NEFROLOGÍA. Vol. XX. Número 5. 2000 Mecanismos implicados en la nefrotoxicidad producida por aminoglucósidos A. I. Morales, M. Arévalo y F. Pérez-Barriocanal Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica. Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Salamanca. Desde su introducción en terapéutica en 1944, los aminoglucósidos (AMG) han constituido una familia de antibióticos ampliamente utilizados, cuya principal ventaja ha sido su actividad bactericida contra microorganismos gram negativos, representanto en muchos casos, la única alternativa terapéutica contra gérmenes resistentes a otros antibióticos. Los aminoglucósidos (neomicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina), son antibióticos naturales o semisintéticos de estructura heterocíclica formados por dos o más aminoazúcares unidos por enlaces glucosídicos a un anillo aminociclitol. Desde el punto de vista farmacocinético, poseen escasa absorción oral, por lo que la administración intravenosa es la más empleada en pacientes con infecciones severas. Debido a su tamaño y carga policatiónica, los AMG atraviesan pobremente las membranas biológicas que carecen de mecanismo de transporte, esto explica las bajas concentraciones alcanzadas en casi todos los tejidos humanos. Las células de los túbulos proximales renales constituyen una excepción, ya que poseen un mecanismo de transporte particular y pueden concentrar AMG hasta niveles muy superiores a los encontrados en plasma. Los AMG no son metabolizados por el ser humano y se excretan inalterados por los riñones. Sufren una filtración y una pequeña porción, pero toxicológicamente importante del AMG total filtrado, es reabsorbido por las células de los túbulos proximales 1. Esta reabsorción implica la unión de los AMG a fosfolípidos con carga negativa, situados en el ribete en cepillo de las membranas de los túbulos renales con posterior internalización por pinocitosis 2-6. No existen evidencias concluyentes de secreción tubular de estos agentes, cuantitativamente Correspondencia: Dr. Fernando Pérez-Barriocanal Departamento de Fisiología y Farmacología Edificio Departamental Campus Miguel de Unamuno 37007 Salamanca la mayor parte de los AMG excretados en la orina se corresponden con los filtrados. Su utilización está limitada por la nefrotoxicidad que producen. Se sabe que 8-26% de individuos que reciben un AMG durante varios días muestran trastorno renal 7-9 siendo el daño proporcional a la duración del tratamiento, pudiendo incrementarse hasta en un 50% en el caso de terapias prolongadas 10. La primera sintomatología de daño renal tras la administración de AMG se caracteriza por un aumento de la excreción urinaria de varias enzimas tubulares (alanina aminopeptidasa, -D-glucosamina y fosfatasa alcalina), proteinuria e incremento en la excreción de 2-microglobulina. Más tarde, aparecen modificaciones en el sedimento urinario (leucocituria y cilindruria), para finalmente disminuir la filtración glomerular, provocando un aumento del nitrógeno ureico (BUN) y de la creatinina plasmática. Constituyen las alteraciones enzimáticas marcadores precoces de los efectos renales 11, siendo la determinación de la actividad de la N-acetil-beta-D-glucosaminidasa (NAG) en orina la más utilizada para la detección temprana de los efectos tóxicos. La separación de los isoenzimas de NAG por cromatografía en columna de cambio iónico o por electroforesis es un método que nos indica los sitios específicos de daños renal 12. Asimismo, se ha propuesto la gamma-glutamil-transpeptidasa en la determinación diagnóstica de fallo renal inducido por AMG 13. La determinación urinaria de Cu y Zn es también un indicador de deterioro renal, ya que su concentración en orina se incrementa por administración de AMG, posiblemente por alteraciones a nivel de la reabsorción. Desafortunadamente el alto coste de la técnica hace este método impracticable en el uso clínico diario 14. Los cambios histológicos incluyen en una primera fase alteraciones en los lisosomas, seguidos por alteraciones en el borde en cepillo, retículo endoplasmático, mitocondrias y citoplasma, llegando finalmente, en casos de gran toxicidad, a la necrosis celular (fig. 1). También se ha observado prolifera- 408 NEFROTOXICIDAD POR AMINOGLICOSIDOS Fig. 1.--Microfotografía electrónica de la corteza renal de un animal tratado con un AMG. Obsérvese un túbulo proximal viable pero con pérdida parcial del ribete de microvellosidades, aumento del número de vacuolas y lisosomas y aparición de cuerpos multivesiculares. X4583. ción de las células del túbulo proximal, inmediatamente después del inicio de la nefrotoxicidad. Todos los AMG son capaces de causar acción tóxica renal, si bien, existen diferencias individuales entre los miembros de esta familia con respecto a su potencial nefrotóxico. La acumulación del antibiótico en el tejido renal es un importante factor de riesgo en la toxicidad. En la rata, gentamicina, tobramicina o kanamicina administradas por vía subcutánea alcanzan altas concentraciones en la corteza renal, mientras que la netilmicina considerada menos nefrotóxica, se elimina con mayor rapidez 15, lo que podría explicar su menor toxicidad. Estos resultados no se pueden trasladar de forma irrefutable al hombre, he hecho, los ensayos clínicos realizados en pacientes evaluando eficacia y toxicidad de netilmicina frente a gentamicina, no han encontrado evidencias convincentes del menor daño renal de netilmicina 16. MECANISMOS Son diversas las hipótesis que se han formulado en los últimos años para intentar revelar los posibles mecanismos implicados en la nefrotoxicidad producida por AMG, llegándose a la conclusión de que no hay un sólo mecanismo, sino que pudieran ser varios los responsables del efecto tóxico. Algunas de las características fisicoquímicas y farmacocinéticas de estos compuestos, como son: un rápido transporte, una gran acumulación y una ávida retención durante períodos prolongados, contribuyen definitivamente a la manifestación del daño renal. El transporte de AMG se realiza principalmente a través del ribete en cepillo luminal de las células de los túbulos renales, e incluye la unión inicial del AMG (con carga positiva) al fosfatidilinositol con carga negativa dentro de la membrana 2, 3, 6, 17. Se ha correlacionado la afinidad del AMG por la membrana del borde en cepillo con la nefrotoxicidad potencial del mismo 18. Sin embargo estudios más recientes sugieren que la afinidad de unión no es un parámetro determinante en la patogénesis de estos antibióticos 19. Otro de los estudios realizados en este sentido, apunta a que un incremento de los sitios de unión del AMG a las vesículas de la membrana del borde en cepillo pudiera estar relacionado con un aumento de la nefrotoxicidad, dicho incremento se favorecería con agentes que inducen cambios de carga en la membrana y aumentan cuantitativamente la unión del AMG, esta conclusión podría explicar la potenciación nefrotóxica producida por administración conjunta de vancomicina y tobramicina, habiéndose comprobado in vitro, que la unión de tobramicina a las vesículas de membrana fue mayor en vesículas preincubadas con vancomicina 20. Se considera que la internalización se realiza por pinocitosis, formándose vesículas que luego coalescen con lisosomas, cuyo interior cargado negativamente atrapa de forma efectiva el AMG 1, 21. La extensa acumulación de estos compuestos está confinada a la corteza renal, donde se pueden encontrar acumulaciones de 5-50 veces más elevadas que en el plasma 22. Dentro de la corteza renal, los AMG se localizan exclusivamente en las células de los túbulos proximales 1, 23. Morfológicamente causan una acumulación de estructuras multilamelillares dentro de los lisosomas, que se llaman cuerpos mieloide s21, 22, 24 (fig. 2). Debido a la acumulación de los AMG en los lisosomas, el daño producido sobre ellos tiene importantes implicaciones funcionales, entre ellas, la alteración de la permeabilidad de la membrana y su agregación con las de los lisosomas adyacentes 25. Algunos autores 26-28 han apuntado que la nefrotoxicidad de gentamicina se produce fundamentalmente por una fosfolipidosis provocada por una inhibición de enzimas responsables del metabolismo de los lípidos (fosfolipasas lisosomales A1, A2 y C1), habiéndose asociado también con una pérdida de la actividad de la esfingomielinasa 29, 30. Considerando que hay un daño importante a nivel de membrana, diversos trabajos han sugerido que la administración 409 A. I. MORALES y cols. Fig. 2.--Microfotografía electrónica de la corteza renal de un animal tratado con un AMG. Obsérvese la necrosis prácticamente total de los túbulos renales. X3149. de fosfolípidos (constituyentes esenciales de las membranas) podría reparar y acelerar la regeneración de ésta, en los casos en los que se ha dañado por agentes como la gentamicina 31. La fosfolipidosis finalmente conllevaría destrucción del orgánulo y subsecuentemente necrosis celular. Los AMG inhiben la fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol citosólico 32, esta inhibición es particularmente importante, ya que esta enzima es responsable de un paso temprano y crítico de la biosíntesis de prostaglandinas y prostaciclinas. Un efecto a este nivel, inhibe la producción de prostaglandinas vasodilatadoras, permitiendo la acción vasoconstrictora, lo que lleva a una vasoconstricción arteriolar y una disminución en la filtración glomerular 33. También se ha relacionado la activación de la fosfolipasa A2 con la administración de AMG 34. La fosfolipasa A2 cataliza a partir de fosfolípidos de membrana, la formación de ácido araquidónico y factor activador de plaquetas (PAF). El ácido araquidónico por la vía de la ciclooxigenasa daría lugar a la síntesis de tromboxanos (TXA2) y prostaglandinas (PGE). Papanikolau y cols.35, describieron como la administración de inhibidores de la síntesis de TXA2 ejercía una acción protectora frente a gentamicina y Assael y cols. 36, comprobaron que la coadministración de gentamicina y ácido-acetil-salicílico (inhibidor de PGE) ejercía igualmente un efecto beneficioso, sugiriendo con ello, que el incremento en TXA y PGE, mediadores vasoconstrictores, pudieran jugar 410 un papel en la generación del fallo renal agudo producido por AMG. Experimentos de nuestro laboratorio han demostrado que la administración de suplementos de fosfolipasa A2 inhiben el efecto contráctil y proliferativo de la gentamicina sobre las células mesangiales 34. Por su parte el PAF, produce disminución en la tasa de filtración glomerular cuando se administra por vía parenteral 37-39. Diversos estudios han mostrado un incremento en la producción de PAF en ratas tratadas con gentamicina y una reversión parcial de los efectos de la misma con antagonistas de los receptores de PAF 40, 41, lo que sugiere que este mediador local pudiera estar implicado en el mecanismo tóxico a través de un efecto vasoconstrictor que provocaría un descenso en la presión efectiva de ultrafiltración y una disminución de la tasa de filtración glomerular, efectos que se evidencian en los tratamientos con AMG. Otra de las enzimas que se ve afectada por la administración de AMG es la Na-K adenosina trifosfatasa (Na-K ATPasa) localizada en la porción basolateral de la membrana plasmática 42. En homogenados corticales de ratas tratadas crónicamente con gentamicina la actividad de esta enzima disminuye 43-45. Estos cambios, así como la pérdida de integridad de la Na-K ATPasa, se han señalado como responsables del efecto nefrotóxico 46, ya que esta enzima regula el transporte de electrolitos intracelulares y volumen celular. A nivel mitocondrial los AMG: interfieren en la generación de ATP, alterando funciones de transporte celular dependientes del mismo, producción de energía y respiración celular. Se ha evidenciado necrosis celular tras la deplección de ATP en modelos experimentales de nefrotoxicidad 47. Se ha visto también, como en este orgánulo se potencia la producción de radicales libres en presencia de gentamicina 48, 49. La formación de radicales libres de oxígeno es otro de los mecanismos que se han relacionado con la nefrotoxicidad de estos compuestos 50, 51. Los radicales libres formados durante las reacciones oxidativas por oxidasas asociadas al citocromo P-450 y la xantinooxidasa, pueden generar moléculas muy inestables que reaccionan químicamente con macromoléculas celulares como proteínas y ácidos nucleicos, produciendo daño celular por modificaciones covalentes 52. El glutation (GSH) constituye un elemento esencial en la defensa antioxidante, estructuralmente es un pequeño péptido constituido por tres aminoácidos: glutamina, cisteína y glicina, siendo el grupo sulfhidrilo (-SH) de la cisteína el responsable de la capacidad neutralizadora de radicales libres. La disminución de GSH conlleva a un desequilibrio en el sistema oxi- NEFROTOXICIDAD POR AMINOGLICOSIDOS dante GSH/GSSH (glutation reducido), cuyo resultado se expresa como un fallo en la acción autoprotectora de la célula. Diversos estudios han evidenciado una disminución en la GSH por la administración de gentamicina 53-55, sugiriendo éste como un posible mecanismo nefrotóxico. Partiendo de esta hipótesis, otro trabajo estudió el efecto de la administración exógena de GSH a ratas tratadas con gentamicina, considerando que esto podría ser útil en la reducción del daño renal. Los resultados encontrados no revelaron evidencias positivas de protección, concluyendo que los radicales libres no son el principal mediador de la nefrotoxicidad experimental por gentamicina 56. Esto está en concordancia con lo señalado por Wu y cols. 57, que apuntaban que la nefrotoxicidad de gentamicina no afecta significativamente a la concentración renal de GSH. Sin embargo, en otros trabajos la suplementación de Fe en la dieta o la administración del mismo por vía intramuscular, agravó la nefrotoxicidad por gentamicina 58, 59. El Fe es un inductor de peroxidación lipídica y por lo tanto, podría potenciar el efecto tóxico de la gentamicina a través de la formación de radicales libres. De hecho, la administración de desferroxamina, un quelante de Fe, ejerció un efecto protector 60; por una parte la formación del quelato reduciría los efectos generadores de radicales libres inducidos por el anión ferroso (Fe2+) 61 y por otra la desferroxamina estaría directamente implicada en la producción de óxido nítrico (NO) por un aumento en la actividad de la sintasa del óxido nítrico inducible (NOSi) 62. Como se detallará más adelante la acción vasodilatadora del NO ejerce un efecto beneficioso frente a la nefrotoxicidad producida por gentamicina. Otros autores 63-65, observaron en ratas Wistar que la preadministración de Zn (10 mg/kg/día s. c. 5 días) disminuía el efecto adverso de la gentamicina, pudiendo estar implicada la inducción de la síntesis de metalotieninas, las cuáles actuarían como barredores de radicales libres generados por gentamicina. Efectos similares se han encontrado con Se, vitamina E 66 y ácido ascórbico 59, estas sustancias actúan como antioxidantes en los procesos fisiológicos de degradación de los radicales superóxido e hidroxilo hasta oxígeno y agua; todas ellas administradas previamente al AMG disminuyeron la nefrotoxicidad. Estudios realizados con methimazol y aceite de pescado 67 mostraron que estas sustancias administradas por vía oral y simultáneamente con gentamicina, reducían los efectos secundarios de la misma, incluyendo nefrotoxicidad y sin comprometer la actividad antibiótica. El methimazol pudiera actuar como antioxidante a nivel renal, mientras que el aceite de pescado contrarrestaría algunas alteraciones lipídicas producidas por el AMG. Otros trabajos que apoyan el papel de los radicales libres en la nefrotoxicidad son los realizados con la enzima superóxido dismutasa (SOD) 68, 69. Esta enzima es clave en el proceso fisiológico de eliminación de radicales libres y se ha evidenciado que la actividad de la misma está disminuida en los tratamientos con gentamicina, lo cual justificaría que el incremento en la producción de radicales libres contribuyera a los efectos tóxicos renales; de hecho la administración de la SOD revirtió, al menos en parte, la nefrotoxicidad. A pesar de la falta de acuerdo sobre este punto, son numerosos los estudios en los cuales se evidencia que la administración de antioxidantes protege frente al daño renal producido por AMG. La implicación de factores vasoconstrictores como causantes de la disminución del flujo sanguíneo renal y posterior aparición del fracaso renal agudo en respuesta al tratamiento con AMG, ha sido ampliamente documentada con estos compuestos. La gentamicina activa el sistema renina-angiotensina 70, por lo que la administración de corticoides, inhibidores del sistema renina-angiotensina, atenua la nefropatía producida por la misma 71, también se ha encontrado una elevación de la renina glomerular incluso una semana después de finalizar el tratamiento 72. La liberación de endotelina, otro mediador vasoconstrictor, podría estar implicado en la nefrotoxicidad por administración de AMG 73. Se ha visto como la endotelina es liberada por las células endoteliales en respuesta a una estimulación de angiotensina II. El mecanismo por el cual la angiotensina II induce un incremento de endotelina parece estar relacionado con una movilización de calcio intracelular y activación de la proteína kinasa C en células endoteliales 74. La estimulación de la síntesis y liberación de PAF también se ha relacionado con el daño renal como ya se ha indicado 40, 41. Otro de los efectos que esperaría encontrarse como causantes de vasoconstricción, sería la inhibición de factores vasoactivos como el óxido nítrico, sin embargo estudios hechos en nuestro laboratorio han demostrado el efecto contrario, es decir, una producción glomerular aumentada de NO en ratas tratadas con gentamicina 75, 76, cuya función renal se deterioró cuando se le administraba un inhibidor de la síntesis de NO (L-NAME) 77, estos resultados sugieren que el NO, cuya síntesis está estimulada por gentamicina, podría tener la función de proteger al riñón de la vasoconstricción e isquemia que produce este agente nefrotóxico. A nivel glomerular, los AMG inducen un descenso en la tasa de filtración glomerular (TFG), del flujo plasmático renal (FPR) y del coeficiente de ultrafiltración (Kf), e incrementan la resistencia glomerular 411 A. I. MORALES y cols. aferente y eferente 78. Schor y cols.79, han observado que la disminución de la TFG inducida por estos antibióticos es debida a un marcado descenso en el Kf, sugiriendo así una nueva alternativa fisiopatológica a la nefrotoxicidad inducida por los mismos. Varios autores han relacionado la disminución de Kf con la contracción de células mesangiales inducida por sustancias vasoactivas 80. Se ha comprobado que el descenso del Kf es similar al provocado por la infusión de angiotensina II 81 y que la administración de un inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina I (captopril) durante el período de administración de los AMG, evita la reducción del Kf 78. Luft y cols. 82, han demostrado el efecto beneficioso del captopril en la insficiencia renal inducida por estos agentes, pese a que el daño histológico tubular es similar. Por tanto, la reducción de Kf parece ser secundaria a la generación intrarrenal de angiotensina II 79. Por otra parte, se ha visto que el efecto de los AMG sobre la hemodinámica glomerular está mediado por la liberación de sustancias vasoactivas como el PAF, habiéndose podido comprobar que sustancias antagonistas de PAF producen un aumento en el Kf 83. En base a los estudios realizados sobre los posibles mecanismos de acción implicados en la nefrotoxicidad por AMG, se han desarrollado estrategias clínicas y experimentales con el fin de disminuir la toxicidad y aumentar la seguridad de estos compuestos. La administración de agentes protectores (tabla I) ha sido uno de los objetivos de los últimos años y parece tener un futuro prometedor en la práctica clínica, de cara a disminuir, retrasar o abolir la nefrotoxicidad de los AMG. BIBLIOGRAFÍA 1. Silverblatt FJ, Kuehn C: Autoradiography of gentamicin uptake by the rat proximal tubular cell. Kidney Int 15: 335-345, 1979. 2. Lipsky JJ, Cheng L, Saktor B, Lietman PS: Gentamicin uptake by renal tubule brush border membrane vesicles. J Pharmacol Exp Ther 215: 390-393, 1980. 3. Sastrasinh M, Kanauss TC, Weinberg JM, Humes HD: Identification of aminoglycoside binding site in rat renal brush border membranes. J Pharmacol Exp Ther 222: 350-358, 1982. 4. Senekjian HO, Knight TF, Weinman EJ: Micropuncture study of the handing of gentamicin by the rat kidney. Kidney Int 19: 416-423, 1981. 5. Pastoriza-Muñoz E, Bowman RL, Kaloyanides GJ: Renal tubular transport of gentamicin in the rat. Kidney Int 16: 440450, 1979. 6. 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