NEFROLOGÍA. Vol. XXIII. Suplemento 3. 2003 Mecanismos del daño endotelial en la microangiopatía trombótica M. P. Ruiz-Torres1, F. Casighari2, M. Noris2, D. Macconi2, M. Galbusera2 y G. Remuzzi2 1 Departamento de Fisiología. Universidad de Alcalá de Henares. Madrid. 2Instituto Mario Negri. Bergamo. Italia. INTRODUCCIÓN La Púrpura Trombocitopénica Trombótica (PTT) y el Síndrome Hemolítico Urémico (SHU) pertenecen al grupo de las microangiopatías trombóticas. Son enfermedades que cursan con anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia y se caracterizan por la formación de trombos en capilares y arteriolas de la microcirculación. En la PTT los agregados plaquetares obstruyen reversiblemente las arteriolas y capilares de varios órganos y producen isquemia y en ocasiones infarto, en el 50-70% de los casos de PTT el órgano afectado es el cerebro 1. En el SHU los trombos se forman predominantemente, pero no exclusivamente, en el riñón. Sin embargo, la realidad clínica es que pacientes con PTT pueden tener afectación renal, y a su vez en pacientes con SHU se puede encontrar afectación de algún otro órgano, por lo que la distinción entre los síndromes es dificultosa y actualmente se tiende a considerar ambos síndromes como diversas manifestaciones de la misma enfermedad, denominándose SHU/PTT. La etiología de estos desórdenes microvasculares es variada, el 90% de los casos de SHU afectan a niños pequeños, está precedido de diarrea y causado por una toxina derivada de Shigella Dysenteriae serotipo I o, más comúnmente, de distintos serotipos de E. Coli 2, 3 En estos casos el pronóstico es bueno sin necesidad de realizar plasmaféresis, que es el tratamiento de elección en adultos. Sin embargo, la enfermedad puede aparecer por otras causas, generalmente en adultos, de forma esporádica o recurrente, con un pronóstico no tan bueno. Entre las causas parece ser que podrían estar implicada una deficiencia congénita en el factor H del sistema del complemento4, y, en otros casos deficien- Correspondencia: María Piedad Ruiz Torres Departamento de Fisiología Facultad de Medicina Universidad de Alcalá de Henares Ctra. Barcelona, km. 33,600 28871 Alcalá de Henares (Madrid) cias en la proteína que rompe el factor von Willebrand (vWF) con lo que se generan fragmentos ultralargos (UL-vWF) que no funcionan correctamente induciendo la agregación plaquetar y la formación de trombos 5, 6. Por último, existen formas de SHU/PTT ligadas a la toxicidad de distintos fármacos como la ciclosporina A, la mitomicina y agentes quimioterapéuticos, y otras formas que aparecen secundariamente asociadas a procesos como el embarazo. El daño endotelial, independientemente del origen de la enfermedad, parece jugar un papel central en el desarrollo de las lesiones típicas del SHU/PTT, mediante la alteración tanto de sus propiedades sintéticas como antitrombogénicas 7. Sin embargo, los mecanismos responsables de este daño endotelial no se conocen con precisión. En principio, parece ser que el daño está producido por sustancias que están en circulación en el plasma o en el suero de los pacientes. Estudios recientes apuntan a que el daño endotelial pueda derivar de la activación de los neutrófilos con la consecuente liberación de sustancias tóxicas, entre las que cabe destacar los radicales libres del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS) y distintas proteasas, ya que su producción se ha visto incrementada en pacientes SHU/PTT 8 y estas sustancias liberadas en el suero pueden provocar daño endotelial 9, 10. Por otro lado, otros compuestos presentes en el suero pueden dañar las células endoteliales, es el caso del sistema del complemento, niveles reducidos de C3 se han encontrado en el suero de estos pacientes 4, lo que implica una activación del sistema. En el trabajo que aquí se presenta se pretende clarificar los mecanismos implicados en el daño endotelial y la consecuente formación de trombos en pacientes con formas adultas de SHU/PTT, con particular interés en el papel de los compuestos liberados por los neutrófilos y el sistema del complemento. Por último se trata de comprobar in vivo las evidencias obtenidas con los estudios in vitro, es decir, la presencia de daño oxidativo y de la activación del sistema del complemento en cortes histológicos realizados a partir de biopsias renales de pacientes SHU/PTT. 25 M. P. RUIZ-TORRES y cols. PAPEL DE LOS NEUTRÓFILOS Y OTRAS SUSTANCIAS CIRCULANTES EN EL DAÑO ENDOTELIAL El suero y los neutrófilos fueron aislados de pacientes con formas adultas de SHU/PTT en dos momentos diferentes, en primer lugar en la fase aguda, antes de comenzar cualquier tratamiento y posteriormente cuando el episodio estaba en remisión, al menos 15 días después de finalizar el tratamiento. El daño endotelial se evaluó, mediante un ensayo de citotoxicidad por liberación de 51Cr. Para ello células de microendotelio humanas de origen dermal (HMEC-1) 11 se pusieron en contacto con el suero o los neutrófilos aislados de los pacientes durante 4 horas. Todos los experimentos se realizaron en paralelo con neutrófilos y suero extraído de voluntarios sanos de la misma edad y sexo. Los resultados muestran que el suero de los pacientes en fase aguda produce un marcado efecto citotóxico sobre las HMEC-1, mientras que los neutrófilos de los mismos pacientes producen sólo una moderada citotoxicidad. Sorprendentemente, cuando las células se preincubaban con el suero del paciente (4 horas) y posteriormente se incubaban con los neutrófilos extraídos del mismo paciente (4 horas más), la toxicidad aumentaba aproximadamente el doble. Cuando los mismos pacientes eran estudiados en remisión tanto el suero como los neutrófilos no ejercían toxicidad sobre las células. Con el fin de determinar los mecanismos por los cuales se producen estos efectos se evaluó la toxicidad en presencia de inhibidores de los radicales libres y proteinasas liberadas por los neutrófilos, concretamente catalasa (enzima encargada de detoxificar el peróxido de hidrógeno), taurina (scavenger del ácido hipocloroso), BB3103 (inhibidor de metaloproteinasas) y 1-antitripsina (inhibidor de elastasa). Estos compuestos no evitaron la citotoxicidad producida por el suero, pero si la provocada por los neutrófilos. En el caso de la catalasa y la taurina la toxicidad disminuyó en un 50%, mientras que la inhibición con los inhibidores de protesasa fue casi del 100%. Se usaron también inhibidores de los RNS, urato y Ebselen, pero no disminuyeron la toxicidad del suero ni la de los neutrófilos. Estos resultados indican claramente el importante papel que juegan los productos liberados por los neutrófilos en el daño endotelial propio del SHU/PTT, pero la acción debe ser local ya que no modifican la toxicidad del suero. En cuanto a la toxicidad ejercida por el suero de los pacientes en fase aguda, se planteó la posibilidad de que fuera producto de la acción del sistema del complemento ya que previamente se ha26 bían evaluado los valores del tercer componente, C3, en los pacientes estudiados, encontrándose una disminución significativa de los valores respecto a los valores de los mismos pacientes en fase de remisión y controles sanos. Este hecho es indicativo de la activación del complemento. Por ello se realizaron los ensayos de citotoxicidad inhibiendo el sistema del complemento mediante inactivación por calor o añadiendo un inhibidor específico, el receptor del complemento-1 soluble (sCR-1). Los resultados obtenidos mostraron de forma definitiva, la inhibición de la toxicidad fue del 100%, que el componente tóxico presente durante la fase aguda en los pacientes SHU/PTT era el sistema del complemento. EFECTO DE LOS NEUTRÓFILOS Y EL SUERO DE LOS PACIENTES SHU/PTT EN LA FORMACIÓN DE TROMBOS Para evaluar si las modificaciones bioquímicas provocadas por el suero y los neutrófilos aislados de pacientes SHU/PTT sobre células de microendotelio en cultivo (HMEC-1) pueden provocar un incremento de la agregación plaquetar y la formación de trombos, característica de la enfermedad, se plantearon los siguientes experimentos de adhesión. Las HMEC-1 se cultivaron sobre portas y se dejaron crecer hasta confluencia. Posteriormente se incubaron con el suero de los pacientes o de los controles sanos durante 4 horas a 37 °C. Otros portas se incubaron con los neutrófilos extraídos del mismo paciente o del control sano durante 2 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, las células fueron perfundidas con sangre entera, procedente de un donante sano, marcada con mepacrina, mediante un sistema que permite la perfusión continua de un flujo laminar a una velocidad constante. La perfusión se realizó a 60 dyn/cm2 durante 3,5 minutos. Finalmente los portas fueron fijados con acetona y la formación de trombos se evaluó mediante microscopía confocal, analizándose el área ocupada por los trombos con el software Image v1.6 (NIH, Bethesda, MD, USA). Los resultados mostraron que el suero de los pacientes en fase aguda provoca un incremento de tres veces en el área ocupada por los trombos respecto del suero control. De igual forma sucedió cuando las células se incubaron con los neutrófilos aislados de esos mismos pacientes, aumentándose el doble la formación de trombos respecto del control. Cuando los pacientes se estudiaron en la fase de remisión los valores en cuanto a la formación de trombos volvieron a ser similares a los de los controles sanos. MECANISMOS DEL DAÑO ENDOTELIAL EN LA MICROANGIOPATÍA TROMBÓTICA Con el fin de delimitar la responsabilidad de las sustancias liberadas por los neutrófilos en este efecto, los experimentos se repitieron en presencia de un inhibidor de los radicales libres, catalasa, y en presencia del inhibidor de metaloproteinasas BB3301. La adición de catalasa redujo un 75% la formación de trombos provocada por los neutrófilos de los pacientes en fase aguda, mientras que con la adición de BB3301 la inhibición fue aproximadamente del 50%. Estos datos indican que el efecto de los neutrófilos en la formación de trombos está mediado por la liberación de ROS y metaloproteinasas. Ninguno de estos inhibidores funcionó cuando se añadieron al suero de los pacientes, sin embargo cuando se inhibió el sistema del complemento mediante inactivación por calor o usando sCR-1 la formación de trombos producida por el suero de los pacientes en fase aguda fue completamente inhibida. ESTUDIOS EN BIOPSIAS RENALES Si los neutrófilos están implicados en el daño endotelial, a través de la liberación, entre otras sustancias, de ROS y RNS, se deben apreciar signos de daño oxidativo en el riñón de pacientes SHU/PTT. Por ello se examinaron biopsias renales de pacientes con formas adultas de la enfermedad, realizándose inmunohistoquímica para nitrotirosina (nitroTyr), como índice de nitración de proteínas, e hidroxinonenal-lisina (HNE-Lys) como índice de peroxidación lipídica comparándolas con secciones de riñones sanos que son usados posteriormente para trasplante. Las secciones estudiadas mostraron las lesiones típicas de la enfermedad, engrosamiento del espacio subendotelial en arteriolas, trombosis intravascular en capilares y arteriolas y presencia de infiltrados leucocitarios en el espacio intraglobular. Los resultados mostraron una fuerte tinción para nitroTyr y HNE-Lys y por tanto un importante daño oxidativo en todos los cortes estudiados a nivel, no solo de endotelio, sino de glomérulos y túbulos, mientras que en los controles estudiados la tinción fue prácticamente negativa. Por otro lado se estudió en biopsias renales de pacientes SHU/PTT la existencia de depósitos de C3, para ello se realizó una inmunohistoquímica con una anticuerpo anti-C3c humano producido en conejo y conjugado con fluoresceína (FICT). Los cortes procedentes de riñones con SHU/PTT mostraron grandes depósitos de C3c en glomérulos y arteriolas, indicando claramente que el complemento está activado en estos pacientes. SUMARIO El daño endotelial propio del SHU/PTT es provocado, al menos en parte, por los ROS (peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso) y proteasas (elastasa y metaloproteinasas principalmente) liberados por los neutrófilos de los pacientes y por la activación del sistema del complemento. La consecuencia de este daño endotelial es una mayor formación de trombos cuando las células son incubadas con el suero o los neutrófilos de los pacientes en fase aguda. Estos resultados se validaron al encontrar un alto índice de daño oxidativo en cortes procedentes de biopsias renales de pacientes SHU/PTT y grandes depósitos del sistema del complemento. BIBLIOGRAFÍA 1. Moake JL: Haemolytic-uraemic sindrome: basic science. The Lancet 43: 393-397, 1994. 2. Kaplan BS, Proesman W: The haemolytic uremic syndrome of childhood and its variants. Semin Hematol 24: 1408-88, 1987. 3. Cleary TG: Cytotoxin producing E coli and the haemolytic uremic syndrome. Pediatr Clin North Am 35: 485-501, 1988. 4. Noris M, Ruggenenti P, Perna A, Orisio S, Caprioli J, Skerza C, Vasile B, Zipfel PF, Remuzzi G: Hypocomplementemia, discloses genetic predispostion to haemolytic uremis syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura: role of factor H abnormalities. J Am Soc Nephrol 10: 281-293, 1999. 5. Tsai HM, Lian ECY: Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med 339: 1585-1594, 1998. 6. Galbusera M, Benigni A, Paris S, Ruggenenti P, Zoja C, Rossi Ch, Remuzzi G: Unreconognized pattern of von Willebrand factor abnormalities in haemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocitopenic purpura. J Am Soc Nephrol 10: 1223-1241, 1999. 7. Habib R: Pathology of the haemolytic uremic syndrome. En: Kaplan BS, Trompeter RS , Moake JL, eds. Hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. New York: Marcel Dekker, 315-53, 1992. 8. Noris M, Ruggenenti P, Todeschini M, Macconi D, Zoja C, Paris S, Gaspari F, Remuzzi G: Increased nitric oxide formation in recurrent thrombotic microangiopathies: a possible mediator of microvascular injury. Am J Kidney Dis 27: 790796, 1996. 9. Sacks T, Moldow CF, Craddock PR, Bowers TK, Jacob HS: Oxygen radicals mediate endothelial damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J Clin Invest 61: 1161-1167, 1978. 10. Ward PA: Mechanisms of endothelial cell injury. J Lab Clin Med 118: 421-426, 1991. 11. Mitra D, Jaffe EA, Weksler B, Hajjar KA, Soderland C, Laurence J: Thrombotic thrombocytopenic purpura and sporadic hemolytic uremic syndrome plasmas induce apoptosis in restricted lineages of human microvascular endothelial cells. Blood 89: 1224-1234, 1997. 27