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Vol. 27. Núm. 5.octubre 2007
Páginas 527-659
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ANÁLISIS DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES EN HEMODIAFILTRACION EN LINEA
Stress oxidative analysis in patients on hemodiafiltration on-line
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Eduardo Torregrosa de Juan, Julio Hernández Jaras, Juan Sastre Belloch, Ramón Pons Prades, Hector García Calvo, Consuelo Calvo Gordo, Mª
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Los pacientes afectos de enfermedad renal crónica presentan una elevada morbimortalidad debido a enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, la elevada presencia de estas enfermedades no puede explicarse únicamente por los factores de riesgo tradicionales. En la actualidad, se considera la existencia de factores de riesgo emergentes, entre los que se encuentra el estrés oxidativo. Además se sabe que cuando reciben tratamiento con hemodiálisis, se ven sometidos a un estrés oxidativo adicional. El objetivo de este trabajo ha sido analizar y comparar el grado de estrés oxidativo en dos grupos de pacientes urémicos dializados con diferentes técnicas dialíticas: a. Hemodiafiltración on-line 3 veces/semana (HDFOL). b. Hemodiafiltración on-line diaria 6 veces semana(HDFOLD). Se estudiaron 9 pacientes afectos de enfermedad renal crónica terminal (Estadio 5), todos ellos varones con una edad media de 72,5 ± 6 años. Cinco pacientes pertenecían al grupo de HDFOLD y cuatro al grupo de HDFOL tres veces por semana. Los pacientes del grupo de HDF-OLD presentaban las siguientes concentraciones de glutatión reducido (GSH) en sangre, pre-diálisis de 742 ± 153 nmol/ml y post-diálisis de 878 ± 223, sin detectarse diferencias significativas entre ambos. Las concentraciones pre y post-diálisis de glutatión oxidado (GSSG) en sangre eran de 34 ± 14 nmol/ml y 137 ± 74 nmol/ml respectivamente (p < 0,03). Los cocientes GSSG/GSH obtenidos fueron: pre-diálisis de 58 ± 10 y post-diálisis 169 ± 65, con diferencias entre ambos valores (p < 0,03). Los pacientes del grupo HDF-OL 3 veces/semana también presentaron un incremento significativo de la concentración de GSSG y del ratio GSSG/GSH tras la sesión de diálisis, de 99 ± 45 nmol/ml a 179 ± 66 nmol/ml y de 161 ± 99 y a 337 ± 143, respectivamente (p < 0,05). La mediana de los valores de proteína C reactiva eran de 4,12 g/l en el grupo HDFOLD y 7,7 g/l en grupo de HDFOL (p < 0,05). No encontramos diferencias estadisticas en la actividad de la xantina oxidasa entre grupos ni tras la sesión de hemodiálisis. En resumen, podemos concluir que los pacientes afectos de enfermedad renal crónica terminal que reciben tratamiento sustitutivo se encuentran sometidos a un estrés oxidativo adicional, como muestra el incremento en los ratios GSSG/GSH en ambos grupos. Sin embargo los pacientes en el grupo HDFOLD presentan cocientes GSSG/GSH post-hemodiálisis y valores de PCR inferiores, lo que sugiere que la hemodiálisis diaria podría mejorar la depuración de medidores inflamatorios.
Palabras clave:
Hemodiafiltración on
line, estrtés oxidativo, glutation, cociente GSSG/GSH, xantine oxidasa
Summary: Patients with chronic renal disease have a very high mortality due to cardiovascular disease. However, the traditional risk factors are not the only one explanation. Nowadays, there are new risk factors becoming, and one of these is the oxidative stress. Besides today we know that when these patients receive haemodialysis are being exposed to an additional oxidative stress. The aim of this study was to mesure and to compare the degree of oxidative stress in two groups of patients on different dialysis techniques: a)On-Line Haemodiafiltration three times / week (OL-HDF). b)Daily Om-Line haemodiafiltration ( six times / week ) ( dOL-HDF) We studied 9 patients with chronic renal disease stage 5 on hemodialysis. They all were men, with a medium age of 72,5 ± 6 years. Five patiens were on dOL-HDFand four on tOL-HDF. Glutathione (GSH) concentration of patients on dOL-HDF before dialysis was 742± 153 nmol/ml and post-dialysis de 878± 223. Blood GSSG concentration before and after dialysis was 34± 14 nmol/ml y 137± 74 nmol/ml (p < 0,03). GSSG/GSH ratio pre-dialysis was 58±10 and post-dialysis 169±65 ( p < 0,03). In OL-HDF group GSSG concentration and the ratio GSSG/GSH also increased in a significative way from 99±45 nmol/ml to 179±66 nmol/ml, and from 161± 99 to 337±143 ( p <0 05 we also found differences in pcr concentrations between both groups 3 1 4 g l dol-hdf and 8 75 5 hdf ol p < 0,05). We did not find differences between xatine-oxidase activity before and after hemodialysis and between groups. In conclusion, patient with terminal chronic renal disease on OL-HDF receive an additional load of oxidative stress, as the increase in GSSG/GSH ratio in both groups shows. However patients on dHDF-OL shows low ratios GSSG/GSH post-hemodialysis and low pCR concentrations, and maybe this could be explained because daily on line haemodiafiltration improves purification of inflammatory mediators. Clue words: Hemodialysis, oxidative stress, glutathione, gssg/gsh ratio, xantine oxidasa
Keywords:
On-LIne Hemodiafiltration, oxidative stress, glutathione, GSSG/GSH ratio, xantine oxidasa
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Introducción:

La  insuficiencia renal crónica  se asocia con los factores clásicos de riesgo cardiovascular, así como con factores derivados de  la enfermedad en sí, como la expansión crónica de volumen,  trastornos del metabolismo del calcio y fósforo, la hiperhomocisteinemia, y un estado inflamatorio permanente asociado con  estrés oxidativo. Estos factores no clásicos  están alcanzando una gran importancia,  ya que podrían ser en parte los responsables de la alta incidencia de eventos cardiovasculares en estos enfermos.

Los pacientes con enfermedad renal crónica  se caracterizan por presentar una alteración del equilibrio entre las sustancias pro-oxidantes y los factores antioxidantes (1).

Las células están defendidas frente a la oxidación por una compleja serie de  antioxidantes. El estrés oxidativo aparece cuando existe una alteración del equilibrio entre las sustancias prooxidantes y antioxidantes a favor de las primeras (2).

Las principales sustancias oxidantes en los sistemas biológicos son las especies reactivas del oxígeno (ROS), entre las que destacan anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) , el radical hidroxilo (OH-), el oxígeno singlete, y el acido hipocloroso (3).

El estrés oxidativo se considera un factor etiológico importante en muchos procesos patológicos del ser humano. Se  ha relacionado con la carcinogénesis,  la arteriosclerosis, la  hipertensión arterial, las enfermedades  neurodegenerativas, la insuficiencia renal, el  síndrome de inmunodeficiencia adquirida y las complicaciones a largo plazo de la diabetes.

Actualmente existen parámetros fiables y técnicas adecuadas para cuantificar el estrés oxidativo.  Entre los más utilizados se encuentran (5): Glutatión reducido (GSH), Glutatión oxidado (GSSG), niveles de malondialdehído (MDA), la 8-OH-desoxi-guanosina, la  xantina

oxidasa (X.O) (4, 5, 6)

En los pacientes afectos de enfermedad renal crónica terminal,  se sabe que cuando reciben tratamiento con hemodiálisis, se ven sometidos a un estrés oxidativo adicional. En este sentido, cada vez existen más datos que implican a los ROS  en el desarrollo de las complicaciones de la hemodiálisis a largo plazo como la amiloidosis, la aterosclerosis, y en general las enfermedades cardiovasculares (7).

Como posibles inductores  de estrés oxidativo  en los pacientes en hemodiálisis se han señalado la edad, el tiempo transcurrido en diálisis, la diabetes mellitus,  la inflamación, la hemoincompatibilidad de las membranas de diálisis, la pérdida difusiva de sustancias antioxidantes como vitaminas  (ácido ascórbico, tocoferoles), el uso de tratamientos complementarios como hierro intravenoso.(8, 9, 10).

Se han propuesto diversas estrategias  para minimizar el estrés oxidativo durante la diálisis y tratar de prevenir los efectos derivados de él. Por ejemplo, el uso de membranas biocompatibles y  líquidos de diálisis ultrapuros. El empleo de membranas que consiguieran  eliminar o adsorber del plasma los mediadores de la inflamación, la hemolipodiálisis, una nueva técnica que usa líquido de diálisis que contiene vit C, y liposomas con  vitamina E, así como variar la frecuencia de sesiones de diálisis semanales (11, 12, 13, 14)

Objetivo:

El objetivo de este trabajo ha sido analizar y comparar el grado de estrés oxidativo  en dos grupos de pacientes urémicos dializados con hemodiafiltración en línea, con diferencia frecuencia:

a.Hemodiafiltración on-line 3 veces / semana (HDFOL).

b.Hemodiafiltración  on-line diaria 6 veces/semana (HDFOLD).

Material y métodos:

Se incluyeron  en el estudio 9 pacientes  que cumplían los siguientes criterios:

  • Estar en tratamiento sustitutivo al menos durante seis meses.
  • Edad comprendida entre 35-85 años.
  • Sexo varón con objeto de evitar la variabilidad intersexo
  • Niveles de ferritina <600 pg/ml y Hb > 10 g/dl.
  • Diuresis residual inferior a 300 ml/min.

Los criterios de exclusión fueron los siguientes: Hiperparatiroidismo severo (PTH > 500), enfermedad inflamatoria o infecciosa sistémica en fase activa., enfermedad neoplásica no curada, tratamiento inmunosupresor.

La edad media de los pacientes fue de 72,5 ± 6 años.

Cinco pacientes pertenecían al grupo de HDFOL diaria, y cuatro al grupo de HDFOL tres veces por semana.

Los pacientes en el grupo de HDFOLD se dializaban 6 veces /semana, un promedio de 143± 9 minutos por sesión, con un volumen de convección y subsiguiente reinfusión post-dilución de 15,4 litros/sesión. El tiempo de permanencia en programa de hemodiálisis era 14 ± 0,8 años.

Los pacientes de  HDFOL tres veces por semana se dializaban un promedio de 262±15 min por sesión, con un volumen de convección y subsiguiente reinfusión post-dilución de 22 litros/sesión, y el tiempo en hemodiálisis de 9±5 años.

Las etiologías de la enfermedad renal crónica  en los diferentes pacientes  fueron: Nefropatía vascular 5 casos, poliquistosis renal 2 casos y nefropatía diabética y desconocida en 1 caso.

La composición del líquido de diálisis era la siguiente: Sodio 140 meq/l, potasio 3 meq/l,  calcio 3 meq/l, magnesio 1,5 meq/l, cloro 117 meq/l, bicarbonato 30 meq/l, ácido acético 2 meq/l. Los dializadores empleados  eran de polisulfona de alta permeabilidad de 1,89 m²  en los 5 pacientes de HDF OL diaria, de  2 m² en 3 pacientes de HDF OL  tres veces por semana y  de 1,89 m² en el restante.

Todos los pacientes recibían durante la diálisis una perfusión de hierro sacarosa y al final de la hemodiálisis se les adminitraba eritropoyetina vía intravenosa.Así mismo, todos los pacientes recibían de manera crónica suplementos vitamínicos post-diálisis tres veces por semana con vit B1, B6, B12, H , 200 mg de vitamina C y ácido fólico.

Extracción de las Muestras :

Se extrajeron 20-25 ml de sangre de la rama arterial del paciente en tubos anticoagulados con EDTA (tapón morado), antes e inmediatamente después de la sesión de diálisis. Las muestras inmediatamente fueron desproteinizadas para la determinación de glutatión oxidado y reducido (ver métodos). Tras ser desproteinizadas, se procedía a ultracentrifugar las muestras a 15000 g durante 15 minutos, y una vez centrifugadas los sobrenadantes se almacenaban en un congelador a -40ºC.

 

Métodos:

Se determinaron las concentraciones plasmáticas de glutatión oxidado, reducido, y la actividad de la xantina oxidasa.

Para determinar el glutatión reducido se empleó el método   de la glutation-S-transferasa de Brigelius, pero modificado (15). Para la determinación de glutation oxidado (GSSG) se utilizó el método de Asensi y col. (16). Con respecto a la actividad de la xantina oxidasa, para su determinación se empleó el Kit (A-22182) Amplex® rojo Xantina/ Xantina oxidasa. Para comparar  las dosis de diálisis empleamos la fórmula del ¿eKR¿ de Casino, o equivalente del aclaramiento renal de urea, que nos permite cuantificar el aclaramiento total de urea (renal y dialítico) en función del tiempo para cualquier tipo de diálisis, independientemente de la  duración del mismo (17). 

Los pacientes fueron informados   y  firmaron un consentimiento informado para participar en el mismo.

Análisis estadístico:

 Los resultados se expresan como la media aritmética ± desviación típica.   Para la comparación de parámetros cuantitativos se ha empleado el análisis de la varianza (ANOVA) en primer lugar y la t de Student. La correlación entre variable numéricas se determinó por el método de Pearson. Se consideró significativo una p< 0,05.  

Resultados:

Los pacientes del grupo de HDF-OLD presentaban una concentración de glutatión reducido en sangre de 742± 153 y de 878± 223 nmol/ml pre y postdiálisis, respectivamente (n.s.).

Las concentraciones pre y post-diálisis de glutatión oxidado en sangre eran de 34± 14 nmol/ml y 137±74 nmol/ml respectivamente, siendo las diferencias entre ambos significativas (p< 0,03). Los cocientes GSSG/GSH obtenidos fueron de 58±10 nmol/ml y 169±65 nmol/ml pre y post-diálisis, respectivamente (p< 0,03) (Figura 1).

Por su parte, los pacientes del grupo HDFOL 3 veces/semana presentaban  pre-diálisis una concentración de GSH de 723±344 nmol/ml y tras la sesión de 564±233 nmol/ml (n.s.).

Con respecto al glutatión oxidado las concentraciones pre y post-diálisis fueron de 99±45 nmol/ml y 179±66 nmol/ml respectivamente (p<0,05). El cociente GGSG/GSH obtenido  pre-diálisis fue de  161± 99 y  post-diálisis de 337±143 (p<0,05) (Figura 2).

No apreciamos diferencias significativas entre grupos con respecto a la concentración de GSSG pre y post-diálisis.

Se apreció una tendencia en el grupo de HDFOLD a mostrar cocientes GGSG/GSH inferiores post-diálisis (p=0,05).

Con respecto a la actividad de xantina oxidasa los valores pre-diálisis fueron de 0,36±0,1 mU/ml y 0,52±0,24 mU/ml en  los grupos HDFOLD y HDFOL tres veces/semana, respectivamente. La actividad post-diálisis de la enzima fue de 0,33±0,8 mU/ml y 0,34±0,05 mU/ml, respectivamente. (Tabla I)

No se apreciaron diferencias significativas entre ambos grupos en ninguno de los siguientes parámetros: hemoglobina (Hb), urea, creatinina,  albúmina (alb), proteínas totales (Pt), PTH, ferritina, índice de saturación de transferrina (IST) y ácido úrico (Tabla II).

Los pacientes del grupo de HDFOLD presentaban un eKR de 28,1± 2,3 ml/min y los del grupo de HDFOL 3 veces / semana, de 18,7±4,3 ml/min (p<0,05).

El valor mediana de proteína C reactiva eran de 4,12 g/l en HDFOLD y de 7,7g/l en grupo de HDFOL 3 veces/semana (p< 0.05)  (Fig 3).

Las dosis de hierro y EPO administradas fueron de 10 mg/ sesión y 2000 UI semanales en el grupo HDFOLD, y de 12,5 mg/ sesión y 5500 UI/ semanales en el grupo de HDFOL.  No existían diferencias significativas entre grupos con respecto al tratamiento con hierro, pero si en relación con las dosis de eritropoyetina administradas (p< 0,05).

Las dosis de heparina (Nandroparina sódica) fueron de 0,35±0,15 ml/sesión en el grupo de diaria y  0,5±0,1 ml/sesión en el grupo de días alternos (p< 0,05).

Se apreció una correlación significativa entre la concentración de proteína C reactiva y  el cociente post-diálisis GSSG/GSH (r= 0,65, p= 0,02)  (Figura 4).

 

Discusión:

Los niveles de GSSG en sangre y el cociente GSSG/GSH son índices de estrés oxidativo en diferentes situaciones fisiológicas y patológicas. Además el glutation en sangre refleja el estado del glutation en otros tejidos menos accesibles.

Los pacientes afectos de enfermedad renal crónica términal presentan valores disminuidos de GSH en sangre. Esto ya ha sido demostrado en diversos trabajos previos, aunque en la mayoría de ellos la determinación de GSH se realizaba a nivel eritrocitario. (18,19, 20). Por el contrario, la concentración de GSSG se encuentra elevada con respecto a la población normal.

En nuestros pacientes, no apreciamos diferencias significativas en las concentraciones de GSH trás la sesión de hemodiálisis en ninguno de los 2 grupos estudiados. En estudios previos existe controversia en relación con los cambios en la concentración de GSH tras la sesión de hemodiálisis (21).

Con respecto al GSSG, se observó un incremento significativo de la concentración de glutatión oxidado tras la sesión de hemodiálisis. No apreciándose diferencias significativas entre grupos con respecto a la concentración de GSSG pre y post-diálisis.

Este incremento en la concentración de glutation oxidado pone de manifiesto que  la hemodiálisis provoca un incremento del estrés oxidativo, confirmando lo indicado en trabajos previos (11, 22, 23).

De igual manera, cuando analizamos el cociente GSSG/GSH, uno de los indicadores más sensibles de estrés oxidativo, pudimos comprobar que tras la sesión de hemodiálisis el cociente se  incrementaba de manera significativa con ambas técnicas de hemodiálisis (18).

En el grupo de HDFOLD se apreciaba una tendencia a presentar cocientes GSSG/GSH más bajos, lo que sugeriría que el estrés oxidativo de los pacientes sometidos a   esta técnica es inferior a la HDFOL. Los valores de PCR inferiores en los pacientes en HDFOLD avalan esta hipótesis. Estos hallazgos podrían justificarse por el hecho de que estos pacientes presentan mejores dosis de diálisis, mejor depuración de moléculas de mediano peso molecular, y una menor sobrecarga crónica de volumen, factores todos ellos implicados en la respuesta inflamatoria crónica encontrada en estos pacientes. Turi y col. demostraron que la reducción en la capacidad antioxidante y en el contenido de GSH   era el resultado de la acumulación de metabolitos de los glóbulos rojos y toxinas urémicas. Esta situación no mejoraba tras la hemodiálisis   porque la mayoría de ellas no eran dializables (24). Nuestros dos grupos de pacientes estaban sometidos a hemodiafiltración en línea, aunque los pacientes del grupo de 3 sesiones por semana recibían mayor número de litros de convección en comparación con los del grupo de diaria.

En trabajos previos se ha comprobado que el empleo de técnicas con alto volumen convectivo  provoca la pérdida importante de vitaminas hidrosolubles, entre ellas la vitamina C, uno de los principales antioxidantes  (25).

Con respecto a la eritropoyetina, los pacientes del grupo de hemodiálisis diaria recibían menores dosis EPO (2000 UI/semanales). Estos menores requerimientos de eritropoyetina podrían estar relacionados, como ya hemos comentado, con una mejor dosis de diálisis y también con una menor exposición al estrés oxidativo objetivada en este grupo.

En este sentido, Locatelli y col. sugieren que el suplemento con antioxidantes en estos pacientes podría mejorar la anemia  y disminuir los requerimientos de EPO (1).

El grupo de HDFOLD recibía una mayor dosis de diálisis (eKR) que el grupo de HDFOL  (p=0,0009) y como se ha mencionado previamente, este factor podría explicar los menores requerimientos de eritropoyetina, cocientes GSSG/GSH más reducidos y a nivel inflamatorio, concentraciones de  PCR menores. En relación con esto, se puede apreciar una correlación significativa entre los niveles de PCR y  el cociente post-diálisis GSSG/GSH, es decir a mayor concentración de PCR, mayores cocientes. En general podríamos decir que los pacientes del grupo HDFOLD presentaban un menor estado inflamatorio.

Obviamente, el escaso número de pacientes incluidos en el trabajo, el hecho de que los pacientes no fueran sus propios controles y la variabilidad de las dos muestras poblacionales son grandes limitaciones del  mismo, pero pese a todo la tendencia mostrada en este pequeño grupo de HDFOLD es a presentar una mejoría en marcadores tan sensibles de estrés oxidativo como es el cociente GSSG/GSH. Este hecho junto con otros ya ampliamente demostrados, como el mejor control de la hipertensión arterial, de la anemia, de la osteodistrofia nos hace ver otra probable ventaja de la HDFOLD.

 La actividad de la xantina oxidasa, enzima  generadora de anión superóxido, se encuentra elevada en el plasma y en el hígado de pacientes con patologías asociadas a estrés oxidativo.

La inhibición de la xantina oxidasa ha demostrado ser eficaz para mejorar la disfunción endotelial  en pacientes con hipercolesterolemia. Recientemente, Butler y col. han demostrado que el alopurinol protege contra la disfunción endotelial en pacientes diabéticos con hipertensión arterial leve (26). También se ha comprobado que  los pacientes con sepsis presentan una activación de la xantina oxidasa que se relaciona con una elevada concentración de radicales libres (27). No hemos encontrado diferencias significativas en los valores de xantina oxidasa tanto antes como después de la diálisis. Aunque al determinar la actividad pre y pos-diálisis de esta enzima comprobamos en ambos grupos una tendencia hacia un descenso no significativo.

En resumen, podemos concluir  que los pacientes afectos de enfermedad renal crónica terminal  que reciben tratamiento sustitutivo se encuentran sometidos a un estrés oxidativo adicional. La hemodiafiltración en línea realizada de manera diaria mejora el estrés oxidativo. Sin embargo,  aún hay mucho que trabajar  con el fin de encontrar un técnica sustitutiva lo más fisiológica posible. Quizás la hemodiálisis diaria, como vemos en este trabajo, sea una posible opción de futuro.

 

 

Este estudio ha  sido llevado a cabo en parte, por una beca de la Fundación  de la Comunidad Valenciana ¿Hospital Provincial de Castellón¿ y con la colaboración del Departamento de Fisiología de la Universidad de Valencia.

 

 

 

  

 

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TABLAS:

 

 

Tabla I- GSH, GSSG, GSSG/GSH  y actividad de la  xantina oxidasa  pre y post-diálisis  en HDFOLD  y HDF OL tres veces/ semana.

 

GSH(nmol/ml)

GSSG(nmol/ml)

GSSG/ GSH

Xantina Oxidasa (mU/ml)

HDFOLD

 

 

 

 

Predialisis

741,5± 153,47

34± 14

58±10

0,36±0,1

Post-dialisis

878± 227

138± 74*

169±65**

0,33±0,7

HDFOL 

 

 

 

 

Predialisis

723±344

99± 45

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