa de la proteína AE1 se obtuvo por vez primera a partir de c é l u l a s de ratón. Kopito y Lodish 4 provocaron anemia en ratones, lo que provocó una proliferación de las células precursoras de eritrocitos en el bazo de dichos ratones. Posteriormente aislaron el ARNm de estas células, utilizándolo para construir una genoteca de ADNc, de donde se obtuvo la secuencia completa del ADNc de la proteína AE1 de ratón. En 1988 se consiguió la secuencia completa de AE1 de aves 9, 10, y por fin, poco tiempo después, de hombre 11,12. Un análisis computarizado muestra la gran homología en la secuencia aminoacídica que presentan estas tres proteínas (tabla I). REGULACION DEL pH INTRACELULAR T a b l a I. Porcentaje de homología entre los pol i p é p t i d o s AE1 obtenidos de diferentes especies animales, referido tanto al dominio N H 2 - t e r m i n a l o citoplasmático como al dominio COOH-terminal o de membrana. Hombre NH2 Hombre Ratón pollo 84 68 COOH 95 86 61 Ratón NH2 COOH 85 Pollo NH2 COOH - El perfil hidrofílico de AE1, obtenido según el algoritmo de Kyte y Doolittle 13, revela cómo la multifuncionalidad de la proteína queda reflejada en su estructura 14-16. Claramente se aprecian dos dominios e s t r u c t u r a l e s (fig. 3): dominio NH,-terminal o citop l a s m á t i c o y dominio COOH-terminal o de membrana. El dominio NH2-terminal de la proteína AEl se extiende desde el primer aminoácido hasta el número 400 17. Aunque rico en residuos hidrofílicos, contiene pequeños segmentos con aminoácidos hidrofóbicos que se pliegan sobre sí mismos formando estructuras helicoidales intracitoplasmáticas 11. El dominio NH2terminal tiene un peso aproximado de 43 KDa y está incluido en el citoplasma, donde interactúa con proteínas del citosol y del citoesqueleto celular, así como con otras proteínas de la membrana 18. La más importante de estas interacciones es la unión con la anquirina 1 9, que a su vez se une a la espectrina, proporcionando así un punto de anclaje del citoesquele- COOH Fig. 3.-Esquema de la estructura y disposición de la proteína AE1 en la membrana plasmática. Funcional y estructuralmente la proteína se divide en dos dominios: el dominio COOH-terminal, insertado en la membrana, y el dominio NH2-terminal incluido en el citoplasma. El primero cataliza el transporte iónico, mientras que el segundo participa en la unión a otras proteínas de la membrana y del citosqueleto celular. De los 74 segmentos con estructura secundaria en a-hélice predichos a partir de la secuencia aminoacídica, sólo se representan ocho de ellos en la figura. to celular a la membrana plasmática. Esta capacidad para asociarse con la anquirina parece ser que está altamente conservada en las diferentes especies estud i a d a s 20. El dominio NH2-terminal contiene, asimismo, puntos de unión para la hemoglobina y el h e m o c r o m o , para enzimas glicolíticas (la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la aldolasa y la fosfofructoquinasa), para la catalasa y para otras proteínas de la membrana plasmática (proteína de la banda 4.1 y la proteína de la banda 4.2), siendo además un substrato para multitud de tirosinas kinasas 21. Por otra parte, el dominio citoplasmático de AEl puede tener un papel importante en la senescencia de los eritrocitos 22, puesto que su unión a la hemoglobina desnaturalizada favorece la aglomeración de varias moléculas de proteína de AEl. Estos acúmulos, al ser reconocidos por autoanticuerpos circulantes, servirían como señal para la eliminación de los eritrocitos senescentes del torrente sanguíneo. El dominio COOH-terminal o de membrana de la p r o t e í n a muestra un fuerte carácter hidrofóbico. Tiene un peso aproximado de 52 KDa y su longitud sobrepasa los 500 aminoácidos 23. Sin embargo, los últimos 25-30 residuos de este dominio constituyen un segmento altamente hidrofílico y, al igual que el dominio NH2-terminal, vuelve a estar incluido en el citoplasma. Aunque se desconoce su función fisiológica, algunos autores lo consideran como el tercer dominio estructural de la proteína 2 4 . En el perfil hidrofóbico de AE1 se aprecia que este dominio de membrana es rico en fragmentos fuertemente apolares, intercalados con otros segmentos más cortos de carácter polar. Todos los fragmentos hidrofóbicos tienen una longitud suficiente para atravesar la bicapa lipídica que constituye la membrana (se considera que una a-hélice debe tener aproximadamente 20 residuos para atravesar una bicapa de 70 A). En concreto, se han definido 14 de estos segmentos transmembranares, aunque la posición de todos ellos no ha sido aún determinada con exactitud 12. El análisis por dicroísmo circular indica que el 90 % de la porción asociada a la membrana de AE1 es una ahélice 25. La actividad transportadora de aniones mediada por AE1 es totalmente independiente del dominio citoplasmático. Por lo tanto, el dominio COOH-terminal es esencial y suficiente para catalizar el transporte 1:1, electroneutro y reversible de los aniones Cl- y CO3 H- 14,15. Este intercambio aniónico es irreversiblemente inhibido por compuestos estilbeno-disulfónicos, como el ácido 4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-dis u l f ó n i c o (DIDS), y también por algunos derivados h i d r o g e n a d o s (H2-DIDS). Gracias a las técnicas de síntesis peptídica in vitro, se ha conseguido analizar t o d o el dominio COOH-terminal para delimitar 545 R. LOPEZ y cols. aquellas regiones que intervienen específicamente en el intercambio aniónico o en su inhibición. Los resultados indican que estas regiones están comprendidas entre los residuos 549-594, 804-839 y 869-883 26. Topología en la membrana El modelo que se ha propuesto para explicar la inserción y la orientación de AEl en la membrana plasmática está basado en el perfil hidropático y en diversas digestiones enzimáticas de la proteína, así como en experimentos de marcaje que modifican selectivamente la cara interior y exterior de la membrana del eritrocito. El modelo ha sido completado con los datos aportados por la biología molecular (fig. 3). Diversos datos recogidos tras la aplicación de técnicas bioquímicas indican que AEl no es monomérica en la membrana nativa 14,27. Esta idea concuerda con la idea de que la proteína es tetramérica, pero siendo el tetrámero un dímero de dímeros. Parece que hay interacción entre las unidades tanto en el dominio de membrana como en el citoplasmático. Aunque la proteína es oligomérica, no existen evidencias de que el mecanismo de transporte iónico requiera interacción entre las diferentes subunidades 16,28, siendo el monómero la unidad transportadora del oligómero. Lo que sí se ha demostrado es que cambios en la estructura cuaternaria de los oligómeros de AE1 pueden afectar ciertas propiedades estructurales de la proteína. Por ejemplo, en el eritrocito, la unión de DIDS a la región extracelular del dominio de membrana de AE1 hace que disminuya la afinidad del dominio citoplasmático por la hemoglobina. AE1, como la mayoría de las proteínas integrales de la membrana plasmática, tiene polisacáridos unidos. Se han establecido posiciones consenso donde hay N-glicosilación: N-593 y N-642 29. Los azúcares unidos a la posición N-642 muestran gran heterogeneidad. No se conoce la función del azúcar, si la tiene, en el intercambio iónico. Hay evidencias de que la glicosilación puede afectar procesos de transporte acoplados, como por ejemplo el intercambio Na+/H+ 30, y es posible que lo mismo ocurra para AE1. Aunque las escasas pruebas de las que se dispone parecen contrariar esta hipótesis, pues en células que no poseen glicoforina, otra proteína de la membrana, AE1 está más glicosilada de lo habitual, sin que esto afecte al transporte iónico 31,32. Otro dato que parece indicar la falta de función de los carbohidratos en el intercambio de aniones es que cada subunidad de AE1 colabora por igual en el transporte; sin embargo, diferentes copias de la proteína tienen unidos polisacáridos de distinta longitud. Datos experimentales obtenidos en ratones in vivo muestran que AE1 sólo es sintetizado durante las últi546 mas fases del desarrollo del eritroblasto, mucho tiempo después de que se haya sintetizado y ensamblado todo el complejo proteico que forma el citosqueleto celular. Otros experimentos realizados en eritroblastos de pollo indican que AE1 se ensambla dentro de la red del citosqueleto una vez que éste ya ha sido formado, lo que sugiere que la proteína AE1 es primero transportada y acoplada dentro de la membrana plasmática antes de establecer las interacciones a través de su dominio NH2-terminal 50. Pero aún no está claro cuándo adquiere este transportador su actividad catalítica, si en el momento de su síntesis o cuando ya está definitivamente incluido dentro de la membrana celular. Experimentos recientes de transfección han demostrado que tanto AE1 como AE2 adquieren la capacidad para efectuar el transporte de aniones en una fase muy temprana de su biosíntesis, antes de abandonar el retículo endoplásmico. Y parece ser que esta temprana adquisición de las propiedades catalíticas juega un papel fundamental en el desarrollo del eritroblasto. En efecto, se postula que las alteraciones en los medios iónicos que causaría la proteína AE1 activa, en su recorrido hasta la membrana plasmática, podrían inducir todos los procesos que concluyen con la diferenciación del eritroblasto en eritrocito. Identificación de la familia de genes de los AE El importante papel que desempeña AE1 en el eritrocito animó a los investigadores a pensar que deberían existir proteínas relacionadas-funcional, si no estructuralmente, con AE1 33. Esta idea estaba apoyada por el descubrimiento, en otros tejidos, de proteínas homólogas a aquellas con las que AE1 forma complejos estructurales en la membrana del hematíe, como la anquirina y espectrina. Además, existían abundantes evidencias fisiológicas y farmacológicas de que el intercambio aniónico es una función ubicua en la mayoría de las células de los mamíferos. La búsqueda de estas proteínas se acometió desde t r e s campos diferentes: bioquímica, inmunología y genética molecular, utilizando en cada caso herramientas distintas. Los bioquímicos usaban compuest o s inhibidores del transporte aniónico, como el DIDS, en células de diferentes tejidos para estudiar dónde quedaba bloqueado el transporte de aniones; los inmunólogos probaban sueros con anticuerpos mono y policlonales que reconocían varios epítopes en la estructura de AE1 y, por último, los biólogos moleculares diseñaron sondas específicas a partir de la secuencia del ADNc de AE1 capaces de unirse únicamente a ARNm estrechamente relacionados con la proteína. La integración de todos los trabajos REGULACION DEL pH INTRACELULAR rindió pronto los resultados esperados y dos nuevas proteínas fueron identificadas desde entonces. Estas proteínas, nombradas en principio como proteínas relacionadas con la banda 3, fueron posteriormente bautizadas con los nombres de AE2 y AE3, quedando así establecida la familia de polipéptidos de los intercambiadores de aniones. También se descubrió, gracias a estos trabajos, que la expresión de AE1 no se restringe a los eritrocitos, pues se aisló y secuenció un ADNc de AE1 a partir de células renales de rata, que era 0,2 Kb más corto que su homólogo sanguíneo 34. La proteína AE1 renal fue localizada exactamente en la membrana basolateral de las células intercaladas del túbulo colector de los riñones de los mamíferos. Un clon parcial de AE2 fue originalmente aislado de una línea celular eritroleucémica K562 35. La secuencia completa del ADNc de AE2, el cual es bastantante más largo que el de AE1, fue aislada a partir de tejido renal y de células linfoides 36, y más tarde de plexo coroideo 37 y de mucosa gástrica 33. AE3 ha sido clonado a partir de tejidos excitables: cerebro 39 y corazón 40. Comparando las secuencias de estos ADNcs, se observa que los polipéptidos AE1, AE2 y AE-3 son codificados por genes distintos, pero evolutivamente muy próximos, que constituyen una familia de genes derivada de un ancestro común. Se ha comprobado inequívocamente que tanto AE2 como AE3 catalizan el intercambio de aniones Cl- y CO3H- a través de la membrana plasmática, por inyección de sus respectivos ARNms en oocitos de Xenopus laevis. Aunque todavía no está caracterizado, parece ser que existe un currto miembro de esta familia, AE4 20. 5 Exo"" 1 1 I I I II III 111111 11111111 2 3 4 56789 10 1 3 ll III I ll III l I l 14 18 77 18 20 3 dos en aquella parte del gen que dará lugar al dominio COOH-terminal flanquean los exones del número 11 al 20 que codifican para lasa-hélices hidrofóbicas que atraviesan la membrana. Es interesante notar que el exón número 11, que contiene la primera a-hélice del dominio de membrana, tiene aproximadamente 115 pb muy conservadas a lo largo de toda la familia de genes AE, que corresponden a la unión entre los dominios de membrana y citoplasmá- tico 20. Las regiones reguladoras del extremo 5' de los genes AE1 han sido estudiadas para hallar motivos en la secuencia involucrados en el control transcripcional. Las clásicas cajas TATA o CAAT (secuencias específicas de ADN donde se unen los factores de transcripción) están presentes en cada uno de los dos promotores de los eritrocitos de pollo 45 y en el promotor del gen de AE1 en el riñón de rata 34; sin embargo, no están presentes ni en hombre ni en ratón 46. En el gen de ratón se han estudiado los 1.700 nucleótidos anteriores al codón de iniciación de la transcripción para buscar secuencias consenso que liguen a la RNA polimerasa ll, con resultados negativos. Estos genes, que carecen de las cajas TATA o CAAT u otras secuencias consenso, comparten una característica estructural: la región anterior al sitio de iniciación de la transcripción es rica en nucleótidos de guanina y citosina (G + C), y puede tener secuencias de unión para el factor de transcripción Sp1. El gen AE1 de ratón tiene, en esa región, un 65 % de G + C. Se especula que los p r o m o t o r e s ricos en G + C son característicos de aquellos genes que codifican para proteínas que se ocupan de «las tareas domésticas de la célula» (housekeeping genes) y que, por lo tanto, se expresarían por igual en todos los tejidos. El gen de AE1, que se expresa sólo en ciertos tejidos, parece refutar esta teoría. 547 Estructura y localización cromosómica de los genes AE AE1 está codificado por un gen de una sola copia en hombre 41, ratón 42 y pollo 43. Se ha determinado la localización cromosómica de este gen en el hombre, por hibridación in situ, en el brazo largo del cromos o m a 17 (17q21 -qter) 41, ligado al gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento neuronal. AE2 también está codificado por un gen de copia única en el genoma humano, y está localizado entre las regiones 35 y 36 del brazo largo del cromosoma 7 (7q35-7q36) 44. No se conoce, por el momento, en qué cromosoma se encuentra el gen AE3. El gen AE1 de ratón abarca aproximadamente 20 Kb de ADN 42, y contiene 20 exones y 19 intrones (fig. 4). Los 19 intrones del gen AE1 de ratón, de longitud variable entre 79 y 3900 pb, ocupan posiciones que coinciden con ciertas características estructurales de la proteína. En particular, los 9 intrones situa- R. LOPEZ y cols. Homología de secuencia entre los polipéptidos AE El ADNc de AE1 ha sido clonado de ratón 4, pollo 9, 10, hombre 11,12 y rata 34, y en todos ellos codifica proteínas que van desde 848 a 929 aminoácidos de longitud. El ADNc de AE2 ha sido clonado de ratón 36, rata 37, 38, hombre 47 y conejo 48, con proteínas d e 1.234 y 1.237 aminoácidos. Y, por último, el ADNc de AE3 ha sido clonado de ratón 39 y rata 38,40, con polipéptidos de longitud variable entre 1.030 y 1.227 aminoácidos (tabla II). El análisis computarizado de las secuencias de bases de la familia de proteínas AE obtenidas de distintas especies animales muestra que la similitud es más grande entre los polipéptidos AE de las mismas clases en diferentes especies, esto es, que existe mayor homología entre AE1 humano y AE1 de ratón que entre AE1 y AE2 de ratón20. La composición aminoacídica de los polipéptidos AE1, AE2 y AE3 de ratón, deducidas a partir de su secuencia nucleotídica, muestra un alto grado de homología, aunque ésta es considerablemente mayor en el dominio de membrana que en el citoplasmático. La gran variabilidad en la secuencia de aminoácidos que muestran los dominios citoplasmáticos de los polipéptidos AE puede tener implicaciones en la función que desempeñan en la célula 20. Se ha publicado recientemente que la proteína que se expresa en cerebro, AE3, es capaz de formar una asociación estable con la anquirina a través del dominio NH,-terminal, al igual que ocurre con AE1, mientras que AE2 es incapaz de formar dichos complejos debido a la diferente composición a m i n o a c í d i c a de su dominio citoplasmático 49 . También existen diferencias entre los dominios citoplasmáticos de la proteína AE1 eritrocitaria y la proteína AE1 renal, pues ésta es aproximadamente 9 KDa más pequeña que aquella por la pérdida de aminoácidos del extremo NH,-terminal. Se cree que estos residuos, en su mayoría ácidos, son los que Iigan enzimas glicolíticas a la proteína AE1 del hematíe. No existen pruebas de que la falta de éstos en la proteína renal afecte en modo alguno ni al transporte de aniones ni al anclaje al citoesqueleto celular. Expresión de los genes AE La presencia de múltiples intrones posibilita que cada uno de los genes AE se transcriba en varias formas de ARNm, algunas de las cuales producen polipéptidos diferentes. Mientras que sólo se sintetiza una forma de AE1 en eritrocitos de mamíferos 46, se dan dos formas de AE1 con igual abundancia en los eritrocitos de pollo 10 (el gen AE1 de pollo resulta inusual por el hecho de que ambos promotores son igualmente activos durante todas las fases del desarrollo del eritroblasto). La más corta de ambas carece del extremo NH,-terminal de 33 aminoácidos, que sí está presente en la versión larga. También se han encontrado varias formas de transcritos de AE1 en el riñón de roedores, dos en ratón y tres en rata. Los genes AE2 y AE3 también producen transcritos alternativos de ARNm. El ARNm de AE2 en el riñón de ratón tiene 4,3 Kb de longitud, mientras que el ARNm de la misma proteína, pero en una línea celular prelinfocitaria, tiene 4,l Kb 4 6 . Ambas secuencias difieren únicamente en la región 5', que no es posteriormente traducida a proteína, lo que hace suponer el uso de promotores alternativos por parte de la RNA polimerasa. Por el contrario, la gran homología entre las regiones 5' no traducidas del ARNm de AE2 en ratón y rata, que llega hasta el 95 %, sugiere que en este caso el control no se efectúa en la transcripción a ARNm, sino en la traducción a proteína. Los ARNm de AE3 de cerebro y corazón de ratón tienen 4,l y 4,3 Kb de longitud, respectivamente 40. También existen diferencias en el ARNm de AE3 en rata, que en cerebro mide 4,4 Kb, mientras que los detectados en corazón y músculo esquelético son algo más pequeños, 3,8 Kb 3 8 . Estas diferencias son debidas al uso de varios promotores, que originan un patrón en la distribución intrones/exones del AE3 cardíaco diferente al del AE3 cerebral. En todo caso, no se conoce el significado fisiológico de un procesamiento específico distinto del mismo gen en cada tejido. Regulación de los intercambiadores Cl-/CO3HIndependientemente del control genético que subyace en la síntesis/degradación de cualquier molécula dentro del organismo, todos los sistemas de transporte reguladores del pHi están bajo el control hormonal y de otras sustancias activas. Y dado que una misma célula necesita mecanismos basificantes y acidificantes en su membrana, existe un control dual Tabla II. Familia de genes y polipéptidos de los intercambiadores Cl-/CO3Hcromosómica AE1 17q21 -qter Localización Tamaño de la Distribución proteína tisular 848-929 aa Eritrocito Túbulo colector Plexo coroideo Riñón Estómago Cerebro Corazón AE2 AE3 AE4 7q35-7q36 ? ? 1.234-1.237 aa 1.227 aa ? ? 548 REGULACION DEL pH INTRACELULAR del pHi, puesto que el mismo efecto puede conseguirse activando sistemas alcalinizantes que inhibiendo los acidificantes, o viceversa 51. Un ejemplo lo constituyen las células Vero (una línea celular de riñón de mono), donde agentes como ésteres de phorbol, forscolina o suero activan al intercambiador Cl-/CO3H--independiente de Na+ (un mecanismo acidificante), a la vez que inhiben al CI-/CO3H--dependiente de Na+ (que alcaliniza el citoplasma) 52. También puede suceder que una misma sustancia tenga efectos dispares en líneas celulares distintas, como el AMPc, que en células de músculo liso vascular inhibe al intercambiador CI - / C O 3H -- i n d e pendiente de Na+, mientras que lo activa en células LLC-PK1 68 y también en células renales del túbulo colector renal 53,54. Hay sustancias, sin embargo, que activan tanto los mecanismos acidificantes como los basificantes. En efecto, en células mesangiales la vasopresina estimula el intercambiador CI-/CO3H--independiente de Na+, al intercambiador Cl-/CO3H-dependiente de Na+ y al intercambiador Na+/H+ 55. El resultado es una acidificación neta del interior celular, pues la vasopresina activa en mayor medida al primer sistema que a los otros dos juntos. Sin embargo, en las células Vero, que poseen idénticos sistemas de transporte de iones que los citados para las células mesangiales, no se ha observado ningún cambio tras incubarlas con vasopresina. En estudios llevados a cabo en la corteza renal de conejos, la endotelina 1 estimula tanto al cotransportador Na+, CO3H- como al intercambiador Na+/H+ 56. La angiotensina II también parece ser un estimulador del mismo transportador de bicarbonato en el túbulo distal de las nefronas 57. Por último, la insulina es capaz de estimular al intercambiador Cl-/CO3H--independiente de Na+ en células de músculo liso de aorta de rata 58. por un H+ intracelular, alcalinizando así el interior de la célula. La fuerza conductora de este transporte es el gradiente de concentración del ion Na+ a través de la membrana plasmática, que es a su vez generado por la bomba de Na+. Por lo tanto, el intercambiador Na+/H+ constituye un sistema de transporte secundario de la célula. El comportamiento cinético del transportador no sólo depende de la concentración extracelular de Na+, sino también del valor del pHi, alcanzando su máximo rendimiento a un pHi=6,0 y tornándose prácticamente inactivo a pHi > 7,4. El intercambiador Na+/H+ es inhibido competitivamente por la amilorida, una droga diurética, así como por sus der i v a d o s 5-amino sustituidos, como la etilisopropilamilorida. Estructura primaria y dominios funcionales La falta de anticuerpos específicos y de ligandos apropiados hacía imposible la purificación de la proteína por afinidad, hasta que en 1989 el grupo de Pouysségur, mediante un ensayo de complementación genética utilizando mutantes carentes de actividad Na+/H+, logró obtener la secuencia nucleotídica y aminoacídica del intercambiador Na+/H+ 61. En un artículo reciente, un grupo de investigadores de la Universidad de Alabama 62 han propuesto una secuencia del ADNc del intercambiador (obtenida de células renales humanas), distinta a la publicada por el grupo francés. La región codificadora en ambas secuencias es idéntica; sin embargo, difieren en su extremo 3' no codificador, siendo bastante más corto el obtenido por los científicos americanos. La secuencia aminoacídica del transportador en humanos consta de 815 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 91,5 KDa (según el modelo propuesto por el grupo americano) 62. Se han asignado dos sitios susceptibles de ser N-glicosilados: Asn75 y Asn-370 61. El perfil hidropático de la proteína según el algoritmo de Kyte y Doolittle 13 muestra que está dividida en dos dominios (fig. 5): dominio NH,terminal o de membrana y dominio COOH-terminal o citoplasmático. El dominio NH,-terminal, con 499 residuos, tiene un marcado carácter hidrofóbico. Al menos doce fragmentos de este dominio se han propuesto como regiones que atraviesan la bicapa lipídica formando estructuras helicoidales. En la proteína de conejo, estas estructuras se corresponden con las uniones entre intrones y exones en el gen 63. El dominio COOH-terminal, que se extiende hasta el final del polipéptido, es altamente hidrofílico y es549 L O S INTERCAMBIADORES Na+/H+ Aspectos generales Murer y cols. fueron los primeros en demostrar la existencia de un proceso de intercambio de Na+ por H+ en células de riñón 59. Más tarde se comprobó que este tipo de transporte está presente en todas las células de vertebrados examinadas 60. Desde entonces, y dada su importante función en la célula, no sólo como sistema regulador del pHi, sino también acoplando las señales extrecelulares a cambios efectivos de pH, este sistema de transporte ha sido uno de los más exhaustivamente estudiados de todos aquellos localizados en la membrana celular. El intercambiador Na+/H+ cataliza el intercambio reversible y electroneutro de un ion Na+ extracelular R. LOPEZ y cols. tá incluido en el citoplasma celular. Tiene carga neta positiva (59 residuos básicos por 48 ácidos) y numerosos sitios que pueden ser fosforilados. La fosforilación de estos residuos modulará la mayor o menor actividad del intercambiador. Se desconoce cuál de los dominios estructurales del intercambiador Na+/H+ realiza el transporte, o si ambos están involucrados. Pero constituye una hipótesis muy atrayente pensar que, al igual que en la familia de los AE, sea la subunidad catalítica aquella que está incluida en la membrana. Experimentos realizados recientemente parecen apoyar esta teoría. En ellos se escindía un fragmento del dominio COOHterminal, no alterándose el pK de la proteína con respecto a su dependencia de la concentración intracelular de H+ 64. Topología en la membrana El modelo topológico del transportador Na+/H+ en la membrana plasmática está basado en los datos obtenidos del perfil hidropático (fig. 5). Aunque la secuencia aminoacídica del transportador no muestra una homología significativa con ninguna otra secuencia publicada -incluyendo su equivalente en bacterias-, su configuración transmembranaria sugiere una fuerte asociación con una familia de proteínas transportadoras, todas localizadas en la membrana de la célula. Entre ellas se encontrarían los intercambiadores Cl-/CO3H- y los transportadores de glucosa dependientes e independientes de Na+. En concreto, la dicotomía estructural segregada en los extremos NH, y COOH-terminal de la proteína recuerda enormemente a la estructura de la proteína AE1. Isoformas del intercambiador Na+/H+ En 1988, Haggerty y cols. 65 descubrieron la existencia de dos subtipos diferentes del intercambiador Na+/H+, caracterizados por su distinta sensibilidad a la inhibición por la amilorida y sus derivados. Estas isoformas fueron designadas como NHE-1 y NHE-2, siendo inequívocamente NHE-1 la primera que había sido secuenciada, aunque posteriormente también se obtuvo la secuencia de NHE-2 60. La distribución de estas dos isoformas del intercambiador Na+/H+ ha sido determinada por medio del diseño de sondas moleculares específicas, con el auxilio de análisis farmacológicos e inmunológicos. En el hombre y en la rata se sabe que el ARN mensajero de NHE-1 se expresa en todos los tejidos examinados, aunque desigualmente 62,67 . Sin embargo, en el conejo, la isoforma NHE-2 está restringida al riñón, intestino y glándula adrenal 66. Por lo tanto, ambas isoformas coexisten en algunos tejidos. Cuando esto ocurre, como en las células epiteliales del intestino y del riñón, la distribución dentro de la membrana plasmática es diferente para los dos subtipos. Mientras que NHE-1 se localiza en la membrana basolateral, NHE-2 está confinada en la zona apical 65. Estos estudios de la expresión de NHE-I y NHE-2 en diferentes animales sugirieron la existencia de otras isoformas del transportador Na+/H+. En efecto, en algunos tejidos en los que el análisis por «Northern blot» se hacía en condiciones de baja astringencia, la sonda molecular dirigida contra NHE-1 se unía a varios mensajeros 67. Desde entonces se han caracterizado, clonado y secuenciado dos nuevas isoformas, NHE-3 y NHE-4 71. Mediante transfección de todos ellos en células mutantes carentes de la actividad Na+/H+, se ha comprobado que son intercambiadores Na+/H+, pues todos restablecían esta actividad transportadora en dichos mutantes. NHE-1 ha sido clonado y secuenciado en el hombre 61, 62, conejo 68-72, rata 67 y en la línea celular porcina LLC-PK1, siendo muy grande la homología entre todos ellos. La secuencia de NHE-2 y NHE-3 se ha obtenido de rata 67, 74, 75 y conejo 63, 66, 76, mientras que N H E - 4 sólo se ha clonado a partir de células de rata 6 7 . Los estudios realizados para buscar homologías entre los diferentes intercambiadores Na+/H+ revelan que, en la rata, los intercambiadores NHE-1, NHE-2, N H E - 3 y NHE-4 muestran aproximadamente un 40 % de homología. Los perfiles hidropáticos de todos ellos son casi idénticos, lo que sugiere una organización transmembranar similar. Al igual que ocurría para los transportadores CI-/CO3H-, existe mayor grado de homología en el dominio de membrana de los i n t e r c a m b i a d o r e s Na+/H+ que en el dominio citoplasmático. Fig. 5.-Esquema de la estructura y disposición del intercambiador Na+/H+ en la membrana plasmática. Se aprecian dos dominios e s t r u c t u r a l e s : el dominio COOH-terminal, orientado hacia el c i t o p l a s m a , y el dominio NH2-terminal, insertado en la membrana. Este último podría ser el que realizara la actividad transportadora del intercambiador. De los 10-12 segmentos con estructura secundaria en a-hélice predichos en el dominio NH2terminal, sólo se representan seis en la figura. 550 REGULACION DEL pH INTRACELULAR Por otra parte, también se ha obtenido la secuencia de los intercambiadores Na+/H+ que son activados por AMP cíclico 69. Este fenómeno, que constituye un caso excepcional dentro de las células eucariotas, ha motivado que estos intercambiadores Na+/H+ reciban el nombre de B-Na+/H+. La prueba de transfección en mutantes realizada con ellos resultó, asimismo, positiva. Estos intercambiadores pueden constituir una subfamilia dentro del gran grupo de los intercambiadores Na+/H+. No se sabe aún si esta subfamilia agrupa otras isoformas o está constituida por un único miembro. pos, de tal forma que el ARNm es procesado de diferente modo, o bien la ARN polimerasa utiliza distintos promotores, o bien las proteínas sufren una desigual modificación tras la traducción, y 2) existen varios genes relacionados y cada uno codifica para una isoforma (al igual que ocurre en la familia de genes de los AE). Aunque no existen evidencias definitivas para tomar partido por una de estas opciones, a partir de experimentos de «Southern blot» realizados en una genoteca genómica de células de conejo, parece muy probable que también exista una familia de genes relacionados para los transportadores NHE. Estructura y localización cromosómica de los genes NHE El gen que codifica para NHE-1 se ha localizado por hibridación in situ en el brazo corto del cromosoma 1 77, y tiene una extensión aproximada de 70 Kb. La región codificadora de este gen está dividida en 12 exones y 11 intrones 78. Algunos exones contienen muchas secuencias que darán lugar a los segmentos transmembranares de la proteína. Esta estruct u r a contrasta con la organización génica de los transportadores CI-/CO3H-, en donde cada exón correspondía a un solo segmento transmembranario. Los estudios realizados en la región 5' no codificadora del gen muestran que en la región del «enhancer»-promotor existen multitud de secuencias reguladoras: cajas TATA, CAAT y CACCC; sitios Sp-1; elementos de respuesta al AMPc; sitios Ap-1 y elementos de respuesta a los glucocorticoides 78. Este gran número de motivos estructurales implicados en el control transcripcional del gen NHE-1 puede ser debido a su expresión ubicua y a la función crítica que lleva a cabo en la célula. Regulación del intercambiador Na+/H+ Junto a su regulación alostérica (que tiene lugar en condiciones de acidificación celular), los efectores de este intercambiador son numerosos; entre ellos se encuentran: hormonas, factores de crecimiento y algunos agentes mitogénicos. La mayoría de ellos actúa aumentando la actividad del sistema, provocando a s í la alcalinización celular con un incremento de pH cercano a 0,4 unidades. Estos efectores difieren ampliamente en el tiempo en el que se manifiesta su efecto; mientras unos actúan en segundos o minutos, otros requieren horas o incluso días para desarrollar su acción 2. La regulación a corto plazo se lleva a cabo mediante cambios en el estado de fosforilacion del intercambiador Na+/H+, a través de segundos mensajeros presentes en la célula. Las rutas que se siguen en la activación del intercambiador son varias: 1) Activación vía proteína kinasa C: la unión del ligando a su receptor específico en la membrana provoca la activación de una proteína G, que a su vez activa a la fosfolipasa C. Esta enzima hidroliza un fosfolípido de membrana, el fosfatidilinositol-4,5 difosfato (PIP2), y como resultado se generan dos nuevas moléculas: e l inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). Este último promueve la activación de la proteína kinasa C, que cambia el estado de fosforilación del transportador Na+/H+, activándolo. 2) Activación dependiente de Ca2+: se ha observado que en algunas células, pero no en todas, el intercambiador se activa tras un aumento en la concentración intracelular de Ca2+. Se ha sugerido que la proteína kinasa dependiente de Ca2+-calmodulina puede mediar en este efecto. Pero además debe existir otra vía de activación dependiente de Ca 2 + que implica a la fosfolipasa A2, como se ha observado en células del músculo liso vascular. 3) Activación vía AMPc: en eritroblastos de trucha, las catecolaminas, uniéndose a receptores tipo B, activan al transportador a través del AMPc. 551 Expresión de los genes NHE Los estudios para conocer la distribución tisular de estas proteínas se han llevado a cabo mediante la técnica de «Northern blot» en genotecas obtenidas de tejidos secretores de estómago, intestino, corazón, riñón, cerebro, útero, etc (tabla III). Se ha comprobado que el mensaje de NHE-1 está presente, en diferentes niveles, en todos los tejidos 62, 67. NHE-2 se expresa abundantemente en riñón y en menor cuantía en intestino y glándula adrenal 74-76. Por su parte, NHE-3 y NHE-4 se localizan en intestino, riñón y est ó m a g o 63, 67. Finalmente, el B-Na+/H+ sólo ha sido hallado en eritroblastos de trucha 69. Esta desigual distribución tiene dos posibles explicaciones: 1) existe un solo gen para todos los subti- R. LOPEZ y cols. Sin embargo, en células renales el efecto que sigue a un incremento en el nivel de AMPc es el contrario, la inhibición del transportador. El mecanismo de esta inhibición es el inverso de aquel que activa al transportador a través de la proteína kinasa C. Y 4) Otras formas de activación a corto plazo: algunos de los efectores del transportador, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), son capaces de activarlo m e d i a n t e otra vía totalmente independiente de la proteína kinasa C o de los niveles internos de Ca 2+ y AMPc. Por lo tanto, debe existir otra ruta m e d i ante la cual se module la actuación del intercambiador Na+/H+. La teoría más atrayente expone que la propia actividad intrínseca tirosina-kinasa del receptor del EGF y quizá del FGF fosforilaría directamente al transportador. Por otro lado, el intercambiador Na+/H+ también está sometido a una regulación a largo plazo, que no implica cambio alguno en su mecanismo de acción, sino en el número o en la velocidad de reciclaje de las moléculas en la membrana 2, 79. Los agentes externos que provocan regulación a largo plazo incluyen tanto moléculas (aldosterona, ácido retinoico, dimetilsulfóxido, glucocorticoides) como situaciones fisiopatológicas especiales (hipertensión, acidosis metabólica, diabetes mellitus, insuficiencia renal) 2,79 . Tabla III. Familia de polipéptidos de los intercambiadores Na+/H+ Localización cromosómica 1p ? NHE-1 NHE-2 Peso de la proteína Distribución tisular 91.506 Da 90.787 Da Todos los tejidos Riñón Intestino Glándula adrenal Intestino Riñón Estómago Eritrocito trucha NHE-3 NHE-4 B-NHE ? ? ? 92.997 Da 81.427 Da 85.128 Da CONCLUSIONES El descubrimiento de que el valor del pHi es determinante en multitud de procesos celulares, así como su implicación en la actividad de hormonas y factores de crecimiento o en la activación de los mecanismos que inducen la división celular, ha motivado un interés creciente por los sistemas que regulan el pH de las células. Los profundos estudios fisiológicos y moleculares realizados sobre los intercambiadores C l -/ C O 3H - y Na+/H+ de la membrana plasmática han concluido con el descubrimiento y caracterización de sendas familias de proteínas. La familia del intercambiador Cl-/CO3 H- está constituida por tres miembros AEl, AE2 y AE3 (aunque se sospecha la existencia de un cuarto miembro, AE4), todas ellas codificadas por genes distintos, aunque evolutivamente muy próximos. La familia del intercambiador Na+/H+ t a m b i é n e s n u m e r o s a : NHE-1, NHE-2, NHE-3 y NHE-4. Sin embargo, todavía no se dispone de datos definitivos para afirmar que estas cuatro proteínas están codificadas por genes distintos. Estas proteínas tienen un patrón de distribución diferente en los tejidos examinados, siendo mayoritario en epitelios secretores, tejidos excitables y células transportadoras de gases. En todos ellos, la actividad 552 de estos intercambiadores está modulada, aparte de por los propios mecanismos de control genético y p o r la propia homeostasis ácido-base celular, por hormonas y sustancias activas que tienen efectos dispares según sea el sistema de transporte diana y el tejido en el que se exprese. Los datos recogidos del análisis hidropático y molecular han permitido inferir datos sobre la estructura y disposición en la membrana de estas proteínas. El modelo topológico es muy similar en ambos intercambiadores y coincide también con otras proteínas que comparten características funcionales. Esto, empero, no permite suponer la existencia de una superfamilia que integre a todas las proteínas transportadoras de membrana. Bibliografía 1. Boron WF: Cellular buffering and intracellular pH. En The regulation of acid-base balance. DW Seldin, G Giebisch (eds). Raven Press: 33-56. Nueva York, 1989. 2. Frelin C, Vigne P, Ladoux A y Lazdunski M: The regulation of the intracellular pH in cells from vertebrates. Eur J Biochem 174:3- 14, 1988. 3. Fairbanks J, Steck TL y Wallach DFH: Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocytes membrane. Biochemistry 10:2606-2616, 1971. 4. 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