NEFROLOGÍA. Vol. XX. Número 1. 2000 ORIGINALES Estudio mutacional de los genes PKD1 y PKD2 (poliquistosis renal autosómica dominante tipo 1 y 2) R. Torra*, C. Badenas*,**, L. Pérez-Oller*, J. L. San Millán***, D. Tellería***, X. Estivill** y A. Darnell* *Servicio de Nefrología y **Genética. Hospital Clínic. Universidad de Barcelona. ***Unidad de Genética Molecular. Hospital Ramón y Cajal. Madrid. RESUMEN La poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD) es la enfermedad renal hereditaria más frecuente. Es causada por mutaciones en al menos 2 genes: PKD1 y PKD2. El estudio molecular directo, mediante el análisis de mutacioens resulta actualmente complejo. En el presente trabajo hemos analizado una región de la zona no repetida del gen PKD1 y todos los exones y regiones intrónicas flanqueantes del gen PKD2. Las técnicas utilizadas han sido SSCA (single strand conformation analysis) y heteroduplex. Durante el presente estudio se han hallado 25 diferencias en la secuencia de ADN del gen PKD1 respecto a la secuencia publicada. Siete de ellas corresponden a mutaciones de tipo sin sentido, de sentido erróneo, cambio de pauta de lectura o de splicing y el resto son polimorfismos. Por lo que respecta al gen PKD2 hemos hallado 8 nuevas mutaciones y un polimorfismo, todos ellos no descritos previamente. Seis de las mutaciones modifican la pauta de lectura, una es de tipo sentido erróneo y otra es una gran deleción del gen PKD2. La tasa de detecciones para PKD1 ha sido del 4% mientras que para PKD2 ha sido del 100%. No se ha observado correlación genotipo-fenotipo para PKD1 ni para PKD2. El análisis mutacional de la PQRAD es complejo, sobre todo el del gen PKD1. El rendimiento del estudio de mutaciones es superior en el gen PKD2 pero la eficacia global es baja pues la prevalencia de la forma PKD2 es tan sólo de un 15% del total de poliquistosis. En la actualidad el análisis de ligamiento continúa siendo la principal herramienta a utilizar para realizar el diagnóstico molecular de la enfermedad. Palabras clave: Poliquistosis renal autosómica dominante. PKD1. PKD2. Mutaciones. Polimorfismos. Recibido: 23-IV-99. En versión definitiva: 6-IX-99. Aceptado: 9-IX-99. Correspondencia: Dra. Roser Torra Servicio de Nefrología Hospital Clínic Villarroel, 170 08036 Barcelona 39 R. TORRA y cols. MUTATIONAL ANALYSIS OF PKD1 AND PKD2 GENES (AUTOSOMAL DOMINANT POLYCYSTIC DISEASE TYPE 1 AND 2) SUMMARY Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most common hereditary kidney disease. It is caused by mutations in at least two different genes: PKD1 and PKD2. The study of mutations in these genes is very difficult nowadays. In this study we have analyzed the non reiterated region of the PKD1 gene and all the exons and intron exon boundaries of the PKD2 gene. The technique used to study these genes have been single strand conformation analysis and heteroduplex. We have found 25 differences within the DNA sequence of the PKD1 gene with respect to the published sequence. Seven of these changes correspond to nonsense, missense, frameshifting and splicing mutations. The rest of changes correspond to polymorphisms or rare DNA variants. In the PKD2 gene we have identified 8 new mutations and one polymorphism. Six of these mutations are frameshifting, one is missense and the other one is a large deletion of the PKD2 gene. The rate of mutation detection within the PKD1 gene has been 4% and the rate for PKD2 has been 100%. We have not observed any correlation between genotype and phenotype either in the PKD1 nor in the PKD2 gene. The mutation analysis of ADPKD genes is very difficult, specially for the PKD1 gene. The rate of mutation detection is higher in the PKD2 gene but the global efficacy of the technique is very low as PKD2 represents only 15% of ADPKD patients. Nowadays linkage analysis is still the most useful technique for the molecular diagnosis of ADPKD patients. Key words: Autosomal dominant polycystic kidney disease. PKD1. PKD2. Mutation. Polymorphisms. INTRODUCCIÓN La poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD) es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes, afectando a una de cada 1.000 personas. Es una enfermedad multisistémica caracterizada por el desarrollo progresivo de quistes renales que frecuentemente condicionan insuficiencia renal. Otras manifestaciones de la enfermedad son quistes hepáticos, aneurismas cerebrales y anomalías valvulares 1. Existen al menos tres genes causantes de la PQRAD. El gen PKD1 es el causante del 85% de los casos de PQRAD y se encuentra localizado en el cromosoma 16p13.3 2. El gen PKD2 da lugar al 15% restante de casos, y se encuentra en el cromosoma 4q13-23 3. Existen un pequeño número de familias que no muestran ligamiento ni con PKD1 ni con PKD2 y parecen padecer una poliquistosis causada por un tercer gen, no localizado en la actualidad 4-6. Nosotros no hemos hallado ninguna familia que no fuese PKD1 o PKD2. El gen PKD1 tiene 52 kb, contiene 46 exones, y codifica para un ARNm de 14 kb. La proteína a la que 40 da lugar es la poliquistina 1. Se trata de una glicoproteína de 4.302 aminoácidos. Contiene 11 dominios transmembrana, una larga cola amino extracelular que parece estar implicada en interacciones célula-célula o célula-matriz extracelular, y una cola carboxilo citoplasmática. Este extremo carboxiterminal contiene un dominio del tipo coiled-coil que interacciona con la poliquistina 2 7, 8. Al demostrarse la interacción entre ambas proteínas se ha sugerido que podrían estar implicadas en una cascada de señales necesarias para la normal tubulogénesis. La búsqueda de mutaciones en el gen PKD1 se ha visto complicada por el hecho de que 3/4 del gen se hallan repetidas varias veces proximalmente en el mismo cromosoma 16, lo cual dificulta enormemente la amplificación de la región. Hasta el momento actual se han descrito 44 mutaciones en el gen PKD1, localizándose la mayoría de ellas en la región no repetida del gen 9-15. El gen PKD2 consiste en 15 exones con una pauta abierta de lectura de 2,9 kb y una región 3'UTR de 2 kb. La poliquistina 2 está constituida por 968 aminoácidos. Tiene 6 dominios transmembrana y los ex- MUTACIONES EN PKD1 Y PKD2 tremos amino y carboxi terminal son citoplasmáticos 16. Existe una identidad del 25-30% y una similitud del 45-50% entre poliquistina 1 y poliquistina 2. La poliquistina 2 muestra homología con la familia de los canales de calcio activados por voltaje, lo cual sugiere que podría estar implicada en la regulación de los flujos transmembrana de calcio. Se han descrito un amplio número de mutaciones en el gen PKD2, siendo el rendimiento de la búsqueda de mutaciones en este gen mucho más elevado que en PKD1 al no haber los problemas de amplificación que acontecen en el primero 17-21. El objetivo del presente trabajo ha sido la búsqueda de mutaciones en los genes PKD1 y PKD2. PACIENTES Y MÉTODOS Criterios clínicos El diagnóstico de PQRAD se ha realizado mediante ecografía siguiendo los criterios de Ravine 22 y en los casos en los que el número de familiares afectos lo permitía se ha realizado el estudio de ligamiento según la técnica ya descrita previamente 23. Detección de mutaciones en PKD1 Se ha analizado ADN desde los exones 43 al 46 y el intrón 40 del gen PKD1 mediante la técnica de SSCA (single strand conformation analysis) en 90 familias PKD1 y en 85 individuos poliquísticos no emparentados de los cuales no se conocía el análisis de ligamiento. Para el estudio de SSCA se han realizado PCR en un volumen total de 25 µl conteniendo tampón 1x Boehringer-Mannheim, 5 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, 0,75 mM (para los cebadores NN y G) y 1,5 mM (para el resto) MgCl2, 1 U de Taq High Fidelity Polymerase BoehringerMannheim, 10% DMSO y 500 ng de ADN. La temperatura de anillamiento fue de 55º C (para los cebadores NN, G, HH, JJ, KK y CB.3) y 60º C (para el resto). Las secuencias de los cebadores de nueva creación se describen en la tabla I. Los cebadores MM, PP, NN, G, HH, JJ y KK han sido descritos previamente 11. Tres µl del producto de PCR combinado con tampón de carga fueron desnaturalizados y se procedió a la electroforesis en geles no denaturantes de poliacrilamida al 12% durante 4 h a un voltaje de 500 v. A continuación se procedió a la tinción de plata de los geles 24 (fig. 1). Fig. 1.--SSCA de varios exones del gen PKD1. Las bandas anómalas corresponden a A4058 V, 12801del28, V4145I, R4275W y 13135GA. 41 R. TORRA y cols. Detección de mutaciones en PKD2 Se ha estudiado ADN de 8 familias con PQRAD tipo 2, diagnosticadas mediante análisis de ligamiento. Para la detección de las mutaciones en este segundo gen se han analizado todos los exones y regiones intrónicas flanqueantes de los exones mediante la técnica de heteroduplex. Los cebadores utilizados para las PCR han sido algunos diseñados específicamente para este estudio (tabla I) y otros han sido descritos previamente 11. La técnica de heteroduplex se ha realizado mediante los geles hydrolink mutation detection enhacement (AT Biochem), añadiendo 15% de urea. Brevemente, 20 µl del producto de PCR fueron desnaturalizados a 95º C durante 5 min., enfriados hasta 37º C y cargados en los geles. La electroforesis se realizó a un voltaje de 10 v/cm y finalmente se tiñeron los geles con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo luz UV. Los productos de PCR se clonaron cuando se consideró necesario en un plásmido del tipo pMosBlue (Amersham). Análisis de la deleción del gen PKD2 En una familia en la que se sospechaba una deleción de gran tamaño por presentar hemizigosis para el polimorfismo descrito en este trabajo (fig. 2) se realizó un estudio de dosis de ADN para demostrar la presencia de una supuesta deleción. Se dirigió ADN de individuos afectos y no afectos con 50 U de EcoRI (Boheringer-Manheim) y se procedió a la electroforesis de los fragmentos en un gel de agarosa. Se realizó un southern blot en un filtro de nylon. Se construyeron 2 sondas del gen PKD2, una de ellas contenía el exón 1 y la otra los exones 11 y 12. Se utilizó como control una sonda del exón 4 del gen CFTR (fibrosis quística). Las sondas fueron marcadas con P32. La hibridación con las sondas de PKD2 y la control se reaI4 * I3 * II7 II6 5.4 Kb PKD2 4.7 Kb CFTR Fig. 2.--Deleción del exón 1 al 13 del gen PKD2. A) Árbol de la familia. Haplotipos construidos en base al análisis de ligamiento con marcadores flanqueantes del gen PKD2 y el polimorfismo Arg28Pro. Se muestra la hemizigosidad para el polimorfismo con una flecha (1: Arg, 2: Pro, ­: del). Los asteriscos muestran los individuos con recombinación entre los microsatélites flanqueantes del gen PKD1. B) Southern Blot de la digestión con EcoRI marcado con una sonda de los exones 11-13 de PKD2 y con una sonda del gen CFTR. Los asteriscos muestran los individuos afectos. lizó simultáneamente a 65º C. El tamaño de los fragmentos EcoRI para las 2 sondas del gen PKD2 eran de 5,2 y 5,4 kb y la de la sonda de control de 4,7 kb. La densidad de las bandas obtenidas para cada sonda fue analizada mediante un análisis densitométrico. Secuenciación La secuenciación de los productos de PCR o fragmentos de ADN aislados en plásmidos se ha realizado en el secuenciador ABI310 (Perkin Elmer). Los estudios mediante endonucleasas se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mutaciones descritas en este estudio se han nombrado siguiendo los consejos de Beaudet y Tsui 25. Análisis computarizado Se ha utilizado el programa COILS2.2 para el estudio del dominio coiled-coil de la mutación Q4224P del gen PKD1. Este programa predice la estructura en base a la similitud con una base de datos en la que se encuentran coiled-coils conocidos de doble cadena. Se ha comparado la secuencia de la región del gen PKD1 que incluye la mutación R4275W, en humanos y Fugu rubripes utilizando los programas BLAST, FASTA y CLUSTAL-W (http:\\ www2.wbj.ac.uk). Tabla I. Cebadores para el gen PKD1 descritos por primera vez en el presente estudio Nombre CB.1 CB.2 CB.3 CB.7 Localización Exón 46 Exón 46 Exón 46 Exón 43 Secuencia (5' 3') F-CAGCTGCACAGCCTGCAAG R-AGCCAGCAGCCTTAGCAG F-TCCACCCCAGCAGCACTTAG R-GTCCTGGTTGGCCACACAGC F-GATCTTCCCGTGGCCCAT R-GTGTCCACTCCGACTCCA F-AGGTGTGCCTGCTGCTGT R-CCACCTGGTCGAAGCTAGTG 42 MUTACIONES EN PKD1 Y PKD2 Tabla II. Cambios en la secuencia del gen PKD1 descritos en este estudio Nombre Mutaciones Q4041X Q4124X IVS44-IG C IVS45-IG A 12801del28 R4275W Q4224P Variantes A4985G I4044V A4058V V4145I Variantes ADN IVS40 + 17del14 R3970R A3991A L4032L IVS44 + 37ins5 IVS44 + 19delG A4091A L4136L P4254P Cambio 12332C T 12581C T 28 pb deleción 13034C T 12882A C Localización Exón 44 Exón 45 Intrón 44 Intrón 45 Exón 46 Exón 46 Exón 46 Heterocigosidad * * * * * * * RESULTADOS Durante el presente estudio se han hallado 25 diferencias en la secuencia de ADN del gen PKD1 respecto a la secuencia publicada (número de acceso GDB L33243, L43618 y L43619) (Fig. 1). Siete de ellas corresponden a mutaciones de tipo sin sentido, de sentido erróneo, cambio de pauta de lectura o de procedimento del ARNm (splicing). Además de estas mutaciones hemos identificado 4 variantes aminoacídicas, 6 cambios conservativos, 3 cambios en secuencias intrónicas y 5 cambios en la zona 3' UTR (tabla II). Por lo que respecta al gen PKD2 hemos hallado 8 nuevas mutaciones y un polimorfismo, todos ellos no descritos previamente (tabla III). Una de las mutaciones consiste en una deleción de todo el gen PKD2. La sospecha de la existencia de esta mutación surgió al observar una segregación anómala del polimorfismo descrito en este trabajo (hemizigosis) (fig. 2A). Para demostrar que realmente existía dicha deleción se procedió a un estudio de dosis de ADN (con el objeto de determinar si existía una menor cantidad de ADN para la región PKD2 que para otra región control). El análisis densitométrico del southern blot realizado con sondas de PKD2 y CFTR demostró que la intensidad de las sondas PKD2 era la mitad que para la sonda de CFTR (fig. 2B). Esto demuestra que la mutación en esta familia es una deleción que alcanza desde el exón 1 hasta el 13 como mínimo. El análisis con los marcadores flanqueantes del gen PKD2 demuestra que para éstos no hay he- 12168C G 12341A G 12384C T 12644G A Exón Exón Exón Exón 43 44 45 45 * 0,386 0,128 0,011 12124C T 12184C G 12307G C 12484A G 12617C T 12973C T 13135G A 13370G A 13364C T 13357T C 13233A G Intrón 40 Exón 43 Exón 43 Exón 44 Intrón 44 Intrón 44 Exón 45 Exón 45 Exón 46 3'UTR 3'UTR 3'UTR 3'UTR 3'UTR 0,011 0,028 * * * 0,04 0,386 * 0,049 * * * * * Heterocigosidad menor de 0,01. Tabla III. Cambios en la secuencia de PKD2 descritos en este estudio Nombre Sin sentido R417X Q585X Inserción/deleción 198insC 1367inv 7 pb-1377del 4 pb 2152delA 2511AG C Deleción gen PKD2 De sentido erróneo A356P Polimorfismo R28P CPL: Cambio en la pauta de lectura. Cambio C T en 1249 C T en 1753 Efecto en la secuencia codificante Arg Stop en 417 Gln Stop en 585 Localización Exón 5 Exón 8 Inserción de C en 198 Inversión de 7 pb en 1367 y deleción de 4 pb en 1377 Deleción de A en 2152 Sustitución de AG por C en 2511 CPL después de codon 68 CPL después de 456 CPL después de 719 CPL después de 837 Ausencia de proteína Exón 1 Exón 6 Exón 11 Exón 13 G C en 1066 Ala Pro en 356 Exón 4 G C en 83 Arg Pro en 28 Exón 1 43 R. TORRA y cols. mizigosis, por tanto la deleción parece abarcar todo el gen PKD2 pero no regiones colindantes. DISCUSION Las mutaciones en el gen PKD1 dan lugar al 85% de los casos de PQRAD mientras que las mutaciones en PKD2 dan lugar al 15% restante. Es bien conocido que la severidad de la PQRAD tipo 1 es superior a la de tipo 2. La edad de inicio del tratamiento renal sustitutivo es casi 20 años superior en PKD2 que en PKD1 23, 26. En la actualidad se puede llevar a cabo el diagnóstico molecular de la PQRAD pero éste se realiza tan sólo de forma indirecta, es decir, a través del análisis de ligamiento. Para la realización del análisis de ligamiento se precisa la obtención de sangre de al menos 2 miembros afectos (3 si son de distinta generación) y 2 no afectos de la familia. Por tanto, el análisis molecular en la PQRAD no es útil para el diagnóstico de casos aislados en los que se sospecha una poliquistosis pero no hay familiares afectos o que se presten al estudio. Para realizar el diagnóstico molecular en estos casos aislados se debería utilizar el análisis molecular directo, es decir, el análisis de mutaciones pero dicho procedimiento resulta complejo. Esto es debido a que el gen PKD1, por otra parte mayoritario, es de muy difícil análisis por estar todo él menos 3,5 kb repetido varias veces proximalmente en el mismo cromosoma 16. El gen PKD2, por otro lado, es de más fácil análisis, pero dado que se trata de una forma poco prevalente de la enfermedad es de una ayuda relativa. Hasta el momento actual se han identificado 44 mutaciones en el gen PKD1, dando lugar la mayoría de ellas a proteínas truncadas. Las mutaciones halladas hasta el momento en el gen PKD2 también son en su gran mayoría de tipo truncante. Esto sugiere que la PQRAD pueda ser causada por un mecanismo de pérdida de función, existiendo otra mutación que inactivase la copia salvaje o no mutada del gen. Esta teoría ha sido sugerida para PKD1 por Qian y cols. y Brasier y Henkes y comprobada por nuestro grupo 27, 28. Además, hemos demostrado que este fenómeno ocurre también para el gen PKD2 (datos no publicados). Este mecanismo podría explicar la gran variabilidad intrafamiliar observada en esta enfermedad 29, 30. Para el estudio de mutaciones en el gen PKD1 hemos analizado mediante SSCA los exones 43, 44, 45 y 46, así como el intrón 40 del gen PKD1 (todos ellos pertenecientes a la región no repetida del gen PKD1) y hemos hallado 7 mutaciones, 4 variantes aminoacídicas y 14 variantes del ADN. Las muta44 ciones detectadas en este estudio han sido básicamente de tipo sin sentido o de cambio de la pauta de lectura, eliminando porciones significativas del gen y siendo, por tanto, claramente patogenéticas. Pero también hemos hallado 2 mutaciones de tipo sentido erróneo. Sólo la mutación R4275W ha sido hallada en más de una familia de las estudiadas aquí. Por otro lado, existen 2 mutaciones (Q4041X y Q4124X) que habían sido identificadas previamente. A pesar de haber encontrado la misma mutación en más de una familia, hasta el momento actual no se ha descrito una mutación preferente en el gen PKD1 ni siquiera una región especialmente rica en mutaciones. Hemos identificado 2 mutaciones de tipo sentido erróneo en el exón 46 del gen PKD1: Q4224P y R4275W. Las mutaciones de tipo sentido erróneo son importantes para determinar las regiones críticas de la proteína. Inicialmente fue difícil determinar si estas mutaciones eran realmente mutaciones patogenéticas o si se trataba de polimorfismos raros, especialmente al no haberse analizado el gen PKD1 completo. Para demostrar que se trataba de mutaciones reales estudiamos inicialmente la segregación de la mutación con la enfermedad en cada familia, obteniendo una clara correlación. Por otro lado, se compararon las secuencias que contenían estas mutaciones con las de otras especies en las que el gen PKD1 ha sido secuenciado. Se comprobó que se trataba de nucleótidos conservados y además uno de ellos (Q4224P) se localizaba en una estrucutra relevante de la poliquistina 1 como es el domino coiled-coil. Este domino comprende 5 heptadas consecutivas repetidas que dan lugar al patrón típico de los motivos coiled-coil alfa helicoidales. La mutación Q4224P, identificada en este trabajo, está localizada en la posición «d» de la segunda heptada. La presencia de un residuo de prolina en esa heptada probablemente destroza la estructura alfa helicoidal. Esta hipótesis la comprobamos al analizar los 2 alelos con el programa COILS, que predice dominios coiled-coil alfa helicoidales en las proteínas y al objetivar que la probabilidad que se mantuviese dicho dominio al aparecer la mutación era muy baja. Es importante destacar que se trata de la primera mutación de sentido erróneo localizada en la región del coiled-coil. El hecho de hallar una mutación en esta región confirma el hecho de que sea una región crítica de la proteína. A parte de las mutaciones, en este estudio se han descrito un gran número de cambios de nucleótidos que constituyen polimorfismos en algunos casos pero en otros, dada la baja frecuencia con la que han sido hallados, se trata de variantes raras con muy poca utilidad. Los polimorfismos pueden utilizarse para re- MUTACIONES EN PKD1 Y PKD2 forzar el análisis de ligamiento mientras que las variantes raras no son útiles para este fin por su baja heterozigosidad y además, al igual que los polimorfismos, dificultan la búsqueda de mutaciones pues significan bandas anómalas en el SSCA que deben ser secuenciadas. Por otra parte, sería interesante descubrir si estas variantes y polimorfismos modifican de alguna forma la expresión de la enfermedad. Al analizar los exones y regiones intrónica flanqueantes del gen PKD2 hemos hallado 7 mutaciones en los exones 1, 4, 5, 6, 8, 11 y 13 del gen. Seis de ellas son mutaciones que condicionan un cambio de la pauta de lectura y por tanto se deduce que dan lugar a proteínas truncadas a las que les falta el extremo carboxiterminal. Se trata de 2 mutaciones de tipo sin sentido, una deleción de 1 pb, una inserción de 1 pb, un cambio AG T, y una mutación compleja que conlleva una inversión y una deleción en el exón 6. La séptima mutación hallada es de tipo sentido erróneo y se ha debido demostrar que realmente sea la causante de la enfermedad. Los datos que apoyan este hecho son: la segregación de la mutación con la enfermedad en la familia y el no hallar ningún otro cambio en el gen PKD2 en esta familia. Por otro lado, el aminoácido que se modifica (alanina por prolina en el codón 356 de la poliquistina 2) está localizado en el primer dominio extracelular. Curiosamente la única mutación de tipo sentido erróneo descrita hasta el momento en el gen PKD2 (W4146G) se halla en esta misma región 19. Esto puede ser debido a que esta región sea especialmente importante, quizá interactuando con otras moléculas o bien siendo clave en la incorporación de la proteína a la membrana celular. La introducción de una prolina a este nivel puede destruir la estructura secundaria de la molécula y por lo tanto alterar o abolir su función. Finalmente, resta una familia en la que no se había hallado ninguna mutación en el gen PKD2, mediante heteroduplex, pero por otra parte mostraba un fuerte ligamiento con dicho gen. Al analizar el polimorfismo descrito en este estudio se observó una segregación anómala del mismo en la familia, siendo alguno de sus miembros hemizigoto (es decir, aparentemente no había heredado el polimorfismo por parte de uno de los progenitores). Es bien conocido que una explicación para este fenómeno es la presencia de una deleción que implique la región estudiada 31. Bajo dicha hipótesis se realizó un análisis de Southern Blot comparando la cantidad de DNA de dicha región que presentaban los individuos afectos comparado con la que presentaban para la región del gen CFTR y se objetivó que era aproximadamente la mitad. Esto demostró que la mutación en esta familia era una deleción que im- plicaba al menos a 12 exones del gen PKD2. Esta es la primera gran deleción descrita en el gen PKD2 y viene a corroborar la idea de que no existe correlación genotipo-fenotipo ni en PKD1 ni en PKD2. No hay diferencias clínicas significativas entre familias con una mutación muy severa como puede ser una gran deleción al compararlas con otras con mutaciones teóricamente más benignas como puede ser una mutación de sentido erróneo, basándonos en la edad de inicio del TRS (datos no mostrados). En el presente estudio se han descrito nuevas mutaciones y polimorfismos en el gen PKD1 y PKD2. El hecho de que sean mucho más frecuentes los polimorfismos en el gen PKD1 que en el PKD2 sugiere que se trata de un gen con una capacidad mutagénica muy elevada, lo cual explicaría la mayor prevalencia de PKD1 que PKD2. Por otra parte se ha demostrado una vez más la complejidad de la búsqueda de mutaciones en el gen PKD1 y hemos podido objetivar un buen rendimiento del análisis mutacional en el gen PKD2. A pesar de estos resultados y dado que el gen más prevalente en la PQRAD, es decir, PKD1, sigue siendo de muy difícil análisis y no parecen existir mutaciones preferentes o una zona especialmente rica en mutaciones, creemos que el análisis de ligamiento seguirá siendo durante bastante tiempo la única herramienta molecular efectiva para el diagnóstico de la PQRAD. Es de esperar que en un futuro el análisis mutacional directo de estos genes se estandarice y nos permita realizar el diagnóstico de casos aislados. Pero no sólo debemos esperar este avance en un futuro a medio plazo sino que también debe intentarse descubrir los factores genéticos involucrados en la progresión de la enfermedad. Así, en un futuro hipotético, no sólo seríamos capaces de determinar si un individuo padece o no la enfermedad sino que podríamos predecir con relativa certeza el curso que seguiría la enfermedad y quizá establecer alguna intervención terapéutica para modificar el curso de la misma. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado con las becas FIS 94/0343 y 97/2047. LPO tiene una beca del Hospital Clínic. Los estudios realizados no hubiesen sido posibles sin la generosa colaboración de los pacientes y sus familiares. BIBLIOGRAFÍA 1. Gabow PA: Autosomal dominant polycystic kidney disease. N Engl J Med 329: 332-342, 1993. 45 R. TORRA y cols. 2. European Polycystic Kidney Disease Consortium: The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. Cell 77: 881-894, 1994. 3. Mochizuki T, Wu G, Hayashi T, Xenophontos SL, Veldhuisen B, Saris JJ, Reynolds DM, Cai Y, Gabow PA, Pierides A, Kimberling WJ, Breuning MH, Constantinou-Deltas C, Peters DJM, Somlo S: PKD2, a gene for polycystic kidney disease that encodes an integral membrane protein. Science 272: 1339-1342, 1996. 4. Daoust MC, Reynolds DM, Bichet DG, Somlo S: Evidence for a third genetic locus for autosomal dominant polysytic kidney disease. Genomics 25: 733-736, 1995. 5. De Almeida S, De Almeida E, Peters DJM, Pinto JR, Tavora I, Lavinha J, Breuning MH, Prata MM: Autosomal dominant polycystic kidney disease: evidence for the existence of a third locus in a portuguese family. Hum Genet 96: 83-88, 1995. 6. Ariza M, Alvarez V, Marín R, Aguado S, López-Larrea C, Álvarez J, Menéndez MJ, Coto E: A family with a milder form of adult dominant polysytic kidney disease not linked to the PKD (16p) or PKD2 (4q) genes. J Med Genet 34: 587-589, 1997. 7. Qian F, Germino FJ, Cai Y, Zhng X, Somlo S, Germino GG: PKD1 interacts with PKD2 through a probable coiled coil domain. Nature Genetics 16: 179-183, 1997. 8. Tsiokas L, Kim E, Arnould T, Sukhatme UP, Walz G: Homoand heterodimetic interactions between the gene products of PKD1 and PKD2. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6965-6970, 1997. 9. Peral B, Gamble V, San Millán JL, Strong C, Sloane-Stanley J, Moreno F, Harris PC: Splicing mutations of the polycytic kidney disease 1 (PKD1) gene induced by intronic deletion. Hum Mol Genet 5: 539-542, 1995. 10. Peral B, Gamble V, Strong C, Ong ACM, Sloan-Stanley J, Zerres K, Winearls C, Harris PC: Identification of mutations in the duplicated region of the polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene by a novel approach. Am J Hum Genet 60: 1339-1410, 1997. 11. Peral B, San Millán JL, Ong ACM, Gamble V, Ward CJ, Strong C, Harris PC: Screening the 3'region of the polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene revelas six novel mutations. Am J Hum Genet 58: 86-96, 1996. 12. Torra R, Badenas C, Darnell A, Brú C, Escorsell A, Estivill X: Autosomal dominant polycystic kidney disease with anticipation and Caroli's disease associated with a PKD1 mutation. Kidney Int 52: 33-38, 1997. 13. Torra R, Badenas C, Peral B, Darnell A, Serra E, Gamble V, Turco AE, Harris PC, Estivill X: Recurrence of the PKD1 nonsense mutation Q4041 X in Spanish, Italian and British families. Hum Mutat 1: S117-120, 1998. 14. Watnick TJ, Piontek KB, Cordal TM, Weber H, Gandolph MA, Qian F, Lens XM, Neumann HPH, Germino GG: An unusual pattern of mutation in the duplicated portion of PKD1 is revealed by use of a novel strategy for mutation detection. Hum Mol Genet 6: 1473-1481, 1997. 15. Ariza M, Álvarez V, Sanz de Castro S, Peces R, Aguado J, Álvarez J, Arias M, Ortega F, Méndez MJ, Coto E: Análisis mutacional del gen PKD1 en pacientes con poliquistosis renal dominante. Nefrología 18: 382-388, 1998. 16. Hayashi T, Mochizuki T, Reynolds DM, Wu GQ, Cai Y, Somlo S: Characterization of the exon structure of the polycystic kidney disease 2 gene (PKD2). Genomics 44: 131-136, 1997. 17. Pei Y, He N, Wang K, Kasenda M, Paterson AD, Chan G, Liang Y, Roscoe J, Brissenden J, Hefferton D, Parfrey P, Somlo S, St. George-Hyslop P: A spectrum of mutations in the polycystic kidney disease-2 (PKD2) gene from eight canadian kindreds. J Am Soc Nephrol 9: 1653-1860, 1998. 18. Pei Y, Wang K, Kasenda M, Paterson AD, Liang Y, Huang E, Lian J, Rogovea E, Somlo E, St. George-Hyslop: A novel frameshift mutation induced by an adenosine insertion in the polycystic kidney disease 2 (PKD2) gene. Kidney Int 53: 1127-1132, 1998. 19. Veldhuisen B, Saris JJ, Haij S de, Hayashi T, Reynolds DM, Mochizuki T, Elles R, Fossdal R, Bogdanova N, Dijk MA van, Coto E, Ravine D, Norby S, Verellen-Dumoilin C, Breuning MH, Somlo S, Peters DJM: A spectrum of mutations in the second gene for autosomal dominant polycystic kidney disease (PKD2). Am J Hum Genet 61: 547-555, 1997. 20. Viribay M, Hayashi T, Tellería D, Mochizuki T, Reynolds DM, Alonso R, Lens XM, Moreno F, Harris PC, Somlo S, San Millán JL: Novel stop and frameshifting mutations in the autosomal dominant polycystic kidney disease 2 (PKD2) gene. Hum Genet 101: 229-234, 1997. 21. Xenophontos S, Constantinides R, Hayashi T, Mochizuki T, Somlo S, Pierides A, Constantinou-Deltas C. A translation frameshift mutation induced by a cytosine insertion in the polycystic kidney disease 2 gene (PKD2). Hum Mol Genet 6: 949-952, 1997. 22. Ravine D, Gibson RN, Walker RG, Sheffield LJ, Kincaid-Smith P, Danks DM: Evaluation of ultrasonographic diagnostic criteria for autosomal dominant polycystic kidney disease 1. Lancet 343: 824-827, 1994. 23. Torra R, Badenas C, Darnell A, Nicolau C, Volpini V, Revert L, Estivill: Linkage, clinical features, and prognosis of autosomal dominant polycystic kidney disease types 1 and 2. J Am Soc Nephrol 7: 2142-2151, 1996. 24. Bassam BJ, Caetano-Anolles G, Gresshoff PM: Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem 196: 80-83, 1991. 25. Beaudet A, Tsui L-C: A suggested nomenclature for designating mutations. Hum Mut 2: 245-248, 1993. 26. Hateboer N, Van Dijk MA, Bogdanova N, Coto E, SaggarMalik A, San Millán JL, Torra R, Breuning M, Ravine D: Polycystic kidney disease types 1 and 2: a comparison of phenotypes. Lancet 353: 103-107, 1999. 27. Brasier JL, Kenske EP: Loss of the polycystic kidney disease (PKD1) region of chromosome 16p13 in renal cyst cells supports a loss-of-function model for cyst pathogenesis. J Clin Inves 99: 194-199, 1997. 28. Qian F, Watnick TJ, Onuchic L, Germino GG: The molecular basis of focal cyst formation in human autosomal dominant polycystic kidney disease type I. Cell 87: 979-987, 1996. 29. Torra R, Darnell A, Estivill X, Botey A, Revert L: Interfamilial and intrafamilial variability of clinical expression in autosomal dominant polycystic kidney disease. Contrib Nephrol 115: 97-101, 1995. 30. Ravine D, Walker RG, Gibson RN, Forrest SM, Richards RI, Friend K, Sheffield LJ, Kincaid-Smith P, Danks D: Phenotype and genotype therogeneity in autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet 340: 1330-1333, 1992. 31. Torra R, Badenas C, Darnell A, Camacho JA, Aspinwall R, Harris PC, Estivill X: A 40-kilobases deletion involving the PKD1 and TSC2 genes causes a contiguous gene syndrome: tuberous sclerosis and polycystic kidneys. Am J Kidney Dis 31: 1038-1043, 1998. 46