NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Suplemento 1. 2001 IV. LA DIÁLISIS COMO PROCESO INFLAMATORIO La activación celular y apoptosis como marcadores de la inflamación inducida por la hemodiálisis J. Carracedo, R. Ramírez, J. A. Madueño, S. Soriano, A. Rodríguez-Benot, M. Rodríguez, A. Martín-Malo y P. Aljama Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba. Los enfermos con Insuficiencia Renal Crónica (IRC) presentan un deterioro de la respuesta inmune que se refleja en una mayor susceptibilidad a padecer infecciones bacterianas y víricas, enfermedades autoinmunes y neoplasias 1-4. La alteración inmunológica asociada a la insuficiencia renal crónica o es una inmunodeficiencia habitual y resulta paradójico observar como la respuesta inmune de enfermos con IRC no sólo no mejora con el tratamiento en hemodiálisis, sino que en la mayoría de los casos, el tratamiento de hemodiálisis conlleva una activación de células inmunocompetentes, que es más evidente en células mononucleares, y que puede agravar la inmunodeficiencia de estos enfermos 5-10. En este sentido, nuestro grupo viene estudiando desde hace 15 años el efecto inmunomodulador inducido por la hemodiálisis. LAS MEMBRANAS CELULÓSICAS INDUCEN ACTIVACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES Desde los primeros estudios, evidenciamos como el grado de afectación inmune se asociaba no sólo con la hemodiálisis per se, sino que también dependía de la membrana de diálisis utilizada 1. nuestros primeros resultados sugerían que la célula mononuclear reconocía a la membrana de hemodiálisis como un elemento «no propio» y por tanto siguiendo el concepto inmunológico se activaba y producía una respuesta celular específica. Para demostrar esta hipótesis se pusieron en conCorrespondencia: Dr. Pedro Aljama Servicio de Nefrología Hospital Universitario Reina Sofía Avda. Menédez Pidal, s/n. 14004 Córdoba tacto células mononucleares con diferentes membranas de hemodiálisis observando como la interacción con membranas celulósicas producía un incremento en la fosforilación de proteínas celulares 11, que no se observaba con membranas no celulósicas. Tras inducir la fosforilación, la interacción de las células con las membranas celulósicas indujo un incremento en la expresión de moléculas de adhesión como CD18, CD49 y CD54, un incremento en la expresión de marcadores de activación como el receptor para LPS (CD14) o la formación de agregados celulares 11-13. Asimismo, el efecto inducido por la membrana celulósica requería de la interacción membrana celular/membrana de diálisis 14, y la incubación de la membrana de diálisis con albúmina o las propias proteínas de adhesión celular prevenían esta activación, indicando que las posibles «estructuras bioincompatibles» podían sufrir saturación, lo que confirmaba los datos obtenidos por otros grupos 15. Junto a estos resultados, diferentes grupos han demostrado como la activación inducida por la hemodiálisis está relacionada con la presencia de diferentes factores del complemento 16-20 o por la presencia de endotoxinas bacterianas 16-17, lo que produce un efecto amplificador en la activación celular. ACTIVIDAD PROINFLAMATORIA INDUCIDA POR MEMBRANAS CELULÓSICAS La activación celular por las membranas de hemodiálisis tiene consecuencias funcionales. La activación de las células mononucleares se caracteriza por ir acompañada de secreción de citoquinas. Después de 24 horas de cultivo las células cultivadas con membranas celulósicas liberaron cito- 40 MARCADORES DE INFLAMACIÓN quinas proinflamatorias como IL-1 y TNF- al medio de cultivo. Estos datos confirmaban los resultados evidenciados por otros grupos 5-10, que han demostrado un incremento en los niveles de estas citoquinas en el suero de enfermos hemodializados. LAS CÉLULAS QUE HAN CONTACTADO CON MEMBRANAS CELULÓSICAS SON MÁS SUSCEPTIBLES A SUFRIR APOPTOSIS ESPONTÁNEA La apoptosis celular regula la homeostasis de células inmunocompetentes. Las células que interaccionaban con membranas celulósicas presentaban mayor susceptibilidad a morir por apoptosis 13. También se demostró una mayor susceptibilidad a la apoptosis espontánea en pacientes con insuficiencia renal crónica sometidos a hemodiálisis 21-22. Nuestros experimentos muestran que el grado de apoptosis espontánea está relacionado con el grado de biocompatibilidad de la membrana de hemodiálisis (fig. 1). SEÑALES INTRACELULARES MODULADAS POR EL CONTACTO CON MEMBRANAS CELULÓSICAS Tras la interacción con las «estructuras bioincompatibles», las moléculas de superficie de las células mononucleares transducen al interior de la célula las señales de activación. La ruta bioquímica dependiente de actividad Protein Kinasa C (PKC) es probablemente el principal mediador celular implicado en la activación y diferenciación de células inmunocompetentes. Tanto la activación celular como la apoptosis inducida por membranas celulósicas se incrementaron por el coestímulo de agentes inductores de PKC, y se inhibieron cuando se bloqueó esta ruta bioquímica 13. Además, existe una familia de proteínas intracelulares (proteínas G) que regula gran parte de las señales bioquímicas transmitidas al interior de la célula a través de las moléculas de superficie 23-25. Para comprobar si las proteínas G están implicadas en la transmisión de señales por las membranas celulósicas, utilizamos diferentes toxinas bacterianas con actividad moduladora sobre proteínas G. La toxina pertussis (PTX), una toxina con capacidad para inhibir señales dependientes de proteínas G, inhibió la apoptosis inducida por membranas celulósicas, confirmando la hipótesis de que las células mononucleares reconocen e interaccionan con las «estructuras bioincompatibles» de las membranas celulósicas 11. La fase de ejecución de la apoptosis está mediada por una familia de proteasas con residuos cisteína denominada caspasas. La actividad dependiente de caspasa-3 participa de forma fundamental en la regulación de la apoptosis espontánea de monocitos en sujetos sanos 26. Las membranas celulósicas inducen actividad caspasa-3 en células mononucleares, y esta actividad media la apoptosis espontánea de estas células 27. ¿ES LA APOPTOSIS INDUCIDA POR MEMBRANAS CELULÓSICAS UN PROCESO IRREVERSIBLE? Los resultados obtenidos evidenciaban que las células mononucleares recibían una «señal de muerte» tras interaccionar con la membrana celulósica. Pero estos datos no nos permitían afirmar si la apoptosis espontánea que se observa en estas células es consecuencia de una señal específica o de la activación de la apoptosis fisiológica. Para explorar estas dos posibilidades utilizamos una característica inherente a la célula mononuclear, y es que esta célula prolonga su supervivencia cuando es estimulada por citokinas proinflamatorias o proteínas bacterianas como LPS 28-29. Tanto la apoptosis espontánea observada en células de pacientes dializados con membranas celulósicas como la inducida in vitro en células de sujetos sanos tras el contacto con estas membranas, se previene cuando las células son estimuladas por IL-1 o LPS, lo que resulta contradictorio con la hipótesis de una señal de muerte específica. Recientemente existen estudios que han demostrado que las células somáticas sometidas a una activación reiterada sufren un proceso de senescencia acelerada 30. Los resultados descritos en otros modelos eran compatibles con la hipótesis de que las células mononucleares estuviesen sufriendo una activación repetida que indujese la producción de niveles elevados de citokinas proinflamatorias, citokinas que a su vez actuarían prolongando la supervivencia de estas células en sangre periférica 29. Esta hipótesis implicaría que las células de estos enfermos son células envejecidas y por tanto más susceptibles a morir por apoptosis cuando se aíslan del ambiente proinflamatorio en el que se encuentran. En la actualidad estamos desarrollando los estudios necesarios para confirmar esta hipótesis, aunque ya hemos comprobado que las células mononucleares de sujetos dializados con membranas celulósicas presentan un incremento en la expresión de las mo41 J. CARRACEDO y cols. Tiempo (horas) A B 0h Ioduro de Propidio 48 h Anexina V-FITC C D 0h 48 h Fig. 1.--Las células mononucleares de sangre periférica que interaccionan con membranas celulósicas presentan una mayor susceptibilidad a morir por apoptosis cuando permanecen en cultivo durante 48 horas. (A) Análisis de la apoptosis por fragmentación del ADN. Electroforesis en gel de agarosa del ADN obtenido durante 48 horas de cultivo de las células mononucleares que han interaccionado con membranas celulósicas. (B) Determinación de apoptosis por citometría de flujo (método de anexina-V/Ioduro de Propidio). Se consideraron células apoptóticas las que se marcaron con anexina V-FITC (eje X) y excluyeron Ioduro de Propidio (eje Y). (C) Fotografías de microscopía electrónica de la apoptosis inducida en células mononucleares por membranas celulósicas. Después de 48 horas de cultivo se pueden observar imágenes características de apoptosis como condensación de la cromatina nuclear y formación de cuerpos apoptósicos. léculas CD14 y CD32 (fenotipo característico de monocitos senescentes). Este fenotipo se acompaña de un telómero acortado definitorio de senescencia celular (fig. 2) 29, 31. 42 CONCLUSIÓN Parece evidente que como consecuencia de la interacción con la membrana de hemodiálisis las célu- MARCADORES DE INFLAMACIÓN 50 104 103 0 102 101 100 100 101 102 103 104 0 200 400 600 800 1.000 Tamaño Celular 50 Granularidad Celular 0 0 200 400 600 800 1.000 Intensidad de Fluorescencia Fig. 2.--Longitud de telómero en células mononucleares de un paciente dializado con membranas celulósicas. Las células se marcaron con una sonda PNA-telómero-FITC y se analizaron en un citómetro de flujo. Tras 48 horas de cultivo se observó una subpoblación con el telómero acortado. las mononucleares sufren un proceso de activación cíclico. Además, otros factores como fracciones del complemento o la contaminación por endotoxinas pueden amplificar este proceso. Para el sistema inmune, el resultado final es una agresión frente a la cual se induce una respuesta inflamatoria. Como consecuencia de la misma, las células mononucleares activadas producen citokinas proinflamatorias, que de forma autocrina, actúan sobre las propias células prolongando su supervivencia en sangre periférica, aunque son más susceptibles a morir por apoptosis cuando se aíslan del medio inflamatorio (fig. 3). Estas células «senescentes», acaban alterando su producción de citokinas y generan una respuesta alterada frente a situaciones de stress agudo, lo que podría explicar las alteraciones inmunes del enfermo en diálisis. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por: Fondo de Investigación Sanitaria (FIS 98/0423, 00/0788, 00/0701), Junta de Andalucía (112/99 y 179/99), Sociedad Española de Nefrología y Fundación Renal «Íñigo Álvarez de Toledo». IL-1 CD14 TNF Moleculas adhesión MEMBRANAS DE DIALISIS Fig. 3.--Las células mononucleares de sangre periférica sufren un proceso de activación cíclico como consecuencia de la interacción con la membrana de hemodiálisis, produciendo citokinas proinflamatorias, incremento en la expresión de moléculas de adhesión como CD18, CD49 y CD54 y de marcadores de activación como el receptor para LPS (CD14). 43 J. CARRACEDO y cols. BIBLIOGRAFÍA 1. Aljama P, Martín-Malo A, Garin JM, Torres A, Castillo D, Fuentes M, Gómez JM: Granulocyte adherence changes: An index of biocompatibility. Kidney Int 33: S68-S72, 1988. 2. Cheung AK, Parker CJ, Janatova J, Brynda E: Modulation of complement activation on hemodialysis membranes by immobilized heparin. J Am Soc Nephrol 2: 1328-1337, 1992. 3. Hakim RM: Clinical implications of hemodialysis membrane biocompatibility. Kidney Int 44: 484-494, 1993. 4. 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