NEFROLOGIA. Vol. XV. Suplemento 1, 1995 Regulación de la producción y liberación de parathormona en la insuficiencia renal crónica: De la biología molecular a la clínica A. Torres, A. Hernández, M. T. Concepción* y E. Salido Laboratorio de Medicina Interna y Biología Molecular. Departamento de Medicina Interna, Universidad de La Laguna. Servicio de Nefrología, Hospital Universitario de Canarias. *Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Virgen de la Candelaria. Tenerife. Introducción El proceso de síntesis de la PTH comienza con la t r a n s c r i p c i ó n d e l gen que da lugar a la síntesis de una molécula de RNA. Este transcrito primario sufre una serie de modificaciones en el núcleo (poliadenación y splicing) para convertirse finalmente en RNA m e n s a j e r o maduro. F i n a l m e n t e , una vez que el mRNA maduro alcanza el citoplasma, tiene lugar la síntesis peptídica a nivel ribosómico. Este es un proceso complejo en el que participan los tres tipos de RNA (tRNA, rRNA, mRNA), resultando destacable el hecho de que un mRNA pueda ser leído por numerosos ribosomas. Los ribosomas adheridos a una misma molécula de mRNA forman lo que se denomina u n polisoma, donde aumentará el rendimiento, ya q u e por cada ribosoma que recorra un mRNA se construirá una cadena peptídica. En otras palabras, s e construyen así numerosas cadenas peptídicas a partir de un solo mRNA (fig 1). El péptido así formado es la preproPTH. Después de sufrir varios cortes en su cadena se obtiene la PTH intacta (1-84 aminoácidos). Posteriormente, ésta puede almacenarse en gránulos, degradarse o secretarse a la circulación sistémica (fig 1). Básicamente, los niveles circulantes de la hormona son informativos del proceso de secreción. Si lo que pretendemos es analizar el proceso de síntesis de la misma, debemos recurrir a medir los n i v e l e s de mRNA de preproPTH, ya sea mediante N o r t h e r n blot, RT-PCR o ensayo de protección de RNAasa 1. Los factores más importantes que regulan la síntesis o/y secreción de PTH son el calcitriol, el calcio y el fósforo, y los analizaremos a continuación de manera pormenorizada. CÉLULA PARATIROIDEA DNA Transcripción mRNA SECRECION mRNA PreproPTH PTH TRADUCCION Degradación Almacén Fig. 1.­Síntesis y secreción de PTH. Regulación de la PTH por el calcitriol En 1984, Slatopolsky y cols. 2 demostraron en enfermos en diálisis que la administración intravenosa de calcitriol desciende de manera significativa los niveles de PTH antes de que se produzcan modificaciones en los niveles de calcio. Esto sugirió un efecto directo del calcitriol en la liberación de PTH en las paratiroides. Más tarde, Silver y cols. 3 demostraron Dr. Armando Torres Ramírez. Servicio de Nefrología. Hospital Universitario de Canarias. Ofra, s/n. 38320 La Laguna. Tenerife. 31 A. TORRES y cols. por vez primera, en células bovinas paratiroideas en cultivo, que tras 48 horas de incubación con calcitriol se produce un descenso de los niveles de mRNA de PTH del 50 %. Esto fue confirmado posteriormente en estudios in vivo en la rata 4. En este estudio se demostró además, mediante experimentos run-off de t r a n s c r i p c i ó n nuclear, que el calcitriol inhibe la transcripción del gen de la preproPTH. Este efecto se localiza en el flanco 5' del gen y no precisa de la síntesis de proteínas 5. Todos estos estudios demostraron claramente que el calcitriol tiene un efecto directo sobre las paratiroides independiente de los niveles de calcio, consistente en una inhibición de la transcripc i ó n y, por tanto, de la síntesis de mRNA de preproPTH. Shvil y cols. 6 demostraron más tarde que la insuficiencia renal producida mediante nefrectomía 5/6 e n la rata induce una elevación de los niveles de mRNA de preproPTH. La administración de calcitriol resultó en un descenso dosis-dependiente de los mismos, tanto en las ratas sham como en las insuficientes renales. Finalmente, Reichel y cols. 7 han demostrado en un trabajo reciente que este efecto inhibidor d e l calcitriol sobre la síntesis de PTH en la rata es más marcado cuando se administra en bolos intermitentes en lugar de infusión continua. S z a b o y cols. 8 h a n demostrado que el calcitriol administrado profilácticamente desde la producción de la insuficiencia renal en la rata inhibe eficazmente la incorporación de timidina tritiada y las mitosis, al tiempo que disminuye el peso de la glándula paratiroidea. Sin embargo, este efecto inhibitorio de la proliferación celular se pierde cuando se comienza el tratamiento después de 21 días de inducir la insuficiencia renal. Esto tiene importantes implicaciones p r á c t i c a s y sugiere que cuando se adquiere una magnitud crítica de hiperplasia glandular, el calcitriol pierde su eficacia. De ahí que nos parezcan de interés prioritario aquellos estudios clínicos dirigidos a definir el perfil de los enfermos en diálisis con hiperparatiroidismo secundario severo, con un grado d e hiperplasia crítico y que no van a responder a medio plazo al tratamiento con bolos de calcitriol. En estos enfermos estaría indicada la paratiroidectom í a y se evitarían los riesgos del tratamiento con calcitriol, no siempre bien advertidos en la literatura, como son la hipercalcemia y las calcificaciones de partes blandas. En resumen, el calcitriol inhibe la síntesis de PTH, y este efecto es más eficaz cuando se administra en bolos intermitentes que de forma continua. Además, la administración temprana de calcitriol previene la hiperplasia de la glándula. Por último, el clínico debe guiarse con los niveles circulantes de PTH intacta con el fin de evitar la enfermedad ósea adinámica o 32 grados significativos de hiperparatiroidismo y decidir adecuadamente el tratamiento con calcitriol 9, 10. Receptor de calcitriol en la paratiroides El efecto a nivel de la transcripción génica del calcitriol está mediado por una proteína citosólica, el receptor de calcitriol (VDR). La respuesta de la célula diana al calcitriol está mediada por su contenido en VDR 11. Merke y cols. 12 han demostrado en ratas urémicas que el contenido paratiroideo de VDR está reducido aproximadamente a la mitad en relación a los animales control con función renal normal (sham). Esto tiene una gran trascendencia, pues la disminución del número de receptores condiciona una menor respuesta inhibitoria al calcitriol, cuyos niveles circulantes se encuentran además disminuidos en la uremia. Patel y cols. 13 han demostrado recientemente que cuando a ratas con función renal normal se les infunde ultrafiltrado de pacientes urémicos se produce un descenso notable en el contenido de VDR a nivel intestinal. Aunque aún no esté formalmemte probado, es muy probable que este efecto de la «uremia» per se ocurra de manera similar a nivel paratiroideo. Los mecanismos implicados no están claros, aunque inicialmente se pensó en una acción a nivel transcripc i o n a l . En otras palabras, se barajó la hipótesis de que la uremia bloquear la transcripción del gen VDR disminuyendo su producto final, la proteína VDR. Sin embargo, disponemos de poca información en este sentido. Shvil y cols. 6 demostraron que las ratas urém i c a s desarrollan un aumento considerable del mRNA de preproPTH, sin modificarse el mRNA de VDR paratiroideo. Esto sugiere que en la uremia existe un disbalance entre la síntesis de PTH y la de VDR en la glándula, o, dicho de otra manera, que la síntesis de receptores es subóptima para ese grado de hiperparatiroidismo. A nivel intestinal, Patel y cols. 13 han confirmado que la proteína (el VDR) está disminuida en la uremia, pero el mRNA de VDR no sólo n o se encuentra disminuido, sino aumentado. Este hallazgo sugiere que el déficit de VDR en la uremia se produce por un mecanismo postranscripcional, al menos a nivel intestinal. Sin duda, se requieren estudios adicionales que confirmen estas discrepancias. El tratamiento con calcitriol induce a las 24 horas un aumento significativo de los niveles de mRNA de V D R en la paratiroides de ratas con función renal normal 14. Además, la cantidad de VDR a nivel intestinal aumenta tras el tratamiento con calcitriol tanto en ratas urémicas como en las controles con función renal normal 13, aunque en este estudio disminuyeron p a r a l e l a m e n t e los niveles de mRNA de VDR. PRODUCCION Y LIBERACION DE PARATHORMONA Independientemente del mecanismo subyacente, lo relevante es que el calcitriol produce una «sobrerregulación» (up-regulation) de sus propios receptores, con lo que se potencia su efecto inhibitorio sobre la síntesis de PTH. Regulación de la PTH por el calcio La hipocalcemia es el estímulo fundamental para la secreción rápida de PTH (2-3 minutos), y entre los niveles extracelulares de calcio iónico y de PTH existe una relación sigmoidal bien definida 15. En la uremia existe un desplazamiento de esta curva a la derec h a , de tal manera que para un mismo nivel de calcio la PTH es más elevada 15. Los cambios de los n i v e l e s de calcio no sólo afectan la secreción de PTH, sino también su síntesis. En efecto, Yamamoto y cols. 16 han demostrado in vivo en la rata que en la hipocalcemia prolongada (48 horas) se duplican los niveles de mRNA de preproPTH, mientras que en la hipercalcemia disminuyen significativamente. De la misma manera, estos autores demostraron una relación inversa entre calcemia y niveles de mRNA de preproPTH 16. Durante el tratamiento con calcitriol en bolos en l o s enfermos en hemodiálisis es necesario recurrir con frecuencia al uso de baños de diálisis con bajo contenido de calcio, con el fin de evitar la hipercalcemia. Debido al balance cálcico negativo, se ha documentado una elevación de los niveles de PTH al fin a l de la diálisis 17. Además de este efecto agudo sobre la secreción, no se puede descartar que una hip o c a l c e m i a intermitente de 3-5 horas de duración tres veces por semana, durante un período prolongado, estimule además la transcripción y, por tanto, la s í n t e s i s de PTH. Esto debe tenerse en cuenta en aquellos enfermos con hiperparatiroidismo severo y tendencia a la hipercalcemia a la hora de tratarlos con calcitriol. Desde hace unos años se sabe que a nivel paratiroideo existe un receptor específico de calcio que actúa como un sensor de sus niveles extracelulares y que produce modificaciones de la fosfolipasa C de membrana y secundariamente de los niveles de IP3 y calcio intracelulares 18. Brown y cols. 18 han clonado recientemente el gen de este receptor, lo cual seguramente condicionará avances importantes sobre los mecanismos moleculares de muchas enfermedades o patologías. Así, se ha demostrado que la hipercalcemia hipocalciúrica familiar y su forma homocigota, el hiperparatiroidismo neonatal severo, así como la h i p o c a l c e m i a autosómica dominante, obedecen a una mutación en dicho gen 19. Por otro lado, una disminución o alteración de dicho receptor pueden justificar el desplazamiento a la derecha de la relación s i g m o i d a l calcio-PTH en la uremia. Sin embargo, tanto Fox y cols. 20 como nosotros mismos (fig. 2) no h e m o s observado una disminución del mRNA del receptor paratiroideo de calcio en la uremia. Esto sugiere que, de existir un efecto de la uremia sobre dicho receptor, debe estar localizado a nivel postranscripcional. mRNA PCaR/18S 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 Sham I. renal F i g . 2.­Niveles de mRNA (densidad óptica) del receptor paratiroideo de calcio corregidos por el RNA 18S y el tamaño de l a glándula en ratas con función renal normal/sham y con nefrectomía 5/6. Efecto del fósforo sobre la PTH La retención de fósforo en la insuficiencia renal es también un factor importante en la génesis del hiperparatiroidismo secundario. Este efecto de la hiperfosforemia está condicionado por la hipocalcemia, desc e n s o de los niveles de calcitriol y resistencia e s q u e l é t i c a a la acción de la PTH 21. Sin embargo, López-Hilker y cols. 22 han demostrado que en animales urémicos la restricción de fósforo disminuye los niveles de PTH de manera independiente a cambios en los niveles de calcio o calcitriol, y recientemente Slatopolsky y cols. han confirmado que esta m i s m a maniobra reduce además los niveles de mRNA de preproPTH 23. Nosotros hemos analizado la respuesta de ratas con función renal normal a una dieta de alto contenido de fósforo (calcio, 0,6%; fósforo, 1,2 %) durante 18 días, comparándola con un grupo control que recibía una dieta estándar (calcio, 0,6 %; fósforo, 0,6 %). Al final del experimento, los niveles de calcio, fósforo y calcitriol fueron similares en ambos grupos de ratas gracias a la elevación significativa de los niveles de PTH en el grupo con dieta de alto contenido de fósforo (fig. 3). Por último, las 33 A. TORRES y cols. Ca (mg/dl) 15 13 11 9 7 5 ESTANDAR (n = 38) 120 100 80 60 40 20 0 ESTANDAR ALTO PO4 40 20 0 ALTO PO4 (n = 45) 8 7 6 10 PO4 (mg/dl) CALCIO 9 FOSFORO ESTANDAR 100 ALTO PO4 CALCITRIOL (pg/ml) 80 60 PTH (pg/ml) p = 0,01 ESTANDAR ALTO PO4 Fig. 3.­Niveles de calcio, fósforo, calcitriol y PTH en ratas con función renal normal alimentadas con dieta estándar o de alto fósforo. mRNA preproPTH/18S 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 Estándar Alto fósforo dos estos datos sugieren que el fósforo puede afectar la síntesis y secreción de PTH de manera independiente a cambios en los niveles de calcio o calcitriol. A nivel clínico, este efecto directo del fósforo queda reflejado por la mala respuesta al tratamiento con bolos de calcitriol de aquellos enfermos con un mal control de los niveles de fósforo. Además, varios estudios recientes han demostrado que la hiperfosforemia es un excelente marcador de los enfermos refractarios al tratamiento con bolos de calcitriol 24-26. Agradecimientos Este trabajo ha sido realizado dentro del Proyecto FIS 92/0153 del Ministerio de Sanidad y Consumo. Bibliografía 1. Hernández A, Martín Vasallo P, Torres A y Salido E: Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. Nefrología 14:145162, 1994. 2. Slatopolsky E, Weerts C, Thielan J, Horst R, Harte H y Martin KJ: Marked suppression of secondary hyperparathyroidism by intravenous administration of 1,25 dihydroxycholecalciferol in uremic patients. J Clin Invest 74:2136-2143, 1984. F i g . 4.-Niveles de mRNA (densidad óptica) de preproPTH corregidos para el RNA 18S y el tamaño de la glándula en ratas con función renal normal alimentadas con dieta estándar o de alto fósforo. ratas con dieta de alto fósforo mostraron unas glándulas de mayor tamaño (1,32 veces) y unos mayores niveles de mRNA de preproPTH corregidos para el RNA 18S y el tamaño de la glándula (fig 4). En resumen, to34 PRODUCCION Y LIBERACION DE PARATHORMONA 3. Silver J, Russell J y Sherwood LM: Regulation by vitamin D metabolites of messenger RNA for pre-proparathyroid hormone in isolated bovine parathyroid cells. Proc Natl Acad Sci USA 82:4270-4273, 1985. 4. Silver J, Naveh-Many T, Mayer H, Schmeizer HJ y Popovtzer MM: Regulation by vitamin D metabolites of parathyroid gene transcription in vivo in the rat. J Clin Invest 78:1296-1301, 1986. 5. Okazaki T, Igarashi T y Kronenberg HM: 5'-flanking region of the parathyroid hormone gene maediates negative regulation by 1,25(OH)2 vitamin D3. 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