04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 158 NEFROLOGÍA. Vol. XXIV. Número 2. 2004 Alteraciones del pH intracelular en fibroblastos peritoneales inducida por factores implicados en la esclerosis peritoneal M. Soria 1, J. Arrieta 2, I. Ugarte 2, I. Moina 2 M. Guerra1 y J. Escanero 3 1 Dpto. Bioquímica. Universidad de Zaragoza. 2Servicio de Nefrología. Hospital de Basurto. Bilbao. 3Dpto. Farmacología y Fisiología. Universidad de Zaragoza. 3Departamento Farmacología y Fisiología. Universidad de Zaragoza. RESUMEN La esclerosis peritoneal encapsulante se ha asociado epidemiológicamente al empleo de acetato, líquidos hipertónicos o desinfectantes en la Diálisis Peritoneal. Los mecanismos fisiopatológicos por los que estos agentes inducen la proliferación fibrosa no han sido completamente explicados. En un modelo experimental de fibroblastos peritoneales en cultivo, estudiamos la evolución del pH intracelular y de la actividad del intercambiador Na+/H+ bajo perfusión con líquidos similares a los de Diálisis Peritoneal conteniendo acetato, lactato, glucosa hipertónica o interleukina 1 en presencia de HCO3/CO2 a pH 7,4. Resultados: El acetato produjo una intensa acidosis intracelular (6,80 ± 0,08), superior a la del lactato (6,95 ± 0,07), con recuperación del pH basal en unos 30'. La IL-1 produjo un descenso (7,10 ± 0,03) asociado a la extrusión de Ca2+ del citosol por la Ca-ATPasa, con recuperación en 5 minutos. La ausencia de Na extracelular o el amiloride inhibieron totalmente la recuperación del pHi en todos los casos. La glucosa hipertónica aumentó el pHi (7,31 ± 0,06) con recuperación a los 10 minutos. La elevación también se inhibió con Na = 0 o amiloride. La actividad del intercambiador Na+/H+ se elevó hasta un 58%, persistiendo elevada minutos después de la recuperación del pHi basal. En conclusión, los agentes implicados en la esclerosis peritoneal secundaria a diálisis peritoneal estimulan el intercambiador sodio-protones por diferentes mecanismos. Esta activación podría constituir parte de una señal implicada en la fibrosis peritoneal. Palabras clave: Esclerosis peritoneal. Fisiopatología. Fibroblastos en cultivo. Intercambiador Na/H. PH intracelular. Diálisis peritoneal. Recibido: 30-IX-2003. En versión definitiva: 26-XII-2003. Aceptado: 3-I-2004. Correspondencia: Dr. Javier Arrieta Lezama Servicio de Nefrología Hospital de Basurto Avda. de Montevideo, 18 48013 Bilbao E-mail: jarrietal@senefro.org 158 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 159 EFECTOS INTRACELULARES DE FACTORES DE ESCLEROSIS PERITONEAL INTRACELLULAR PH CHANGES INDUCED BY SCLEROSING AGENTS IN PERITONEAL FIBROBLASTS SUMMARY Sclerosing encapsulating peritonitis secondary to peritoneal dialysis has been associated to acetate-containing dialysis fluids, hypertonic glucose and disinfectants. Physiopathologic mechanisms of fibrotic proliferation that implicate those agents are not totally explained. With an experimental approach using cultured peritoneal fibroblasts, we have studied intracellular pH changes and Na+/H+ antiporter activity under cells perfusion with peritoneal dialysis liquids containing acetate, lactate, hypertonic glucose and interleukin-1. All experiments were performed at extracellular pH 7,4 and physiologic HCO3/CO2 concentration. Results: 35 mM acetate produced a huge intracellular acidosis (ipH = 6.80 ± 0.08). Lactate effect was less important (6.95 ± 0.07), with a slow ipH recovery in about 30 min in both cases. IL-1, 10-6 M also reduced ipH to 7.10 ± 0.03. Acidosis was linked to Ca2+ outflow via Ca/H exchange and was blocked with Cd 20 nM. Extracellular Na = 0 and amiloride totally inhibited ipH recovery after acetate, lactate, or interleukin-induced acidosis. Hypertonic glucose perfusion increased ipH (7.31 ± 0.06) for 5-7 min. This increase was also inhibited by amiloride or extracellular Na absence. Na+/H+ exchanger activity increased to 58%, and kept activated after ipH recovery. In conclusion, acetate, hypertonic glucose and IL-1 showed the common effect of stimulating the sodium-proton exchanger by different mechanisms, giving a possibility of potentiation. Activated Na+/H+ exchanger may act as a signal-transduction increasing fibroblast proliferation and explaining the cellular mechanism of sclerosing peritonitis. Key words: Sclerosing peritonitis. Physiopathology. Cultured fibroblasts. Na/H antiporter. Intracellular pH. Peritoneal dialysis. INTRODUCCIÓN La esclerosis peritoneal encapsulante, conocida también como peritonitis esclerosante obstructiva o fibroplástica, es una entidad clínica descrita ya en los años setenta en pacientes sin alteraciones renales y relacionada con el uso de un bloqueante adrenérgico 1, y que a partir de 1980 fue observada en pacientes sometidos a diálisis peritoneal. Hoy está considerada como una complicación severa del tratamiento a largo plazo con diálisis peritoneal, especialmente con DPCA, aunque también se han descrito casos con diálisis peritoneal intermitente 2, 3; su pronóstico es malo y los pacientes afectos deben ser transferidos a hemodiálisis debido a la pérdida de la capacidad de ultrafiltración de su peritoneo. Una vez avanzado el proceso, aunque se transfiera a los pacientes a hemodiálisis, o reciban un trasplante renal, no se observa remisión de la sintomatología, que conduce a veces a la obstrucción i n t e s t i n a l 4, 5. La esclerosis peritoneal (EP) es un proceso inflamatorio que provoca la transformación de la membrana peritoneal en un grueso tejido fibroso que rodea y comprime las asas intestinales 6-8. Inicialmente se observa una pérdida generalizada del mesotelio, que es reemplazado por una banda acelular de colágeno hialinizado, con infiltrados de células mononucleares y neovasos. Superficialmente se pueden ver depósitos de fibrina y fibroblastos escasos. Por debajo de la capa de tejido fibroso hialinizado se desarrolla una fibrosis de la serosa subyacente que afecta a la capa superficial de la musculatura lisa de la pared intestinal, pudiendo llegar al plexo nervioso mesentérico. En esta fase pueden aparecer síntomas de obstrucción intestinal. En estadios finales el músculo longitudinal liso de la pared del intestino puede llegar a desaparecer. Clínicamente se inicia con una disminución de la capacidad de ultrafiltración, asociada a un aumento de la permeabilidad de la membrana que hace que el líquido pierda su capacidad osmótica 9. Cuando ya existe 159 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 160 M. SORIA y cols. proliferación fibrosa, se objetiva una disminución de la capacidad de diálisis de la membrana peritoneal 9. De forma más tardía, la invasión de la musculatura lisa intestinal y el plexo mientérico ocasiona disminución de los movimientos peristálticos, con suboclusión intermitente a nivel del íleon, hasta llegar a un cuadro de obstrucción intestinal 4. En las diferentes series publicadas, nos encontramos con variaciones de incidencia entre un 1,4% de los estudios franceses 3 a un 24% en series australianas 10. Destaca el hecho curioso de que la mayoría de los casos de EP asociados con DPCA han ocurrido en Europa y Australia, mientras que los asociados a DPI se distribuyen por todo el mundo, lo que habla a favor de la influencia que pueden tener las distintas técnicas de diálisis en la aparición de la enfermedad 8. No se han descrito diferencias por edad ni de sexo, aunque si parece existir una correlación con el tiempo de estancia en diálisis peritoneal 11, 12. Se ha implicado como factor de proliferación fibroblástica, a la Interleukina 1, inducida por las infecciones 13, las endotoxinas procedentes de los filtros bacterianos 14, o incluso a la irritación química por partículas de plástico 15-17. La hiperosmolaridad de la solución dializante parece correlacionada clínicamente con casos leves de fibrosis peritoneal, además de haber sido capaz de inducirla en estudios experimentales con ratas 18. La mayor incidencia de casos de EP en Europa y Australia en cuyos protocolos de diálisis se usaba el acetato, en lugar del lactato (más usado en EE.UU.), indujo a pensar que éste era el principal factor causal de la enfermedad 3. Por otra parte, se han descrito casos de EP en pacientes que nunca han utilizado acetato en el dializante 9. Los primeros casos de EP fueron atribuidos al uso de formaldehído en la desinfección del catéter 19. Las soluciones antisépticas a base de povidona yodada o de clorexidina, también han demostrado ser capaces de producir adherencias y engrosamiento peritoneal al introducirlas intraperitonealmente en ratas 20,2 1. En estudios previos describimos el efecto del acetato y de la Interleukina 1 en los cambios de cationes libres intracelulares en los fibroblastos 22, 23, esbozando un mecanismo global que integrara a los diferentes agentes implicados en la EP. La alteración del pH intracelular ha sido relacionada con la señal de proliferación celular mediante el estímulo del intercambiador Na+/H+ 24, que en condiciones de presencia de bicarbonato/CO2 regula fundamentalmente el volumen celular 24, 31. El objetivo de este trabajo es contribuir a aclarar los mecanismos fisiopatológicos por los que el ace160 tato, la hiperosmolaridad y la IL-1 inducen o facilitan la señal inicial de la proliferación fibroblástica. La pérdida de capacidad dializante del peritoneo, y en los casos más avanzados la Peritonitis Esclerosante, serían la consecuencia de la acción combinada o sostenida de probablemente varios de los agentes epidemiológicamente implicados en esta entidad. MATERIAL Y MÉTODOS Cultivo de fibroblastos En ratas Wistar de entre 150 y 200 g, anestesiadas con pentobarbital se disecó el mesocólon, obteniendo fragmentos de peritoneo visceral estériles, que se introdujeron en una placa estéril con PBS a pH 7.4, a temperatura ambiente. Tras eliminar manualmente la mayor parte de la grasa, se incubaron en PBS con colagenasa, 750 mg/ml, durante 15 min a 37° C. A continuación, se eliminó el mesotelio por frotamiento con el lado romo de unas pinzas de microdisección y lavados con PBS, y el tejido restante se seccionó en fragmentos 25. Las células obtenidas del explante de peritoneo se resuspendieron en medio del cultivo (Dulbecco-Modified-Eagle, Sigma), suplementado con nutriente Ham F-12, glutamina 2 mM, bicarbonato 22 mM, suero de ternera fetal (Hazelton FBS) al 20%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml y anfotericina B 250 ng/ml 26 y se colocaron sobre el fondo de placas de Petri estériles de 60 mm de diámetro, cubiertas con cubreobjetos estériles de 25 × 35 mm (Weaton Glass). Las placas fueron incubadas en estufa, con atmósfera húmeda y CO2 al 5%, a 37° C donde permanecieron 10 días, cambiando el medio de cultivo dos veces por semana, hasta que el suelo de la placa quedaba totalmente recubierto por los fibroblastos en monocapa confluyente (4-6 semanas). Del cultivo primario se resembraban subcultivos tras tripsinización (Tripsina-EDTA 0,25%, 5 minutos), pasándolos a nuevas placas de Petri. En el segundo cultivo se comprobaba que las células eran fibroblastos mediante tinción con Vimentina (Dako). Se resembraban en placas con cubreobjetos de vidrio de 9 × 35 mm adheridos al fondo por un extremo, de forma que permitieran el crecimiento de fibroblastos por ambas caras. En ningún caso se mezclaron células de dos animales diferentes. Los resultados fueron homogéneos en los subcultivos utilizados. Por encima de 20 pases de cultivo se observaba una menor adherencia y un Ca2+i algo más elevado, por lo que se decidió limitar los subcultivos para los experimentos entre el 4º y 1.er pase. 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 161 EFECTOS INTRACELULARES DE FACTORES DE ESCLEROSIS PERITONEAL Una vez alcanzada la confluencia, se pasaban los cubreobjetos a una nueva placa, con medio de cultivo sin FBS, resembrándose las células periféricas de la placa inicial. La confluencia de un subcultivo en un nuevo disco se alcanzaba a los 8-12 días de cultivo. Las células de los cubreobjetos alcanzaban el estado metabólico homogéneo, con un crecimiento mínimo a las 24 h de incubación en medio sin FBS 27. Las tinciones intracelulares con sondas fluorescentes se realizaron en estufa a 37° C y con atmósfera de CO2 al 5%, con el fin de favorecer la desesterificación intracelular de los mismos. Determinación de Ca2+ y H+ intracelular Se realizó por fluorescencia indirecta de complejos Catión-Contraste, en un espectrofluorímetro Hitachi 2000. Utilizando una doble longitud de onda de excitación, se registraron las fluorimetrías durante todo el experimento, para evitar el error debido a la reducción de la fluorescencia por arrastre de las células durante la perfusión de la cubeta. En el día de la determinación, la placa previamente incubada durante 24 horas en medio sin FBS, se cargó con Fura-2(AM), 4 µM o BCECF(AM) durante 30 min. Estos compuestos difunden libremente al citoplasma en la forma AM, siendo desesterificados rápidamente con lo que pierden su difusibilidad a través de las membranas lipídicas, por lo que la pérdida de contraste es mínima durante los experimentos 28. Los experimentos se realizaron con los cubreobjetos con células, perfundidos en la cubeta a un flujo de 2 ml/min, en atmósfera de CO2 al 5% y con aspiración constante del líquido sobrante. No se observó fluorescencia en el líquido efluyente a este flujo de perfusión. Para el Ca (Fura-2) se utilizaron las longitudes de onda de emisión de 340 y 380, y de excitación de 510 nm. El calcio citosólico se calculó usando la formula de Grynkiewicz: iCa2+ = (R - Rmin / Rmax - R) x (Sf / Sb) x Kd, donde Kd es la constante de disociación del Fura 2, que es 224 µM 28, R es el cociente de las lecturas a las longitudes de onda utilizadas (340 y 380 nm), R max y R min se calcularon midiendo el cociente de fluorescencia a 340 y 380 nm, de una solución saturada de Ca2+ y Fura 2, y de una solución sin Ca2+ y con EGTA, respectivamente. Sf/Sb es el cociente de fluorescencia a 380 nm de una solución sin cal- cio, dividida por el de una saturada. Todos los parámetros de calibración, se obtuvieron usando soluciones de glicerol al 10 %, para simular las condiciones del citosol. Los valores así obtenidos fueron: R max = 6,98; R min = 0,785; Sf/Sb = 4,19. Para el pH intracelular (BCECF) las longitudes de onda utilizadas fueron 500 y 440 nm para excitación, y 520 nm para emisión. El pH se calculó a partir del cociente de las lecturas a 500/440, usando una recta de calibración calculada para cada experimento. La calibración se realizó perfundiendo las células con nigericina, 6 µg/ml, en una solución de KCl 120 mM 29. Actividad del intercambiador Na+/H+ La actividad del intercambiador Na+/H+ se calculó en experimentos en paralelo usando un clamp de pH y monitorizando la recuperación del pHi 30. En el momento adecuado se cambió la perfusión de las células a una solución con nigericina (0,5 µg/ml) en un medio sin Na+. Tras alcanzar un pHi de 6,8, se paró la acidificación con BSA (5 mg/ml). Al perfundir de nuevo con un medio con Na 140 mM, se recupera el pHi inicial a una velocidad dependiente del intercambio de Na/H. El cambio de pHi en los primeros 30 segundos se usó para calcular la actividad del intercambiador. Los resultados se expresan en % respecto a los controles. Los valores normales fueron 0,15 ± 0,02 unidades de pH/30 s. Soluciones Todos los experimentos salvo indicación expresa, se realizaron en soluciones tamponadas con CO2/HCO3-. En los experimentos sin bicarbonato, las células se estabilizaron en estas soluciones 30' antes de los experimentos. La solución estándar con HCO3- contenía (en mM): Na+ 136; K+ 4,7, Cl- 122, HCO3- 22; Ca2+ 1,25; Mg2+ 1,25; HPO4= 0,97; H2PO4- 0,23; glucosa 3,0; y se equilibraba con CO2 al 5% y O2 al 95%. El pH se ajustaba a 7,40. En las soluciones sin Na, éste fue reemplazado por cloruro o bicarbonato de colina. En ausencia de CO2/HCO3- se tamponaba con Hepes. Las soluciones se preparaban diariamente con agua bidestilada, bajo flujo laminar y se filtraban por 0,22µ, para evitar los productos derivados de la glucosa que produce la esterilización con calor. No se usaron líquidos de Diálisis Peritoneal com e rc i a l e s . 161 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 162 M. SORIA y cols. Compuestos usados La nigericina, etil-isopropil-amiloride (EIPA), cloruro de colina y los demás electrolitos se adquirieron a Sigma Chemical (St. Louis, MO). El Fura-2/AM a Boehringer Mannenheim, el BCECF/AM a Molecular Probes (Eugene, OR) y la Interleukina 1 a Advanced Protein Products (Brierly Hill, UK). Análisis de resultados El análisis de significación estadística se realizó mediante el paquete Statview, utilizando el test de Student con datos emparejados o no, según los casos. Entre los grupos con más de dos variables se utilizó el análisis de la covarianza (Anova), procediéndose en los casos significativos a comprobar nuevamente la significación mediante el Test de Student. Todos los resultados se expresan en media ± sd. Limitaciones de la metódica Los fibroblastos cultivados en monocapa actúan de forma diferente a cuando crecen en medio de una matriz colágena y protegidos por una capa de mesotelio. Los cambios del pH intracelular que observamos en estos experimentos serán lógicamente mucho más pronunciados que los que se obtendrían in vivo. La pérdida de adherencia y consiguiente arrastre de células por la perfusión de la cubeta, no altera las determinaciones. De todas formas, no se valoraron datos obtenidos en experimentos con pérdidas de fluorescencia global superiores al 50%. RESULTADOS La perfusión de los fibroblastos con una solución de pH 7,4 conteniendo acetato o lactato 35 mM, indujo un rápido descenso del pHi, como puede verse en la figura 1. El descenso debido al acetato fue superior (pHi 6,80 ± 0,08), al del lactato (6,95 ± 0,07). Las diferencias fueron altamente significativas (n = 16, p < 0,01) hasta el minuto 9, y significativas (p < 0,05) entre los minutos 10 y 13. La recuperación fue completa a los 30 minutos, pero fue totalmente abolida por amiloride (EIPA 50 µM desde 20 min antes del experimento) o por la ausencia de Na+ en la solución de perfusión (fig. 2). Sin embargo la presencia o ausencia de bicarbonato/CO2 no modificó significativamente la recuperación del pHi (datos no mostrados). La perfusión de soluciones hiperosmolares a base de glucosa al 4,25% produjo un aumento del pHi 162 7,3 7,2 7,1 pH 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 -2 Perfusión Lactato 35 mM Acetato 35 mM 0 2 4 6 Minutos 8 10 12 14 Fig. 1.--Efecto de la perfusión de Acetato () o Lactato (N) sobre el pHi. Tras estabilización del pHi en perfusión electrolítica estándar, conteniendo HCO3-/CO2 se añadieron Acetato o Lactato, 35mM a la perfusión, estabilizada a pH 7,4 y pCO2 de 40 mmHg. El pHi desciende bruscamente, y se recupera a lo largo de casi 30 min. Las diferencias entre el efecto del Acetato ( pH= 0,38) y Lactato ( pH= 0,24) son altamente significativas hasta el minuto 9 (n = 16, p < 0,01). Perfusión 7,3 7,2 7,1 pH 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 -2 0 2 4 6 Minutos 8 10 12 14 Acetato 35 mM Lactato 35 mM Fig. 2.--Efecto del Na+ extracelular y del Amiloride (Etil-isopropil-amiloride, EIPA 50 µM) sobre la recuperación del pHi tras el descenso inducido por Lactato o Acetato. Se observa una ausencia de recuperación (n = 15, p < 0,01 respecto a la figura 1 a partir del minuto 9), tanto en ausencia de Na+ extracelular ( Lactato y N Acetato) como en presencia de amiloride ( Lactato y Acetato). No se aprecian diferencias entre los dos métodos de bloqueo del intercambio Na+/H+. (7,31 ± 0,06) con recuperación del pH basal a los 10 minutos (fig. 3). Estas variaciones fueron similares en presencia o ausencia de bicarbonato/CO2 (las elevaciones del pHi pueden teóricamente deberse a 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 163 EFECTOS INTRACELULARES DE FACTORES DE ESCLEROSIS PERITONEAL Glucosa 4,25% 7,4 7,3 7,3 pH 7,2 7,2 7,1 7,1 7,0 -2 0 2 4 6 Minutos 8 10 12 14 Fig. 3.--Efecto de la perfusión hiperosmolar (con glucosa al 4,25%) sobre el pHi. Se observa un ascenso del pHi entre los minutos 2 y 4 de perfusión, seguido de un descenso lento hasta niveles basales, tanto en presencia () como en ausencia de HCO3/CO2 (N). La variación del pHi fue totalmente abolida (n = 15, p < 0,01, minutos 3 a 10) por la ausencia de Na+ () y por el amiloride (), sin diferencias entre ambos. la inhibición del intercambiador Na+/H+ o a la activación del intercambio Cl-/HCO3-). La ausencia de Na+ o el amiloride inhibieron totalmente la variación de pHi inducida por la hiperosmolaridad. Soluciones hiperosmolares a base de manitol o de glicerol produjeron resultados similares (datos no mostrados) La perfusión de las células con Interleukina-1, 10-6 M produjo un descenso del pHi hasta 7,10 ± 0,03 en presencia de bicarbonato, pero no en su ausencia (fig. 4-a). La recuperación fue completa a los 15 min en presencia de Na+ pero no con bloqueo por amiloride o en ausencia de Na+. El bloqueo de la Ca-ATPasa con Cadmio 20 nM, dosis a la que no inhibe significativamente la bomba de protones 35, impide la recuperación del Ca intracelular (fig. 4-b) y también el descenso del pHi inducido por el intercambio Ca2+/H+ (fig. 4-a). La actividad del Intercambiador Na/H con los diferentes agentes utilizados se muestra en la figura 5. Puede verse que el acetato, lactato, glucosa hipertónica y IL-1 estimulan la actividad del intercam- 7,4 7,4 7,3 7,3 pH 7,2 7,2 7,1 7,1 7,0 350 300 Interleukina 1, 1µM Cd Cd 250 Ca2+ 200 150 100 50 -4 -2 0 2 4 6 minutos 8 10 12 14 Fig. 4-a: Efecto de la perfusión de Interleukina 1 sobre el pHi. En presencia de HCO3/CO2 (N) el pHi desciende un máximo de 0,15 unidades, a los 5 minutos, con recuperación posterior. En ausencia de HCO3/CO2 (I) hay una hipercorrección alcalótica tardía. La recuperación no se produce en ausencia de Na+ () o con Amiloride (). El bloqueo de la bomba de calcio con Cd, 20 nM anula todos los cambios del pHi (). b: Efecto de la perfusión de IL-1 sobre el Ca2+ libre citosólico. Se produce una elevación brusca, seguida por un descenso lento (N), que se bloquea en presencia de Cd (). 163 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 164 M. SORIA y cols. Actividad Na/H % 60 50 40 30 20 10 0 Acetato Lactato Hiperosmóstico Interleukina 1 15 min 30 min 45 min Fig. 5.--Actividad del intercambiador Na+/H+ tras 15, 30 y 45 minutos de exposición al Acetato, Lactato, glucosa hipertónica o IL-1. En todos los casos se observa un aumento de la actividad del cotransporte, que persiste a los 45 minutos. Todas las elevaciones son significativas respecto de la basal con excepción de las de los 45 minutos de la glucosa hipertónica y de la IL-1. biador, que persiste activado después de los 30 minutos, cuando ya el pHi ha vuelto a niveles basales. DISCUSIÓN La sobrecarga ácida intracelular se produce mediante exposición de las células a soluciones con ácidos débiles 31-33. Paradójicamente, cuanto más débil es el ácido, mayor es la sobrecarga ácida intracelular. El mecanismo se basa en que la forma no iónica (AcH) es la única que atraviesa la membrana celular, mientras que la iónica (Ac-) no lo hace. La proporción en que se encuentra cada forma en una solución depende de la diferencia entre el pH de la misma y el pK del ácido. La parte que penetra en el citosol (AcH) se transforma parcialmente en forma iónica, en función de la diferencia entre su pK y el pHi, liberando H+ al citosol. Un ácido débil como el acético (pK 4.76) se presenta con una proporción AcH/Ac- de aproximadamente 1/1.000 a pH 7.4. Esa mínima parte del Acético es la que es responsable de la acidificación citosólica. En el caso del láctico, aunque es un ácido más fuerte (pK 3,86), la parte difusible es solo 1/10.000 del total, a pH 7.4. Por este motivo, la sobrecarga ácida del citosol es una décima parte de la obtenida con acetato, utilizados a similar concentración. Pero los líquidos de Diálisis Peritoneal comerciales que contenían lactato o acetato, se preparaban a un pH de 5.5 por lo que la sobrecarga ácida in164 tracelular podría ser 100 veces superior ya que la concentración de AcH a pH más próximo al pK crece de forma exponencial al descenso del pH. Desconocemos si en el fibroblasto peritoneal rodeado de colágena y protegido por el mesotelio, se alcanzaban valores de pH intracelular tan ácidos como en el modelo experimental que presentamos en este trabajo, pero podríamos suponer que en condiciones de denudación mesotelial por agresiones peritoneales, descritas en la DP, la realidad se pudiera aproximar al modelo experimental. La acidosis intracelular que producen acetato y lactato (figs. 1 y 2) se recupera gracias al intercambiador Na+/H+ incluso en presencia de bicarbonato (que los antiguos líquidos comerciales de Diálisis Peritoneal no contenían). La recuperación es casi nula en ausencia de Na+ o si se bloquea el intercambiador con Amiloride (fig. 2). La recuperación del pHi por los sistemas de transporte de Cl/HCO3 no parece actuar al menos ante sobrecargas ácidas tan intensas. La estimulación del intercambiador persiste después de los 30 minutos (fig. 6), cuando ya el pHi se ha recuperado a valores basales. No hemos podido evaluar la persistencia de esta activación con experimentos de duración superior a los 45 min, debido a la alta tasa de pérdida de adherencia celular cuando se mantenían los fibroblastos durante mucho tiempo frente a concentraciones tan altas de acetato o lactato. En las condiciones in vivo la concentración de acetato o lactato en líquido peritoneal se reduce rápidamente por su absorción peritoneal y metabolización a bicarbonato, fundamentalmente en los hepatocitos. Los fibroblastos carecen de una actividad metabólica tan avanzada como la de los hepatocitos, por lo que no es de esperar que metabolicen el acetato o lactato en cantidades significativas, aunque sí que una parte significativa del lactato pase a piruvato en su citosol. Las soluciones hiperosmolares estimulan también el intercambiador Na+/H+ pero por un mecanismo diferente. No inducen acidosis citosólica que estimule en intercambiador sino que lo hacen por reducción del volumen celular, que estimula el intercambiador 34, 35, introduciendo Na en el citosol, junto con agua hasta que se normaliza el volumen celular. Paralelamente a la entrada de Na, el intercambiador extrae H+ del citosol, produciendo una alcalosis intracelular transitoria (fig. 3) que se inhibe si se elimina el Na extracelular o se bloquea el intercambiador Na+/H+ con amiloride. La estimulación del intercambiador Na+/H+ también persiste muchos minutos después de que el pHi se normalice (fig. 6). Esta inercia del estímulo ya fue descrita24, 35 aunque se desconoce su importancia en situaciones in vivo. Recientemente se ha sugerido que la activación os- 04. ALTERACIONES 26/3/04 09:05 Página 165 EFECTOS INTRACELULARES DE FACTORES DE ESCLEROSIS PERITONEAL mótica del intercambiador Na+/H+ se realiza a través de la vía de la protein-kinasa C 36 lo que podría justificar la persistencia del estímulo tras la desaparición del agente osmótico. También en este caso, la capacidad metabólica de los fibroblastos sobre la sobrecarga de glucosa es poco significativa. No se ha descrito una diferente incidencia de EP en diabéticos respecto a no diabéticos 6, 8. El tercer mecanismo implicado en la fisiopatología de la EP, al menos en términos epidemiológicos, es la inflamación/infección. La IL-1, al igual que otros agonistas que liberan trifosfato de inositol al citosol 32, produce un aumento de calcio libre citosólico por liberación del calcio endoplásmico y por entrada extracelular, seguido de un descenso mediado fundamentalmente por la Ca-ATPasa. Esta bomba intercambia calcio por protones de forma isoeléctrica 37, acidificando el citosol (figs. 4 y 5) y estimulando tanto el intercambiador Na+/H+ como los de Cl/HCO3, sin que pueda excluirse una activación directa de los sistemas reguladores de pHi 38. El bloqueo de la bomba de calcio con iones divalentes (Cd, Va) inhibe esta acidificación del citosol 37. El intercambiador Na+/H+ se estimula por esta acidificación, que compensa rápidamente, pero se mantiene activado más de 15 min después del equilibrio de pHi (fig. 6), dando lugar a una alcalosis en ausencia de bicarbonato pero no en su presencia, ya que los cotransportes de cloro/bicarbonato (Na dependiente e independiente) activados por la vía del IP-3 y PKC 38 regulan el pHi predominando sobre el intercambiador Na+/H+, cuyo efecto principal en situaciones fisiológicas es el de regulador del volumen y el Na+ celular 24, 31, 34. En conjunto, hemos descrito que tres de los factores epidemiológicamente implicados en la producción de EP presentan un efecto común, la activación del intercambiador Na+/H+ pero mediante tres mecanismos diferentes. Parece lógica la posibilidad de que se produzca una potenciación de esta activación si varios de los factores se combinan en el mismo paciente. La activación del intercambiador Na+/H+ se ha descrito como parte de la señal-transducción intracelular de la inducción de la mitosis 24, 39, lo que pudiera explicar la proliferación fibroblástica y la secreción aumentada de colágena que forma parte de la fisiopatología de la Esclerosis Peritoneal secundaria a Diálisis Peritoneal. Una conclusión práctica de este estudio sería que los líquidos de Diálisis Peritoneal actuales conteniendo lactato deberían ser menos ácidos para reducir la sobrecarga ácida intracelular. Desafortunadamente esto aumentaría el riesgo de caramelización de la glucosa durante la esterilización, por lo que la única alternativa válida (si se siguen esterilizando por calor) es sustituir el lactato por bicarbonato. Sobre todo en el caso de necesitar líquidos hipertónicos, o durante los episodios de peritonitis y su recuperación posterior, se debería evitar el uso de líquidos ácidos con lactato. Sin embargo, los líquidos comerciales con pH neutro, aunque contengan lactato no serían agresivos para el peritoneo. El empleo de amiloride intraperitoneal pudiera ser una alternativa teórica, aunque las dosis usadas en este trabajo son muy superiores a las habituales en clínica y no podemos descartar que impidieran la natural reposición del mesotelio peritoneal denudado tras la agresión. La adición de bicarbonato a baja dosis (10 mL de NaHCO3 1 M por cada 2 L de solución) es una alternativa de bajo coste que puede ser usada durante las peritonitis y su recuperación clínica con el objeto de neutralizar parcialmente el bajo pH de los líquidos de Diálisis Peritoneal y reducir de esta forma la entrada de lactato a los fibroblastos. Trabajo parcialmente financiado con la beca FIS 92/1061. BIBLIOGRAFÍA 1. Brown P. Baddeley H. Read AE. Davies JD. McGarry J. Sclerosing peritonitis, an unusual reaction to a beta-adrenergicblocking drug (practolol). Lancet 2 (7895): 1477-1481, 1974. 2. 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