SEROTIPOS IDE Vol. XVIII.HEMODIALISIS NEFROLOG A. VHC EN Núm. 3. 1998 Serotipificación de virus de Hepatitis C en pacientes en hemodiálisis J. Russi*, L. Gadola**, C. Verdaguer**, M. Labella**, H. Chiparelli*, G. Alonso*, M. Pérez*, R. Cruells***, G. Mescia***, A. Varela**** y H. Caorsi***** * División Laboratorio. Ministerio de Salud Pública. Uruguay. ** Grupo de estudio de Hepatitis C de la Sociedad Uruguaya de Nefrología. Centro de Diálisis Casmu. Centro de Diálisis Renis. *** Grupo de estudio de Hepatitis C de la Sociedad de Gastroenterología del Uruguay. ****Centro de Diálisis del Casmu. Uruguay. *****Centro de Diálisis Renis. Uruguay. RESUMEN El virus de la hepatitis C (VHC) tiene una elevada prevalencia en los pacientes en hemodiálisis y presenta altos niveles de variabilidad, habiéndose descrito seis genotipos y varios subtipos. El objetivo del presente estudio es analizar la distribución de los serotipos de VHC en donantes de sangre y en los pacientes de dos Centros de Hemodiálisis con anticuerpos para VHC, mediante la determinación de anticuerpos específicos de genotipos localizados en el antígeno NS4 (Murex HCV Serotyping 1-6) y las posibles vías de transmisión en los hemodializados. Resultados: Se observó serotipo único en 21 pacientes, no tipificable en ocho pacientes y más de un serotipo en cinco pacientes. El serotipo 2 se observó con frecuencia significativamente mayor en el Centro A (6/11) vs Centro B (1/23) (chi2 p < 0,05). No se observaron diferencias significativas en la edad, tiempo en hemodiálisis o detección de ARN viral según los serotipos. Conclusiones: La frecuencia significativamente mayor de un serotipo de virus de hepatitis C infrecuente (el 2) en los pacientes de un Centro de hemodiálisis apoya la hipótesis de la transmisión nosocomial de esta infección y destaca la importancia de la serotipificación en los estudios epidemiológicos. Palabras clave: Virus C. Serotipos. Hemodiálisis. SEROTYPES OF HEPATITIS C VIRUS IN HEMODIALYSIS PATIENTS SUMMARY Hepatitis C virus infection is highly prevalent in hemodialysis patients. This RNA virus has a high variability. All known variants have been classified into six major genotypes and several sybtypes. The aim of this study was to try to identify the possible source of infection by the distribution pattern of HCV serotypes (antibodies against specific epitopes, Murex HCV Serotyping 1-6 assay). Among hemodialyzed patients of two Hemodialysis Units. (Unit A: 11 patients and Unit B: 23 patients) and 11 blood donors. Results: Hepatitis C virus serotype 1 was dominant (14 hemodialyzed patients and 2 blood donors). (Tables I y II). Serotype 2 was significantly more frequent (chi2 p < 0,05) in Dialysis Unit A (6/11) vs B (1/23). No association was found between HCV serotypes and demographic feaRecibido: 10-IX-97 En versión definitiva: 17-II-98 Aceptado: 20-II-98 Correspondencia: Dra. Liliana Gadola 18 de julio. 2103 Apto. 802 11200 - Montevideo. Uruguay 227 J. RUSSI y cols. tures of patient (Table III). Conclusion: The significantly higher prevalence of serotype 2 in one Dialysis Unit may imply that nosocomial infection was the main cause of HCV transmission in those patients and it emphasizes the utility of HCV serotyping in epidemiological studies. Key words: Virus C. Serotypes. Hemodialysis. INTRODUCCION La infección por virus de hepatitis C (VHC) tiene una elevada prevalencia entre los pacientes en hemodiálisis crónica (HDC) 1, 2. Se han planteado como causas probables las transfusiones sanguíneas y la transmisión nosocomial 3, 4. El VHC es un virus ARN de cadena positiva que presenta altos niveles de variabilidad habiéndose descrito hasta el momento seis genotipos mayores y más de 20 subtipos. Se ha propuesto que diferentes genotipos se asocian con diferente severidad de la hepatopatía y diferente respuesta al tratamiento. Recientemente se ha desarrollado un test por técnica de ELISA para detección de anticuerpos dirigidos contra epitopos específicos de genotipo ­variantes antigénicas de la proteína NSH del VHC 5. El objetivo del presente estudio es analizar la distribución de los serotipos de VHC en donantes de sangre y en los pacientes en dos Centros de Hemodiálisis con anticuerpos para VHC (AcVHC), mediante la determinación de anticuerpos específicos de genotipos y las posibles vías de transmisión en los hemodializados. METODOLOGIA En agosto de 1996 se analizaron los serotipos de 11 donantes de sangre con AcVHC y de pacientes en HDC de dos centros (A y B) de Montevideo (Uruguay), que presentaban AcVHC positivos. En el centro B ocurrió una epidemia de hepatitis noA noB en 1988-1989 que se confirmó como hepatitis C cuando en 1991 se determinaron AcVHC por técnica de ELISA II. En el Centro A la tasa de seroconversión para AcVHC aumentó en 1992-93. Eran 34 pacientes: 24 hombres y 10 mujeres, con edad media 61 años (rango 24 a 90) y un tiempo en hemodiálisis promedio de 92 ± 43 meses (rango 18 a 172). Había 11 pacientes del Centro A (donde la prevalencia de pacientes con AcVHC era 16% y 23 pacientes en el Centro B con una prevalencia 22%. Ningún paciente tenía anticuerpos detectables para VIH ni antígeno de superficie del virus B. Se registró si el paciente fue transfundido en el período previo a la fecha de inicio de la Hepatitis. Se consideró la evolución desde el momento en que se detectó seroconversión de los 228 AcVHC y/o aumento de los niveles de transaminasas con posterior confirmación de AcVHC positivos. En ambos Centros se reusan los dializadores (fibras capilares) mediante lavado en pileta, separada para paciente positivos y negativos para AcVHC a partir de 9/93 en el centro A y de 3/93 en el centro B. La serología para determinación de AcVHC se realizó utilizando un procedimiento de ensayo inmunoenzimático de segunda generación (HCV EIA Abbott). Los sueros reactivos fueron confirmados por inmunoensayo en línea (LIATEK HCV, Organon Teknika) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. La investigación de ARN viral (RT-PCR) se realizó mediante extracción del ARN de 100 µl de plasma por el método del isotiocianato de guanidinio-cloroformofenol y se sintetizó ADNc utilizando la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney, a partir del extremo 5" NCR del genoma viral. Luego de una doble ampliación (nested PCR) los ampliados fueron revelados por migración electroforética en gel de agarosa con tinción con bromuro de etidio. La serotipificación viral se realizó mediante un test que determina en los sueros de los pacientes la presencia de anticuerpos dirigidos contra epitopos específicos de genotipo localizados en el antígeno NS4 (Murex HCV Serotyping 1-6 assay). Se determinaron mensualmente enzimas hepáticas. Transaminasa glutámico pirúvica y oxalacética (TGP y TGO) mediante técnica cinética con lectura por luz ultravioleta automatizada (Valor normal TGO < 29 mU/ml y TGP < 33 mU/ml). Se determinaron cada seis meses: a) Colinesteresa mediante técnica colorimétrica cinética de punto final (automatizada) (Valor normal 5.3 - 12.9 U/ml), b) Albuminemia mediante electroforesis en acetato de celulosa (Valor normal 4g%) y c) tiempo de protrombina por método electromagnético con reactivo de Tromboplastina C1 plus con lectura en STA compact automático (Valor normal 70 - 100%). Se evaluó la presencia de signos indirectos de hipertensión portal por medio del examen físico, ecografía abdominal y/o tomografía axial computarizada de abdomen. Se planteó realizar biopsia hepática a aquellos pacientes candidatos a trasplante renal y sin contraindicaciones para eventual tratamiento. Sólo uno de los pacientes aceptó y se le realizó biopsia hepática por fibrolaparoscopia con estudio SEROTIPOS DE VHC EN HEMODIALISIS histológico. El período de observación de la evolución clínica desde la seroconversión de los AcVHC y/o aumento de los niveles de transaminasas con posterior confirmación de AcVHC positivos a la fecha del corte fue entre 18 meses y ocho años. En 24/34 pacientes el seguimiento evolutivo fue de cinco o más años. RESULTADOS En la Tabla I se muestran los resultados de TGO, TGP, PCR y serotipos obtenidos en agosto/96. En la Tabla II se observan los serotipos encontrados en los donantes de sangre. En los hemodializados se encontró serotipo único en 21 pacientes (pac.), (serotipo 1 en 14 pac., serotipo 2 en 6 pac. y serotipo 3 en 1 pac.), serotipo no tipificable en 8 pac. y en 5 pac. más de un serotipo simultáneamente. El serotipo 1 se observó con mayor frecuencia: en 14 pacientes en hemodiálisis y en 2 donantes. El serotipo 2 estaba presente en 6 pac. en HDC (todos del mismo Centro) y coexistiendo con serotipos 1 y 3 en un paciente del Centro B. El serotipo 3 se encontró en 1 paciente en HDC y en 3 donantes de sangre. El serotipo 2 se observó con una frecuencia significativamente mayor (chi2 p < 0,05) en el Centro A (6/11) que en el Centro B (1/23) y donantes de sangre (0/11). La fecha de inicio de la hepatitis fue superior a 1990 en 6/7 pacientes con serotipo 2 y sólo en 11/18 pac. con serotipo 1 (chi2 NS). El número de pacientes transfundidos fue 10/11 en el centro A y 20/23 en el centro B, sin diferencias entre ambos Centros. El tiempo en hemodiálisis de los pacientes con serotipo 1 fue: 89 ± 40 meses (rango 18 a 160), con serotipo 2: 99 ± 42 meses (rango 58 a 172), con serotipo 3: 40 meses, con más de un serotipo: 84 ± 50 meses (rango 19 a 146) y con serotipo no tipificable: 104 ± 48 meses (rango 51 a 171), sin diferencias significativas entre los diferentes grupos (test de Mann Whitney NS). No se observaron diferencias significativas en la edad de los pacientes con PCR positivos (63 años, rango 39 a 90) vs negativo (60 años, rango 24 a 79) (test de Mann Whitney NS), con serotipo 1 (59 años, rango 24 a 79) vs serotipo 2 (63 años, rango 53 a 74) (test de Mann Whitney NS), ni tampoco entre aquellos pacientes que presentaban un solo serotipo (59 años, rango 24 a 79) vs varios serotipos simultáneos (65 años, rango 31 y 79) (test de Mann Whitney NS). Tabla I. Resultados. Nº PAC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 * No Tipificable. TGO 6 11 25 6 19 11 7 19 68 15 68 19 16 18 12 17 8 TGP 2 20 37 6 17 14 5 18 79 13 204 13 30 12 13 5 13 PCR NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POS NEG NEG NEG POS NEG POS POS NEG NEG SEROTIPOS 1 2 2 NT* NT 2 2 2 1 NT 2 1 1, 2, 3 1 1 1 1 Nº PAC 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 TGO 18 18 13 16 11 23 26 8 11 18 14 13 21 9 12 22 25 TGP 26 14 18 34 12 35 23 12 17 18 16 9 16 8 15 26 26 PCR NEG POS NEG NEG POS POS NEG NEG NEG POS POS POS POS POS POS NEG POS SEROTIPOS 1 1,3 1,3 1,4 1 1 1,3 3 1 1 NT NT NT 1 NT NT 1 Tabla II. Serotipos en donantes de sangre SEROTIPOS 1 3 1+3 No tipificable Nº DE DONANTES 2 3 2 4 Se encontró ARN viral (PCR) positivo en 14/34 pacientes. El tiempo en hemodiálisis de los pacientes con PCR positivo fue de 82.62 ± 36.07 meses (rango 18 a 148) sin diferencias significativas con aquellos con PCR negativo 98.62 ± 46.18 meses (rango 19 a 172) (test de Mann Whitney NS). No se observó diferencia significativa en la presencia de ARN viral según los diferentes serotipos (chi2 NS) (Tabla II). En agosto/96 los pacientes con PCR negativo presenta229 J. RUSSI y cols. ban niveles de TGO de 20 ± 19 mU/ml y TGP de 30 ± 44 mU/ml, sin diferencia significativa con los pacientes PCR positivo cuyos niveles de TGO fueron 16 ± 4 mU/ml y TGP 15 ± 7 mU/ml (test de "t' NS). La evolución de la hepatopatía no se analiza por no disponer en todos los pacientes de los estudios necesarios. El único paciente que aceptó ser biopsiado presentaba serotipo 1, TGO y TGP elevadas persistentemente al 5º año, sin elementos clínicos de insuficiencia hepatocítica y la histología mostró una esteatosis hepática. DISCUSION La prevalencia de AcVHC en los donantes de sangre en nuestro país es 0,3% 6, similar a otras áreas geográficas 7, 8. La prevalencia de genotipos de VHC en donantes de sangre es variable según las regiones, por ejemplo en Argentina y Brasil predomina el genotipo 1 9, 10, 11. En la muestra de donantes de sangre de nuestro medio se encuentra serotipos 1 y 3. La hepatitis a virus C tiene una elevada prevalencia en los pacientes en hemodiálisis crónica en nuestro país ­aunque ha descendido en los últimos años, 20% en set/95 12, vinculada al descenso de la tasa de seroconversión luego de adoptarse medidas de aislamiento e insistir en el estricto cumplimiento de las medidas de barrera, similar a lo ocurrido en otros países: informe de EDTA 1993: 15,1% 13. En los pacientes en HD los genotipos de VHC predominantes varían según los distintos países: en Francia predomina el genotipo 1b 14, 15, en Italia el 2a y 1b 16 en Argentina 17, 18 y Uruguay 19, 20 el genotipo 1, en tanto que en Arabia Saudita predomina el 4 21. La metodología corriente para la genotipificación de VHC a través del análisis del ARN viral es compleja y poco apropiada para su uso en la práctica médica. La introducción de métodos serológicos para establecer los genotipos circulantes es de gran importancia para resolver aquellas dificultades. La síntesis de péptidos específicos de genotipo ha permitido demostrar respuestas inmunes no cruzadas 5, 22, 23 posibilitando el diagnóstico del genotipo involucrado en la infección aún en ausencia de ARN circulante, o cuando éste último se ha deteriorado por el almacenamiento de las muestras. El método permite también el diagnóstico retrospectivo de genotipo en infecciones por VHC curadas o controladas. Sin embargo una respuesta inmune disminuida por la presencia de enfermedades asociadas con inmunodeficiencias pueden limitar el procedimiento y 230 son responsables de la mayoría de los fracasos de la serotipificación (virus no tipificable). La serotipificación no permite distinguir a los subtipos de VHC y esta característica limita el procedimiento cuando se intenta conocer con mayor precisión las cadenas epidemiológicas que sigue el virus. En el Centro B donde la epidemia ocurrió en 1988-89, los pacientes presentan en su mayoría serotipo 1. En el Centro A, en el cual la epidemia ocurrió en 1993, predomina el serotipo 2, infrecuente en nuestro medio. Este hecho puede tener dos causas: corresponder a la aparición posterior de este serotipo como ha sido referido por otros autores 24, 25, 26 y coincidente con nuestro hallazgo de que en 6/7 pacientes con serotipo 2, la fecha de inicio de la hepatitis fue posterior a 1990 y sugerir la transmisión nosocomial intracentro dado la diferencia significativa de su prevalencia en relación al Centro B. Las vías de transmisión nosocomial en un Centro de hemodiálisis pueden ser múltiples como ha sido señalado reiteradamente por numerosos autores 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y explicaría la menor prevalencia en los pacientes en diálisis peritoneal 36. Aún no se ha podido identificar el valor relativo de cada una de estas posibles vías de transmisión y la noción de la transmisión nosocomial surgía de hallazgos indirectos. El hallazgo de un serotipo infrecuente como el 2 en nuestro medio, en un número significativamente mayor de pacientes en un Centro de diálisis (A), nos daría evidencia de la posible contaminación nosocomial como ha sido referido por otros 37. Numerosas comunicaciones recientes apoyan esta hipótesis mediante el análisis filogenético de los genotipos de VHC hallados en diferentes unidades de diálisis y que permiten reconstruir la diseminación del virus en dicha área 16, 36. Se ha referido que los diferentes genotipos tendrían importancia en la evolución de la hepatopatía, en el riesgo de desarrollar cirrosis y hepatocarcinoma, así como en las respuestas al tratamiento 38, 39, 40, aunque no todos los autores coinciden en que estas diferencias sean significativas 41, 42, 43. Dado el predominio de serotipo 1 en los pacientes estudiados y que se realizó sólo una biopsia hepática no es posible analizar la influencia de los diferentes serotipos en la evolución de su hepatopatía. No encontramos diferencias significativas en la edad ni sexo de los pacientes según los serotipos que presentaban, al igual que otros autores 16. No encontramos diferencias en la presencia de VHC ARN (PCR) en relación a la edad, tiempo en diálisis, serotipo y niveles de TGO y TGP al corte como ya ha sido referido en otros estudios 16, 21, 39, 41, 43, 44. Kobayashi y cols.45 encuentran títulos significativamente mayores de ARN viral y evolución más severa de la SEROTIPOS DE VHC EN HEMODIALISIS hepatopatía en los pacientes con genotipo 1 en relación al 2. El mejor conocimiento de la evolución de la hepatitis por virus C en los pacientes en hemodiálisis permitirá precisar la indicación y oportunidad de tratamientos adecuados e instaurar un programa de prevención de progresión de la hepatopatía. CONCLUSIONES 1) La frecuencia significativamente mayor del serotipo 2 en un Centro de Diálisis apoya la hipótesis de la transmisión nosocomial por tratarse de un serotipo infrecuente en el resto de la población. 2) Se destaca la importancia de la serotipificación de los VHC en los estudios epidemiológicos retrospectivos en Centros de Hemodiálisis. Tabla III. Serotipos en pacientes en HDC Nº pacientes PCR SEROTIPOS 1 2 3 VARIOS No tipificable NEGATIVO 6 5 1 4 4 POSITIVO 8 1 0 1 4 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. BIBLIOGRAFIA 1. 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