NEFROLOGIA. Vol. XV. Suplemento 1, 1995 NEFROTOXICIDAD: ANALISIS DE MECANISMOS BASICOS Mecanismos básicos de nefrotoxicidad L. Rivas-Cabañero, A. Rodríguez-Barbero, N. Eleno y J. M. López-Novoa Instituto Reina Sofia de Investigación Nefrológica. Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca, Salamanca (España). Introducción E l desarrollo de nuevos y potentes fármacos ha supuesto un avance importante en el tratamiento int r a h o s p i t a l a r i o de enfermedades hasta hace poco tiempo mortales. Sin embargo, algunos de estos tratamientos son causa de una elevada morbilidad por la toxicidad que producen. La consecuencia de la toxicidad renal de estos fármacos y de otros agentes tóxicos que pueden ser accidentalmente ingeridos (sales de metales pesados, hidrocarburos, toxinas vegetales o bacterianas) es la aparición de una insuficiencia o fallo renal agudo (FRA). En esta revisión analizaremos cómo los agentes tóxicos actúan sobre el riñón y sus mecanismos de acción a nivel celular. Las sustancias químicas utilizadas de forma habitual en el tratamiento médico son una de las causas más frecuentes de FRA en la actualidad. Para poder entender mejor los mecanismos por los que la nefrotoxicidad conduce a un FRA hay que poner de manifiesto que el FRA es un síndrome multifactorial en el que se ponen de manifiesto factores vasculares/glomerulares y factores tubulares (fig. 1). Los efectos glomerulares de una sustancia nefrotóxica se manifiestan como una disminución del coeficiente de ultrafiltración (Kf) (que puede estar provocado por alteraciones en la permebilidad hidráulica de la barrera de filtración o por la activación de contracción y proliferación de las células mesangiales intraglomerulares). Las nefrotoxinas actúan sobre los vasos sanguíneos produciendo una disminución del flujo sanguíneo renal (FSR). En el túbulo, la nefrotoxina provoca necrosis celular por distintos mecanismos que se desarrollarán más adelante, conduciendo a una obstrucción tubular y a un «backleak» o esca- pe del líquido desde la luz tubular. La disminución del FSR y la obstrucción tubular tienen un efecto negativo sobre el gradiente de presión hidrostática en el glomérulo. El descenso de la presión efectiva de ultrafiltración, la disminución del Kf y el «backleak» d e l líquido tubular producen como resultado final una disminución en la tasa de filtración glomerular (FG). Los fármacos nefrotóxicos más importantes (antibióticos aminoglucósidos, cisplatino y ciclosporina) ejercen sus efectos fundamentalmente en el túbulo proximal. FRA Efectos glomerulares/vasculares Efectos tubulares Kf FSR Necrosis Obstrucción P Backleak FG Fig. 1.­Mecanismos que conducen a la disminución del filtrado glomerular durante el daño renal. Abreviaturas: Kf: Coeficiente de u l t r a f i l t a c i ó n ; FSR: Flujo sanguíneo renal; P: Presión neta de ultrafiltración; FG: Tasa de filtración glomerular. Correspondencia: Prof. José M. López-Novoa. Departamento de Fisiología y Farmacología, Edificio Departamental, Campus Miguel de Unamuno. Universidad de Salamanca. Avenida Campo Charro, s/n. 37007 Salamanca (España). L a actividad terapéutica o tóxica de un fármaco depende de la dosis, de la pauta de administración y de otros parámetros farmacocinéticos que determi- 44 MECANISMOS DE NEFROTOXICIDAD nan la concentración del principio activo en el tejido diana. Otro de los factores que pueden determinar la acción tóxica de un fármaco es la susceptibilidad relativa de las células, que puede aumentar cuando se encuentran expuestas a determinadas condiciones fisiopatológicas o patológicas, como, por ejemplo, la isquemia. El riñón es particularmente vulnerable a la a c c i ó n de fármacos y toxinas, ya que es el órgano que recibe mayor irrigación por gramo de tejido y es la principal vía de eliminación de fármacos y de sus metabolitos. Distintos segmentos de la nefrona pueden estar expuestos a los efectos de un fármaco o de sus metabolitos, dependiendo de los diferentes mecanismos que median su eliminación. Ciertos fármacos se secretan en las células del túbulo proximal a través del sistema transportador de cationes orgánicos, y otros se absorben activamente en estas mismas células. En consecuencia, estas células están expuestas a concentraciones elevadas de agentes potencialmente tóxicos. Además, se pueden alcanzar concentraciones mucho más elevadas de los agentes tóxicos en la luz tubular de la nefrona que en la sangre por la capacidad del riñón para concentrar la orina. Hay ocasiones en que la absorción fraccional de agua excede a la del fármaco, lo que provoca un aumento en la concentración luminal del mismo. La entrada del fármaco en la célula y su transformación en metabolitos activos se facilita por mecanismos como el transporte iónico y el metabolismo de la célula renal. En ocasiones, el efecto tóxico de un fármaco deriva de que durante el proceso de excreción renal éste sufre la transformación en un metabolito activo por una amplia variedad de enzimas que catalizan dos tipos de reacciones 1, 2. Las reacciones de fase I (oxidaciones, reducciones e hidrólisis) generan productos altamente reactivos y potencialmente tóxicos. Estas reacciones suelen encontrarse acopladas a reacciones de fase II (sintéticas y de conj u g a c i ó n ) , dando lugar a productos muy polares y biológicamente inactivos que pueden ser excretados fácilmente a través de la orina. El mecanismo óptimo para la protección celular frente a las reacciones de fase I es que las células posean los dos sistemas metabólicos, lo que no ocurre en los diversos tipos celulares del riñón. Este perfil metabólico heterogéneo explica la susceptibilidad de ciertas áreas del riñón al daño producido por diversas sustancias tóxicas. Las sustancias tóxicas que se activan por enzimas de fase I afectan preferentemente al segmento S3 del túbulo renal, que es rico en este tipo de enzimas 3. En resumen, el que una célula renal sea especialmente vulnerable a la acción de una nefrotoxina depende de si la célula renal es diana para la acción del fármaco, el fármaco se biotransforma en las células renales, el fármaco se concentra en la orina, se capta y se acumula en estas células renales, existen procesos concomitantes que aumenten la susceptibilidad de estas células renales (por ejemplo, la isquemia que se pone de manifiesto en tratamientos con aminoglucósidos). Mecanismos celulares de nefrotoxicidad Una sustancia nefrotóxica puede ejercer su efecto sobre la célula renal bien de forma directa (por unión a la membrana plasmática o captación celular), bien de forma indirecta (por liberación de mediadores vasoactivos y producción de isquemia). La citotoxicidad directa es la causa más común de nefrotoxicidad, aunque la isquemia concomitante es capaz de a g r a v a r el efecto tóxico renal de una determinada sustancia. Efecto tóxico directo sobre las células renales Las sustancias nefrotóxicas pueden interaccionar con los componentes de la membrana plasmática o pueden ser captadas por las células renales, ejerciendo así sus acciones tóxicas a nivel intracelular 4. Algunas nefrotoxinas producen el daño celular interactuando con la membrana de la célula tubular, mientras que otras, como la ciclosporina de carácter h i d r o f ó b i c o , se une a los lípidos de membrana sin aparentes efectos adversos 5, 6. El daño celular se manifiesta en alteraciones morfológicas y funcionales de las células renales. Cuando un tóxico interacciona con los componentes de la membrana plasmática de las células renales altera tanto la permeabilidad de la membrana como la actividad de sus sistemas de transporte. Esto provoca cambios en la concentración citosólica de iones y otras sustancias que discutiremos más adelante. La unión del tóxico a las membranas también puede originar la activación de las enzimas asociadas a ellas. Así, podríamos destacar: ­ La fosfolipasa A2, cuya activación induce las síntesis de eicosanoides y de factor activador de las plaquetas (PAF) 7. ­ L a fosfolipasa C, que induce la liberación de inositol trifosfato (IP3) y de diacilglicerol (DAG) a partir de PIP3. ­ La fosfolipasa D, que favorece la liberación de DAG. Los aumentos intracelulares de IP3 activan la salida de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, aumentando de e s t a forma los niveles de Ca 2 + c i t o s ó l i c o libre. El 45 L. RIVAS y cols. DAG estimula a la proteína kinasa C (PKC), que es capaz de activar enzimas celulares por fosforilación. En ambos casos se produce una activación celular q u e , si no tiene un adecuado soporte energético (ATP), puede tener efectos deletéreos para la célula. Como ya hemos señalado anteriormente, las nefrotoxinas pueden ejercen su acción al ser captadas por l a s células. Si esto ocurre se ponen de manifiesto efectos sobre la función lisosomal y mitocondrial. Procesos lisosomales. Los lisosomas sirven de lugar de almacenamiento para diversas sustancias. Así, los aminoglucósidos se unen a la membrana apical de las células del túbulo proximal por interacciones de carga y se transportan a través de ella por pinocitosis concentrándose en los lisosomas 8. Algunas nefrotoxinas, entre ellas los aminoglucósidos, modifican las propiedades biofísicas de los lisosomas: se altera la permeabilidad de su membrana y se estimula la agregación de membranas 9. Esto ocasiona la liberación de las enzimas lisosomales 10, produciéndose fosfolipidosis, destrucción del lisosoma y subsecuentemente necrosis celular. Estudios de autorradiografía han demostrado la presencia de aminoglucósidos en vacuolas intracelulares próximas a la membrana tras la administración del antibiótico 8. También se ha observado la formación de cuerpos mieloides osmiofílicos multilamelares, aunque aparentemente no son tóxicos 10. Otros fármacos catiónicos, como cloroquina, antidepresivos tricíclicos y clorpromazina, pueden producir cambios morfológicos similares, pero sin nefrotoxicidad aparente. Por lo tanto, estos cambios pueden no estar relacionados con el daño celular, representando la activación de mecanismos normales de fagocitosis celular 11. Procesos mitocondriales. La mitocondria de la cél u l a tubular renal es el lugar de acción de muchas nefrotoxinas 12. Estas interfieren con la fosforilación oxidativa y la consiguiente producción de ATP, alterando las funciones de transporte celular dependientes del mismo y produciendo muerte celular. Existen evidencias de necrosis celular tras depleción de ATP e n modelos experimentales de nefrotoxicidad por cloruro de mercurio, gentamicina y cisplatino 13. Otro posible mecanismo de nefrotoxicidad es la formación de metabolitos intracelulares altamente reactivos, como son los radicales libres de oxígeno, cuyas implicaciones biológicas han sido ya descritas 14, 15. Los radicales libres formados durante las reacciones oxidativas por oxidasas asociadas al citocromo P-450 y las xantino oxidasas (radicales hidroxilo, superóxido y peróxido de hidrógeno) pueden generar moléculas muy inestables a partir de fármacos y pueden 46 reaccionar químicamente con macromoléculas celulares como proteínas y ácidos nucleicos, produciend o daño celular por modificaciones covalentes 16. Así, el metabolismo del ácido araquidónico por ciclooxigenasas o hidroperoxidasas pueden co-oxidar fármacos como el acetaminofeno, produciendo radicales libres en la médula renal 17; este proceso puede jugar un importante papel en la nefropatía por analgésicos. Existen diversos mecanismos a nivel intracelular cuya función es disminuir los efectos adversos de estos radicales libres. Así, las enzimas superóxido dismutasa y catalasa aumentan la conversión del radical superóxido en agua y oxígeno molecular, y la glutatión peroxidasa reduce el peróxido de hidrógeno. Es difícil establecer si la producción de radicales libres y la disminución de su eliminación por el riñón es causa o efecto del daño celular. Se han encontrado evidencias del papel de estos radicales en la nefrotoxicidad por acetaminofeno 18 y cefalosporinas 19, mientras que en la nefrotoxicidad por aminoglucósid o s , cisplatino o ciclosporina es más incierto. En cualquier caso, el papel concreto de los radicales lib r e s en este fenómeno se detalla extensamente en otro artículo de este número. Papel del calcio en la toxicidad celular Existe un gradiente de calcio entre el interior y el exterior celular que se mantiene por la baja permeabilidad al calcio de la membrana plasmática en condiciones basales. Los agentes nefrotóxicos inducen un aumento del calcio citosólico libre ([Ca 2+]c) por dos mecanismos fundamentales: inducen un aumento de la permeabilidad de la membrana al mismo y disminuyen tanto la recaptación de calcio por el retículo sarcoplásmico como el bombeo de calcio al ext e r i o r , al haber una disminución del ATP celular. Ambos procesos están mediados por la Ca2+/ATPasa. Los niveles aumentados de calcio intracelular ponen en marcha mecanismos de extrusión de calcio dependientes de energía 20 como la Ca2+/ATPasa del sarcolema, procesos mitocondriales de captación de calcio y activación de proteínas contráctiles. Todos estos mecanismos deplecionan a la célula de ATP. Es bien conocido que el calcio regula muchas funciones celulares 21. Se ha sugerido que un aumento no fisiológico en el [Ca2+]c es causa primaria de daño celular irreversible. Un aumento en [Ca2+]c se asocia con dañ o celular debido a toxinas que actúan sobre la membrana 22. La captación de calcio por la mitocondria produce desacoplamiento de la fosforilación oxidativa 23. El aumento en [Ca2+]c activa diversas fosfolipasas de la membrana mitocondrial 24 y plasmática. L a activación de las fosfolipasas de la membrana plasmática provoca cambios en los fosfolípidos de MECANISMOS DE NEFROTOXICIDAD membrana, alterando la actividad enzimática de la m e m b r a n a 25 y la permeabilidad. Este daño se ve agravado porque la actividad de las fosfolipasas también aumenta la producción y liberación de ácidos g r a s o s y de lisofosfolípidos, que tienen actividad d e t e r g e n t e y desnaturalizan las membranas. Además, los ácidos grasos liberados producen otros efectos como el desacoplamiento de la fosforilación e n la membrana mitocondrial, inhibición de la N a +/ K +- A T P a s a de la membrana plasmática e inhibición de la Ca2+/ATPasa del retículo sarcoplásmico. Además, los ácidos grasos poliinsaturados se pueden peroxidar, dando lugar a peróxidos lipídicos tóxicos, y el ácido araquidónico liberado se metaboliza por la vía de la lipo y ciclooxigenasa, liberando sustancias que aumentan el tono vascular y, por tanto, producen isquemia que incrementa la susceptibilidad celular al daño producido por el tóxico. La activación de la fosfolipasa A2 de las membranas mitocondriales, entre otras cosas, degrada cardiolipinas, que constituyen la subunidad catalítica de enzimas importantes, como la citocromo oxidasa 26, A T P sintetasa 27 y la translocasa de nucleótidos de adenina 28. Estas enzimas son vitales para la célula y la falta de ellas es causa de muerte celular. La activación de la fosfolipasa C estimula la degradación de lecitina; esto inhibe el complejo succinato deshidrogenasa 29. El aumento de los niveles de [Ca2+]c produce además otros efectos, como la activación de gelsoína, q u e disuelve la red de actina o la activación del complejo calcio-calmodulina 31 que favorece la desagregación de microtúbulos. El calcio, además, potencia el daño inducido por los radicales libres, de los que hemos hablado con amplitud anteriormente. E n resumen, los efectos celulares de los agentes nefrotóxicos se recogen en la figura 2. Membrana Citosol ATP Lisosoma Lisosoma Necrosis F i g . 2.­Mecanismos de acción intracelulares de un agente nefrotóxico. Abreviaturas: T: Agente nefrotóxico: E: Enzima de membrana; A, B: Sustratos transportados; C, D: Productos de actividad enzimática. Nefrotoxicidad indirecta Ya hemos comentado anteriormente que en muchos casos una parte sustancial del efecto tóxico ren a l de muchas sustancias se debe a que inducen también una reducción notable del FSR. En la mayor parte de los casos en que esto ocurre, el efecto del tóxico no es directo sobre el músculo liso vascular, sino que está mediado por la liberación de factores vasoconstrictores (PAF, Ang II, endotelina) o por la inhibición de factores vasodilatadores (NO). Con respecto a la liberación de factores vasoconstrictores, la liberación de endotelina parece mediar las alteraciones renales que ocurren tras la administración de ciclosporina 31 o tras la isquemia renal. La estimulación de la síntesis y liberación de PAF también se ha relacionado con la nefrotoxicidad inducida por ciclospo- rina 32, gentamicina 33, 34 y cisplatino 34, mientras que la angiotensina II se ha involucrado en la reducción del FG inducido por la gentamicina 35. Otra de las posibilidades de que un agente produzca efecto nefrotóxico es que disminuya la producción de NO. Esto se ha demostrado en modelos de nefrotoxicidad inducida por contrastes iodados 36. Sin embargo, datos de nuestro laboratorio han demostrado una producción glomerular aumentada de NO en ratas tratadas con gentamicina 37, 38. Además, cuando se administra L-NAME (un inhibidor de la síntesis de NO) en el agua de bebida a ratas tratadas con gentamicina, se observa mayor daño de la función renal que en las ratas que reciben solamente gentamicina 38. Estos resultados sugieren que el NO, cuya síntesis está estimulada por la gentamicina, podría tener la función de proteger al riñón de la vasoconstricción e isquemia que induce este agente nefrotóxico. Bibliografía 1. Anders MW: Metabolism of drugs by the kidney. Kidney Int 18:636-647, 1980. 47 L. RIVAS y cols. 2. Tarloff JB, Goldstein RS y Hook JB: Xenobiotic metabolism in the mammalian kidney. 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