NEFROLOGÍA. Vol. XXIII. Suplemento 3. 2003 La ruta de señalización CA++/ Calcineurina/NFAT en activación endotelial y angiogénesis: efectos de la ciclosporina A A. J. Quesada y J. M. Redondo Centro de Biología Molecular «Severo Ochoa». Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Universidad Autónoma de Madrid y Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). INTRODUCCIÓN NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells), se identificó en un principio en células T como un complejo inducible que se unía al elemento de respuesta a antígeno en el promotor del gen de la IL2, y cuya unión al DNA y efectos transactivadores eran bloqueados por las drogas inmunosupresoras Ciclosporina A (CsA) y FK506 1. En los últimos años, se ha identificado la presencia de miembros de la familia NFAT en distintos tipos celulares, dentro y fuera del sistema inmune, donde regulan la expresión de numerosos genes entre los que se encuentran los que codifican para citocinas (IL-2, IL-4, TNF-, GM-CSF) y receptores de superficie (FasL, CD40L) 2-5. La activación de múltiples receptores extracelulares que originan incrementos del Ca++ intracelular conduce a la activación de la fosfatasa calcineurina (dependiente de Ca++ y calmodulina) que desfosforila a NFAT (fig. 1). La translocación al núcleo, el aumento de afinidad para unirse al ADN, y la inducción de la actividad transcripcional de NFAT, se inician con esta desfosforilación que promueve cambios conformacionales en el factor que permiten la exposición de sus secuencias de localización nuclear (NLS). NFAT se transloca al núcleo acomplejado con la calcineurina, la cual, continúa desfosforilando y activando a NFAT mientras las señales de calcio se mantienen 6, 7 (fig. 1). En estas condiciones, distintas quinasas activadas fosforilan al factor e inducen la exportación de NFAT al citoplasma. Así, el balance entre la acti- Correspondencia: Antonio Jesús Quesada Centro de Biología Molecular «Severo Ochoa» Consejo Superior de Investigaciones Científicas Universidad Autónoma de Madrid Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Sinesio Delgado, 4 28049 Cantoblanco (Madrid) E-mail: jmredondo@cbm.uam.es vidad fosfatasa de la calcineurina, dependiente de los niveles de calcio disponibles, y de las quinasas implicadas, parece regular la localización celular de NFAT. En este contexto, se ha descrito que distintas quinasas como la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), la Caseina quinasa II (CKII), MEKK1, JNK, o p38, regulan la fosforilación y subsiguiente exportación de distintos miembros de NFAT al citosol (revisado en 8) (fig. 1). La acción de la CsA y del FK506, que son las principales drogas inmunosupresoras empleadas en los trasplantes de órganos, se justifica por la inhibición de la expresión de genes cuya transcripción esta regulada por NFAT y que son críticos para la respuesta inmune. El mecanismo de acción de estas drogas esta mediado por su acción inhibidora de la calcineurina. Este efecto no es directo, ya que la CsA y el FK506 se unen a las inmunofilinas celulares formando un complejo que inhibe la actividad fosfatasa de la calcineurina, y por tanto la desfosforilación de NFAT y su posterior translocación al núcleo 1, 4, (fig. 1). Sin embargo, el uso clínico de estas drogas es limitado, ya que presentan efectos nefrotóxicos y neurotóxicos derivados tanto de la inhibición de la actividad calcineurina en otros tipos celulares no pertenecientes al sistema inmune, como de su acción sobre otros substratos. Por ello, para obtener compuestos inmunosupresores aplicables a un amplio rango de situaciones clínicas, se han investigado exhaustivamente las rutas implicadas en la regulación de NFAT, para de esta manera, localizar dianas terapéuticas que permitan el diseño de agentes inmunosupresores que actúen selectivamente sobre el propio factor de transcripción 4, 9. Como hemos mencionado, estudios posteriores a la identificación inicial de NFAT en linfocitos permitieron establecer que NFAT era en realidad una familia de proteínas constituidas por al menos 4 miembros, NFATp, NFATc, NFAT3 y NFAT4, que se localizan en el citoplasma de células en reposo y que también se han denominado NFAT1/NFATC2, 44 LA RUTA DE SEÑALIZACIÓN CA++/CALCINEURINA/NFAT NFAT2/NFATC1, NFATC3 y NFATC4, respectivamente 7, 10. Además, más recientemente se ha identificado un nuevo miembro que presenta menos homología con el resto de los descritos, que se ha denominado NFAT5/TonE-BP y no está regulado por calcineurina 11. Todos los miembros caracterizados presentan dos regiones de secuencia homóloga entre ellos, el dominio de unión al ADN (DBD), y una región homóloga para NFAT (NHR) (con la excepción de NFAT5), situada en la zona amino-terminal de la molécula. En esta ultima región se han identificado las secuencias responsables de la localización subcelular y de las propiedades transactivadoras del factor 1-4, 6, 12, 13 (fig. 2). Si bien la presencia redundante de estos miembros en distintos tipos celulares en el adulto justifica la existencia de un fenotipo con pocas alteraciones reseñables en ratones deficientes en NFAT1, NFAT3 o NFAT4, es especialmente llamativo que los ratones deficientes en NFAT2 mueren durante el desarrollo embrionario debido a defectos en la formación de las válvulas cardíacas. Más recientemente se ha descrito que los dobles KO en NFAT3/NFAT4 presentan defectos en vascularización que conducen a letalidad durante el desarrollo embrionario 14 un fenotipo que también se observa en ratones deficientes en calcineurina, o en embriones de ratonas preñadas a las que se les administra CsA 14. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Nuestro trabajo ha permitido identificar que NFAT se regula fisiológicamente en células endoteliales primarias por VEGF, un factor considerado como el mediador más importante en la angiogénesis fisiológica y patológica. El proceso de la angiogénesis, o formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de preexistentes, tiene lugar de forma regulada durante el desarrollo embrionario y también está implicado en la cicatrización de heridas y procesos relacionados con funciones reproductoras en el adulto. Por otro lado, la angiogénesis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias crónicas y en cáncer. VEGF es un mitógeno muy potente de células endoteliales y juega un papel crucial en angiogénesis tanto en situaciones fisiológicas como patológicas 15. Las funciones esenciales que desempeña durante el desarrollo embrionario se han constatado en ratones deficientes para este factor, Células en reposo CA2+ Células activadas Activación de Cn Desfosorilación de NFAT Ca2+ citosol núcleo Il-2, IL-4, GM-CSF, TNF-, CD40L, FasL... Fig. 1.--Modelo sobre la regulación de la localización subcelular de NFAT. En células en reposo, NFAT se encuentra fosforilado en el citoplasma. Tras una activación celular por ligandos que elevan el calcio intracelular (Ca2+) se activa la calmodulina (CaM) que se une a la calcineurina (CnA/CnB) y la activa. La calcineurina activada, desfosforila a NFAT, proceso que conduce a la exposición de las secuencias de localización nuclear (NLS), y a la entrada del factor al núcleo. Esta entrada la realiza NFAT acomplejado con la calcineurina, que mantiene el factor desfosforilado en el núcleo lo que permite la transcripción de múltiples genes dependientes de NFAT mientras se mantienen las señales de calcio. Cuando el calcio intracelular desciende, la calcineurina se desactiva y varias quinasas fosforilan al factor, promoviendo así su exportación al citosol. 45 A. J. QUESADA y J. M. REDONDO donde la inactivación de un único alelo causa letalidad en los embriones 16, 17. La expresión de VEGF se encuentra aumentada en procesos fisiológicos relacionados con el ciclo menstrual, embarazo o cicatrización de heridas, así como en diversas condiciones patológicas como en artritis reumatoide, psoriasis, isquemia cardiovascular y cerebral, y retinopatías 18. El papel de VEGF en la formación de tumores está relacionado con la necesidad de neovascularización para el aporte de nutrientes y oxígeno a las células tumorales. De hecho, VEGF se induce en condiciones de hipoxia, situación que se produce en el interior del tumor cuando este crece. Asimismo, la neovascularización inducida por VEGF también es fundamental para la diseminación tumoral 19, 20, lo cual es consistente con la sobreexpresión de VEGF que se ha encontrado en prácticamente todos los tipos de cáncer analizados, y con el efecto inhibidor del crecimiento tumoral que presentan los anticuerpos anti-VEGF neutralizantes 21. Las ciclooxigenasas (Coxs) también se han implicado recientemente en la regulación de angiogénesis, y su inhibición por agentes anti-inflamatorios noesteroideos (AINES) interfiere con la producción de factores pro-angiogénicos por células tumorales 22, e inhibe la síntesis de prostaglandinas (PGs) y la angiogénesis inducida por células de cáncer de colon y del endotelio vascular 23, 24. Estos resultados han sido confirmados en ratones deficientes en Cox-2 25. Coxs, también denominadas prostaglandinas-endoperóxido sintasas, catalizan la conversión de ácido araquidónico a PGH2, el primer paso en la biosíntesis de PGs, tromboxanos y prostaciclinas 26. Existen al menos dos isoformas de Cox que difieren en sus patrones de expresión y su comportamiento biológico; Cox-1 se expresa de forma constitutiva en la mayoría de los tejidos, mientras que Cox-2 presenta una expresión inducible en respuesta a una amplia gama de estímulos entre los que se incluyen antígenos, mitógenos, hormonas y gran número de mediadores inflamatorios. Si bien, dada la complejidad del pro- 100 407 677 907 NFAT1a NFAT1b NFAT1c 42 106 425 412 695 1.064 921 925 716 29 93 682 NFAT2a NFAT2b 827 102 416 685 NFAT3 97 430 699 NFAT3 708 739 1.068 1.075 17 46 NFAT4a NFAT4b NFAT4c NFAT4x NFAT5 30 20 23 49 145 148 48 77 54 NFAT5b NFAT5 143 Fig. 2.--Miembros e isoformas de NFAT. NFAT es una familia de factores de transcripción integrada por al menos 5 miembros. Para algunos de estos miembros se ha descrito la existencia de varias isoformas. Todos los miembros tienen una elevada homología en el dominio de unión a ADNS (DBD) y en la zona N-terminal (NHR) a excepción de NFAT5, el miembro más recientemente descrito que solamente presenta homología con los miembros restantes en el DBD. El NHR es el dominio donde se sitúan las secuencias responsables de la localización subcelular y de las propiedades transactivadoras del factor. En la figura se representan las diferentes zonas de homología entre miembros y se especifican los residuos que delimitan estas zonas. 46 LA RUTA DE SEÑALIZACIÓN CA++/CALCINEURINA/NFAT grama angiogénico, es previsible que un gran número de genes sean activados por VEGF en células endoteliales, hasta ahora sólo se han identificado un número limitado de genes inducibles por este factor. Estudios previos que realizamos en células endoteliales humanas de cordón umbilical (HUVECs) permitieron identificar la presencia de NFAT en este tipo celular y su funcionalidad en la regulación de la expresión génica mediada por VEGF 27. Este hallazgo nos condujo a la búsqueda de genes regulados por NFAT en endotelio y con ello identificamos a Cox-2 como un gen que es activado por VEGF en HUVECs 28, 29. Un estudio detallado sobre la regulación del promotor del gen de Cox-2 se tradujo en la localización y caracterización de dos motivos con los que NFAT interaccionaba, uno de los cuales resultó ser esencial para la inducción de Cox-2 mediada por VEGF. Puesto que la inhibición de Cox-2 produce inhibición de angiogénesis y dada la implicación de NFAT en la regulación de este gen, estudiamos si la inhibición de NFAT por CsA en endotelio también interfería con el proceso angiogénico. Estos estudios demostraron claramente que CsA bloquea tanto la expresión de Cox-2 en endotelio activado con VEGF, como la angiogénesis mediada por este factor31. Así, cuando analizamos el efecto de CsA inhibiendo angiogénesis in vitro en modelos de matrigel, esta inhibición fue tan efectiva como la producida por el NS-398, un inhibidor específico de Cox-2. Además, tanto la inhibición producida por CsA como por NS398 se revirtieron con prostaglandina E2. Estos efectos in vitro tienen también lugar cuando se analizan modelos in vivo, como el de angiogénesis en córnea de ratón. Así, hemos comprobado que la CsA, inyectada de forma sistémica en ratones, inhibe selectivamente la neovascularización inducida por la aplicación local de VEGF y no la mediada por bFGF. Al igual que sucede in vitro, también hemos comprobado que el tratamiento sistémico con PGE2 previene significativamente la inhibición producida por CsA. Este conjunto de resultados sugiere, por un lado, que NFAT va a jugar un papel crucial en la regulación del proceso angiogénico, y también puede explicar por qué la CsA, al margen de sus propiedades inmunosupresoras, es particularmente eficaz en enfermedades que cursan con neovascularización, como la artritis reumatoide o la psoriasis. Por otro lado, estos resultados sugieren el uso de CsA (u otros inhibidores de NFAT), así como de inhibidores de Cox-2, en patologías donde existe una sobreexpresión de VEGF, tales como las retinopatías. Por ello estamos analizado el efecto de la CsA en el modelo de retinopatías de prematuros (ROP), donde también se ha caracterizado la implicación de VEGF 30, 31. BIBLIOGRAFÍA 1. Clipstone NA, Crabtree GR: Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature 357: 695-7, 1992. 2. Crabtree GR, Olson EN: NFAT signaling: choreographing the social lives of cells. Cell. 109 Supl. S67-79, 2002. 3. Rao A, C. 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