NEFROLOGIA. Vol. XVI. Núm. 3. 1996 ORIGINALES La ciclosporina A aumenta la síntesis glomerular y la excreción urinaria de tromboxano B2 en ratas T. Parra, G. de Arriba, G. Pérez de Lema*, I. Arribas*, S. Martín Carballido**, M. Rodríguez-Puyol* y D. Rodríguez-Puyol* Sección de Nefrología. Unidad de Investigación. Hospital General Universitario. Universidad de Alcalá de Henares. Guadalajara. * Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Alcalá de Henares. ** Servicio de Anatomía Patológica. Hospital General Universitario de Guadalajara. Universidad de Alcalá de Henares. RESUMEN Nuestro objetivo fue analizar los efectos de la ciclosporina A oral sobre la función renal, así como la excreción urinaria y la síntesis de tromboxano B2 (metabolito del tromboxano A2) por parte de glomérulos aislados de rata. Se diseñaron experimentos dosis-respuesta (30, 50 y 70 mg/kg/día, durante diez días) y tiempo-respuesta (con 50 mg/kg/día durante cuatro, siete y diez días), y se determinó la síntesis de tromboxano B2 en glomérulos aislados incubados durante treinta minutos a 37 oC. Asimismo, se evaluó la excreción urinaria de tromboxano B2. La ciclosporina A produjo un deterioro de la función renal dependiente de la dosis y del tiempo. Además indujo un aumento de la síntesis de tromboxano B2 por parte de los glomérulos aislados, que fue dependiente de la dosis utilizada y del tiempo de tratamiento. El fármaco aumentó también la excreción urinaria de tromboxano B2, que se correlacionó de modo inverso con el aclaramiento de creatinina. En conclusión, la ciclosporina aumentó la excreción urinaria y la síntesis glomerular de tromboxano B2, hecho que podría justificar, al menos en parte, su capacidad nefrotóxica. Palabras clave: Ciclosporina A. Tromboxano B2. Nefrotoxicidad. Fracaso renal agudo. Glomérulos aislados. CYCLOSPORIN A INCREASES GLOMERULAR SYNTHESIS AND URINARY EXCRETION OF THROMBOXANE IN RATS SUMMARY It has been suggested that thromboxane could mediate nephrotoxicity induced by cyclosporin A. Our aim was to analyze kidney function, urinary excretion and synthesis of thromboxane by isolated glomeruli of rats treated short-term with cyRecibido: 13-X-95. En versión definitiva: 26-I-96. Aceptado: 5-II-96. Correspondencia: Dr. Gabriel de Arriba de la Fuente. Sección de Nefrología. Hospital General Universitario de Guadalajara. C/ Donante de Sangre, s/n. 19002 Guadalajara. 220 CyA Y EXCRECION DE TROMBOXANO closporin A. The drug was administered by oral cannulation. Dose-response (with 30, 50 and 70 mg/kg/day) and time-response (4, 7 and 10 days) experiments were performed. Cyclosporin A reduced kidney function as evidenced by an increase of plasma creatinine and a decrease of creatinine clearance in a dose and time-dependent fashion. Dose-response experiments showed an increase of urinary thromboxane after 10 days of treatment with cyclosporin A (n = 5 for each): Group 30 mg/kg/day 0.43 ± 0.20; Group 50 mg/kg/day 0.53 ± 0.30; Group 70 mg/kg/day 0.60 ± 0.27 pg/hour versus Group Control (0.13 ± 0.09 pg/hour). T i m e - r e s p o n s e experiments were done with a dose of cyclosporin A of 50 mg/kg/day (n = 5 for each group). Glomerular thromboxane increased with time (Basal: 0.18 ± 0.12, Day 4: 0.91 ± 0.70, Day 7: 1.04 ± 0.56, Day 10: 1.02 ± 0.77 ng/mg protein). Furthermore a progressive increase of urinary thromboxane was also observed as treatment progressed. We conclude that short-term treatment with cyclosporin A reduces kidney function and increases glomerular and urinary thromboxane in rats. Furthermore, the increase of urinary thromboxane was inversely correlated with the clearance of creatinine. Our results suggest a possible role of thromboxane in nephrotoxicity induced by cyclosporin A. Key words: Cyclosporin A. Thromboxane. Nephrotoxicity. Acute renal failure. Isolated glomeruli. INTRODUCCION La ciclosporina A (CyA) es un polipéptido fúngico que ha demostrado gran efectividad en la supresión de la respuesta inmune celular y humoral inhibiendo etapas iniciales en la activación de las células T 1, 2. Su peculiar y selectiva influencia sobre el sistema inmune la ha convertido en una droga de uso generalizado en el trasplante de órganos, y se está comenzando a utilizar con éxito en el tratamiento de otras enfermedades tales como diversas glomerulonefritis, uveítis, psoriasis, artritis reumatoide o diabetes mellitus insulín-dependiente 3, 4. Uno de los principales inconvenientes del uso de la CyA es su toxicidad a nivel renal 5-7, que aparece e n un elevado porcentaje de pacientes tratados. Agudamente se caracteriza por la disminución del flujo plasmático renal y del filtrado glomerular, no se acompaña de alteraciones histológicas específicas, y es reversible al reducir la dosis 8-10. Para explicar estas alteraciones funcionales renales se invoca la participación de diversos sistemas vasoactivos como estimulación del eje renina-angiotensina-aldosterona 11, alteraciones del metabolismo de las prostaglandinas 12-15 o del factor activador de las plaquetas 16, liberación de endotelina 17-19 o modificaciones del funcionalismo endotelial o en la síntesis de óxido nítrico 20-23. En varios estudios relacionados con el metabolismo de los eicosanoides se ha demostrado que la CyA provoca un aumento de la síntesis de vasoconstrictor e s , especialmente del tromboxano A2 , que podría j u s t i f i c a r las alteraciones hemodinámicas agudas causadas por la droga a nivel renal 24-28. Nuestro objetivo ha sido establecer un modelo de nefrotoxicidad aguda en ratas tratadas por vía oral con CyA y analizar la síntesis de tromboxano B2 (met a b o l i t o del tromboxano A2 , que es el eicosanoide activo in vivo), por parte de glomérulos aislados, así como su excreción urinaria y su posible relación con parámetros de funcionalidad renal. MATERIAL Y METODOS 1. Material Se utilizaron ratas Wistar macho de 250-300 g de peso, alimentadas con dieta de mantenimiento rataratón estándar (IPM-R20, Letica, Barcelona) y con libre acceso al agua de bebida. Se les administró CyA (Sandimmun, Sandoz, Basilea) mediante canulación oral una vez al día a las 9 horas de la mañana. A las ratas control no se les administró el vehículo del fármaco. 2. Métodos A) Protocolo experimental Se diseñaron experimentos dosis-respuesta (30, 50 y 70 mg/kg peso/día de CyA) durante diez días y tiempo-respuesta (cuatro, siete y diez días con una dosis de 50 mg/kg peso/día de CyA). Cada uno de los grupos se componía de cinco animales. 221 T. PARRA y cols. El día del sacrificio los animales se anestesiaron con éter etílico en campana y mediante punción en la bifurcación aórtica, se obtuvo sangre para determinaciones analíticas (tubos con heparina, 1.000 UI/ml) y de niveles de CyA (tubos con EDTA al 7,5 %). Una vez exanguinados se procedió a clampar la aorta por encima de las arterias renales y se perfundieron los riñones con solución salina isotónica a 4 oC (ClNa al 0,9 %). Los riñones se recogieron sobre hielo y todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4 oC. Para el aislamiento de glomérulos se eliminaron las cápsulas renales y se separó la corteza de la médula. La corteza finamente dividida se sometió a un p r o c e s o de tamizado diferencial según un método descrito previamente 29. La pureza se determinó microscópicamente por contaje del número de partículas glomerulares y no glomerulares suspendidas en un volumen determinado, obteniéndose menos de un 5 % de contaminación tubular. Los glomérulos se rec o g i e r o n sobre tampón Tris-glucosa (Tris 20 mM, C l N a 130 nM, ClK 5 mM, acetato sódico 10 mM, glucosa 5 mM, pH 7,4) y se dejaron reposar 10-15 minutos. Tras centrifugar se retiró el sobrenadante y se repitió esta operación de lavado 3-4 veces. Se resuspendieron los glomérulos en 2 ml de tampón Trisglucosa y se repartieron en tubos de ensayo para las determinaciones analíticas. La muestra para análisis de tromboxano B2 se incubó a 37 oC en baño de agua durante treinta minutos y, tras centrifugar a 1.500 g durante cinco minutos, s e recogió el sobrenadante y se congeló a ­80 o C hasta su procesamiento según método descrito previamente 30. Además, se recogió orina de veinticuatro horas al comienzo y al final de cada experimento, introduciendo las ratas en jaulas metabólicas. Las muestras de orina se recogieron sobre Indometacina (5,10­5 M; Merck, Sharp & Dohme, Barcelona) y se acidificaron con ácido fórmico 2 M hasta un pH de 3-4. Se tomó 1 ml de orina y se extrajo con 2 ml de CHCl3; la fase o g á n i c a se evaporó en un evaporador centrífugo (Speed-Vac) y el extracto se resuspendió para su análisis en 300 µl de buffer fosfato 50 mM. La recuperación de la técnica es del 90-95 %. 3. Determinaciones analíticas A) Analítica de sangre y orina Se determinaron creatinina, urea, glucosa e iones en sangre y orina (Dimension AR, Dupont). Los niveles de CyA en sangre se obtuvieron mediante un inm u n o e n s a y o de polarización por fluorescencia (FPIA), después de diluir las muestras a 1:10 con tampón fosfato como estabilizante para la técnica (TDx Analyzer, Abbott). 222 B) Determinación de tromboxano B2 Se llevó a cabo mediante un RIA con anticuerpos e s p e c í f i c o s para tromboxano B 2 ( S i g m a Inmuno Chemicals). Las muestras y estándares se incuban durante treinta minutos con anticuerpos anti-tromboxano B2 a 4 oC; se añadió el estándar de tromboxano B2 marcado con tritio y se mantuvo la mezcla a 4 oC durante una hora. Después de una etapa de separación con carbón activo/dextrano, la radiactividad del sobrenadante se midió en un contador de centelleo. La concentración de tromboxano B2 se corrigió para el c o n t e n i d o de proteínas en las muestras de glomérulos, determinadas según el método de Lowry 31. La reactividad cruzada del ensayo con las prostag l a n d i n a s y sus metabolitos es menor de 0,1 % excepto para la prostaglandina F2 alfa, que es de un 0,5 %. La sensibilidad del ensayo es de 2 pg/0,1 ml. El coeficiente de variación intraensayo es del 5-10 % y el interensayo del 12-15 %. 4. Análisis estadístico Los datos se analizaron mediante test para muestras no paramétricas de Friedman, Kruskal-Wallis o Mann-Whitney. Los resultados se expresan como media ± error estándar y la significación estadística se fijó para p < 0,05. RESULTADOS Los niveles de CyA en los animales tratados durante diez días con una dosis de CyA de 50 mg/kg peso/día fueron de 5.987 ± 605 ng/ml. Los animales tratados con CyA tienen una menor ganancia de peso que los controles. Esta menor ganancia de peso es más evidente al aumentar la dosis de CyA (tabla I), y se hace más patente sobre todo en los primeros días de tratamiento con el fármaco (tabla II). La ingesta de comida fue significativamente menor en los animales tratados con CyA respecto a los controles (tablas I y II). La CyA produjo un deterioro de la función renal, manifestado por el aumento de creatinina plasmática y de urea, así como por un descenso del aclaramiento de creatinina, que fue dependiente de la dosis utilizada y del tiempo (tablas III y IV). Respecto a los parámetros urinarios, se aprecia una disminución significativa de la natriuresis en los animales tratados con CyA, así como de la osmolaridad urinaria (tablas III y IV). La síntesis de tromboxano B2 por parte de glomérulos aislados aumentó de modo significativo en los CyA Y EXCRECION DE TROMBOXANO Tabla I. Incrementos de peso en ratas controles y ratas tratadas con CyA a diferentes dosis. La duración del tratamiento fue de diez días Control 30 Incremento de peso (g/día) .......................................... Ingesta de comida (g/día) ............................................ * p < 0,05 vs. control. Ciclosporina A (mg/kg/día) 50 1,6 ± 1,1* 14,7 ± 1,4* 70 0,8 ± 0,8* 17,2 ± 1,0* 5,6 ± 0,2 25,7 ± 0,8 2,4 ± 0,6* 19,9 ± 1,3* Tabla II. Incrementos de peso en ratas controles y ratas tratadas durante cuatro, siete y diez días con una dosis de CyA de 50 mg/kg peso/día Control 4 días Incremento de peso (g/día) .......................................... Ingesta de comida (g/día) ............................................. * p < 0,05 vs. control. Ciclosporina A 7 días 1,1 ± 1,1* 15,6 ± 0,8* 10 días 3,3 ± 0,6* 18,5 ± 1,5* 5,4 ± 0,5 24,9 ± 0,3 0,5 ± 1,1* 16,7 ± 0,1* Tabla III. Parámetros analíticos en ratas controles y ratas tratadas con CyA durante diez días a dosis variables Control 30 Crea (mg/dl) ................................................................. Urea (mg/dl) ................................................................ CCr (ml/min/100 g) ...................................................... Na (mmol/l) ................................................................. K (mmol) ..................................................................... Gluc. (mg/dl) ............................................................... Exc. Na (µmol/min) ...................................................... Osmol. (mOsmol/kg) ................................................... * p < 0,05 vs. control. 0,56 ± 0,04 26,8 ± 3,6 0,54 ± 0,11 137,0 ± 0,4 4,2 ± 0,2 182,0 ± 3,5 0,46 ± 0,02 1.627 ± 335 0,66 ± 0,05 67,4 ± 8,9* 0,35 ± 0,04 129,0 ± 1,5* 4,6 ± 0,2 287,0 ± 4,9* 0,32 ± 0,04* 861 ± 352* Ciclosporina A (mg/kg/día) 50 0,84 ± 0,04* 104,2 ± 8,9* 0,22 ± 0,03 133,5 ± 1,3* 4,5 ± 0,2 233,5 ± 5,6* 0,26 ± 0,05* 554 ± 80* 70 0,93 ± 0,13* 92,7 ± 12,0* 0,16 ± 0,06 115,7 ± 0,9* 5,6 ± 0,3* 318,3 ± 14,0* 0,29 ± 0,04* 874 ± 80* Tabla IV. Parámetros analíticos en ratas controles y ratas tratadas con 50 mg/kg peso/día de CyA en ensayos de diferente duración Control 4 días Crea (mg/dl) ................................................................ Urea (mg/dl) ................................................................ CCr (ml/min/100 g) ...................................................... Na (mmol/l) ................................................................. K (mmol) ..................................................................... Gluc. (mg/dl) ............................................................... Exc. Na (µmol/min) ..................................................... Osmol. (mOsmol/kg) ................................................... * p < 0,05 vs. control. 0,56 ± 0,04 26,8 ± 3,6 0,54 ± 0,11 137,0 ± 0,4 4,2 ± 0,2 182,0 ± 3,5 0,46 ± 0,02 1.627 ± 335 0,58 ± 0,02 39,3 ± 4,4 0,42 ± 0,06 138,5 ± 1,2 4,6 ± 0,2 195,0 ± 3,59* 0,31 ± 0,02* 514 ± 67* Ciclosporina A 7 días 0,70 ± 0,06* 52,4 ± 4,2* 0,32 ± 0,04* 129,6 ± 2,2* 4,5 ± 0,2 263,8 ± 24,4* 0,28 ± 0,04* 453 ± 67* 10 días 0,84 ± 0,04* 104,2 ± 8,9* 0,22 ± 0,03* 133,5 ± 1,3* 4,5 ± 0,2 233,5 ± 21,0* 0,26 ± 0,05* 554 ± 80* 223 T. PARRA y cols. Fig. 1.--Tromboxano B 2 glomerular (ng/mg proteína) en ratas c o n t r o l e s y en tratadas con CyA a una dosis de 30, 50 y 70 mg/kg/día durante diez días (n = 5). * p < 0,05. Fig. 3.--Tromboxano B2 urinario (pg/hora) en ratas controles y en tratadas con CyA a una dosis de 30, 50 y 70 mg/kg/día durante diez días (n = 5). * p < 0,05. Fig. 2.--Tromboxano B 2 glomerular (ng/mg proteína) en ratas controles y tratadas con CyA a una dosis de 50 mg/kg/día durante cuatro, siete y diez días (n = 5). * p < 0,05. F i g . 4.--Tromboxano B 2 u r i n a r i o (ng/mg proteína) en ratas controles y tratadas con CyA a una dosis de 50 mg/kg/día durante cuatro, siete y diez días (n = 5). * p < 0,05. animales tratados con CyA respecto a los controles (figs. 1 y 2). El aumento presenta relación con la dosis utilizada (fig. 1) y también con el tiempo de tratamiento (fig. 2). Se observa un aumento en la excreción urinaria de tromboxano B2, dosis (fig. 3) y tiempo (fig. 4) dependiente. Finalmente, hemos obtenido una correlación inversa (r = 0,985) entre la excreción urinaria de tromboxano B2 y el aclaramiento de creatinina en los anim a l e s tratados con CyA en función del tiempo de tratamiento. DISCUSION Hemos analizado los efectos de la ciclosporina A oral sobre la función renal y la posible influencia de la droga sobre la síntesis glomerular y excreción urinaria de tromboxano B2. 224 Observamos una menor ganancia de peso en los animales tratados con CyA, que fue dependiente de la dosis utilizada. El efecto de la CyA sobre el peso de los animales fue más acusado en los primeros días de tratamiento, como se manifestó en los experimentos tiempo-respuesta. Esta menor ganancia de peso puede justificarse por la disminución de ingesta de comida que se observa respecto a los controles 32. No obstante, también pueden contribuir otros factores, como la insuficiencia renal inducida en los animales tratados 11, 27, 28 o el aumento del estrés oxidativo celular condicionado por la CyA, como señalan otros autores 33. La CyA produce un deterioro del filtrado glomerular y del flujo plasmático renal 8, 9, 25, 34, 35. El mecanism o no es bien conocido, aunque se ha postulado que podría estar relacionado bien con un aumento de las resistencias aferente y eferente, con modificac i o n e s del Kf a través de la contracción de células mesangiales 36 o bien a través de daño endotelial di- CyA Y EXCRECION DE TROMBOXANO recto 9, 35. Nosotros hemos confirmado el deterioro de la función renal, manifestado como un aumento de urea y creatinina plasmáticas, junto con un descenso del aclaramiento de creatinina, y hemos demostrado que este descenso fue dependiente de la dosis y del tiempo de tratamiento con CyA. Observamos una discreta elevación de las cifras de p o t a s i o sérico en los animales tratados con CyA. Como ha sido descrito previamente, probablemente este fenómeno se deba tanto a una disminución de la síntesis de aldosterona en la suprarrenal 8 como a una disminución de la secreción tubular distal de potasio 10 . El descenso del sodio plasmático observado tras tratamiento con CyA podría ser secundario tanto a la insuficiencia renal como a la hiperglucemia provocada por el fármaco. Finalmente, la CyA, a través de un daño tubular directo, podría alterar los mecanismos de concentración urinaria, dando lugar al descenso observado en la osmolaridad urinaria de los animales. Se ha evidenciado en numerosos estudios que la CyA es capaz de aumentar la excreción urinaria de tromboxano B2 11, 13, 25-27. No obstante, los diseños experimentales, dosis y vías de administración utilizados han sido muy variados, dificultando una interpretación global de los resultados 8, 35. Los inhibidores de la tromboxano sintetasa 37-40 o los antagonistas para el receptor celular del tromboxano 41-45 evitan el descenso del filtrado glomerular inducido por la CyA, sugiriendo que el tromboxano puede determinar la nefrotoxicidad inducida por la CyA. Demostramos que la CyA induce un aumento del tromboxano B2 urinario de un modo dependiente del tiempo y de la dosis utilizada, hecho que podría sugerir que su efecto es específico. Además, esta elevación se correlacionó con el deterioro de la función renal observado en los animales, existiendo una correlación inversa significativa entre el tromboxano B2 urinario y el aclaramiento de creatinina. Esta correlac i ó n indica que, al menos en parte, la síntesis de t r o m b o x a n o podría contribuir a la nefrotoxicidad aguda inducida por la CyA. El aumento del tromboxano en orina en respuesta a la CyA ha sido confirmado en varios estudios 11, 13, 25, 27 . Así, Perico y cols. 11 mostraron que la CyA a una dosis de 25 mg/kg oral durante cuarenta y cinco días aumenta el tromboxano B2 urinario antes incluso de que se produzca un descenso del filtrado glomerular. El origen del tromboxano en la orina no es bien conocido, pero podría provenir tanto de la circulación sistémica como de estructuras renales o de las células que infiltren el riñón. C o f f m a n y cols. 1 3 o b s e r v a r o n un aumento del tromboxano B2 urinario en riñón postisquémico de- nervado de animales tratados con CyA (50 mg/kg/peso durante cuatro días), lo que indica que se ha formado en el riñón y no a nivel sistémico. Este hecho ha sido confirmado por Benigni y cols. 25 al evidenciar que la CyA (50 mg/kg/oral durante treinta días) a u m e n t ó tanto la excreción urinaria de 2-3-dinortromboxano B2 (formado en la circulación, plaquetas y macrófagos) como la de tromboxano B2 (formado en el riñón). En la actualidad no se conoce si el tromboxano urinario se forma a nivel glomerular o tubular, pero es sabido que en el glomérulo la síntesis de eicosanoides es cuantitativamente importante y que contribuyen a la regulación del filtrado glomerular en numerosas situaciones fisiológicas y fisiopatológicas 46, 47. E x i s t e n datos contradictorios en la literatura sobre la síntesis de tromboxano por parte del glomérulo 11, 25, 48-51. Burke 49 y Jacobs 51 no encuentran modificaciones en animales tratados con CyA, pero Perico 11 y Benigni 25 observan un aumento de la síntesis del mismo. Quizá explique esta disparidad el hecho de que las dosis de CyA utilizadas por Perico y Benigni (25 y 50 mg/kg/día, respectivamente) son mucho más elevadas que las utilizadas por Bunke y Jacobs (5 y 1 0 mg/kg/día, respectivamente). Además, Perico 1 1 también observó que el aumento del tromboxano en glomérulos aislados precedió al deterioro de función renal inducido por la CyA. El aumento del tromboxano glomerular podría originar un deterioro del filtrado glomerular a través de aumento en las resistencias aferente y eferente al glomérulo o bien a través de la contracción de las células mesangiales con descenso del Kf 46, 47, 52, 53. Analizamos la síntesis glomerular de tromboxano B2 en ratas tratadas con CyA, con el fin de eliminar posibles influencias sistémicas, originadas en la circulación o en estructuras renales adyacentes al glomérulo. Además, hoy se considera que los efectos loc a l e s a nivel glomerular de muchos eicosanoides pueden ser de gran importancia en la regulación del filtrado glomerular, y el aumento local de vasoconstrictores o disminución de vasodilatadores puede justificar el deterioro de función renal observado en num e r o s a s situaciones clínicas 4 6 , 4 7 , 5 4 . Nuestros resultados han demostrado que la CyA aumenta la s í n t e s i s glomerular de tromboxano B 2 d e un modo dependiente de la dosis y del tiempo, sugiriendo un e f e c t o específico de la CyA sobre la formación de tromboxano por parte del glomérulo. En definitiva, nuestros resultados confirman que la CyA aumenta la excreción urinaria de tromboxano B2, así como la síntesis glomerular del mismo, indicando que al menos parte del tromboxano urinario puede originarse en el glomérulo. Por otra parte, el aumento de síntesis glomerular y excreción urinaria 225 T. PARRA y cols. de tromboxano B2 es paralelo al deterioro de función renal originado por la CyA, sugiriendo la intervención del tromboxano en la nefrotoxicidad aguda de la CyA. Por lo tanto, estrategias destinadas a disminuir la síntesis glomerular o los efectos del tromboxano podrían ser útiles en la prevención y el tratamiento de la nefrotoxicidad aguda por CyA. AGRADECIMIENTOS E s t e trabajo ha sido financiado por la Beca FIS 93/19. T. Parra Cid es becaria (B.A.E.) del Fondo de Investigación Sanitaria. Agradecemos la colaboración de los miembros de l a Unidad de Investigación del Hospital General Universitario de Guadalajara y en particular al doctor F e r n a n d o Carballo Alvarez, así como a doña I n m a c u l a d a Batanero Blázquez y a doña Milagros Esteban Santamaría. Bibliografía 1. Burchkardt J y Guggenheim B: Cyclosporine «in vivo» and «in vitro» supression of rat T-lymphocyte function. Inmunology 36:753-757, 1979. 2. Flanagan WM, Corthesh B, Bram RJ y Crabtree GR: Nulear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and Cyclosporine. Nature 352:803-807, 1991. 3. Kahan BD: Cyclosporine. N Eng J Med 321:1725-1738, 1989. 4. Faulds D, Goa KL y Benfield P: Cyclosporin. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therap e u t i c use in immunoregulatory disorders. Drugs 4 5 : 9 5 3 1040, 1993. 5. 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