NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Suplemento 1. 2001 VI. ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR E INSUFICIENCIA RENAL Estrés oxidativo vascular y disfunción endotelial G. Zalba, A. González*, J. Beaumont, G. San José, U. Moreno, B. López, S. Ravassa, P. Muñiz, A. Fortuño, M. A. Fortuño y J. Díez Unidad de Fisiopatología Vascular, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona. *Unidad de Fisiopatología Vascular y becaria del FIS: BEFI 00/9296. Cada vez existen más indicios que sugieren que numerosas condiciones patológicas se asocian con una mayor producción vascular de especies reactivas del oxígeno. Esta forma de estrés oxidativo vascular y particularmente las interacciones entre el óxido nítrico o monóxido de nitrógeno (NO) y los radicales derivados del oxígeno representan un mecanismo patológico común, presente en muchos de los llamados factores de riesgo de la aterosclerosis. Además, las especies reactivas del oxígeno parecen participar en importantes mecanismos de señalización intracelular responsables de muchas de las características de la formación de la lesión vascular. El propósito de esta revisión es examinar los mecanismos por los cuales las células vasculares producen excesivas cantidades de especies reactivas del oxígeno (y en particular anión superóxi­ do, O2 ), considerar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a sus reacciones con el NO, y discutir los efectos de las especies reactivas del oxígeno sobre las enfermedades vasculares caracterizables por presentar disfunción endotelial. ESTRÉS VASCULAR OXIDATIVO El término estrés oxidativo se usa a menudo para referirse a condiciones en las que las células están expuestas a niveles excesivos bien sea de oxígeno molecular o de derivados químicos del oxígeno llamados especies reactivas del oxígeno. En el proceso normal del metabolismo celular, el oxígeno sufre una serie de reducciones univalentes, que llevan secuencialmente ­ a la producción de O2 , peróxido de hidrógeno Correspondencia: Dr. Javier Díez Unidad de Fisiopatología Vascular Irunlarrea, s/n Edificio Departamental 31008 Pamplona E-mail: jadimar@unav.es (H2O2), y H2O. Otros oxidantes que tienen importancia en la biología vascular son el ácido hipoclo­ roso (HOCl), el radical hidroxilo (OH ), el peroxini­ trito (OONO ), los aldehidos reactivos, los peróxidos lipídicos, los radicales lipídicos, y los óxidos de ni­ ­ trógeno. Algunos de estos, tales como el O2 , el OH , y el NO son radicales con un electrón desapareado en su último orbital. Otros oxidantes como el H2O2 ­ o el OONO aunque no son radicales son biológicamente activos. En las células de mamíferos, las fuentes enzimáticas potenciales de especies reactivas del oxígeno incluyen la cadena transportadora de electrones mitocondrial, la xantina oxidasa, la ciclooxigenasa, la lipooxigenasa, la sintasa de NO, hemooxigenasas, peroxidasas, hemoproteínas tales como la hemo y la hematina, y las NADH oxidasas. Una de las fuentes mejor caracterizada de especies reactivas del oxígeno es la NADH oxidasa fagocítica. Este sistema enzimático produce grandes cantidades citotóxicas de radicales cuando se activan las células fagocíticas. En los últimos años se ha descrito que una de las principales fuentes de especies reactivas del oxígeno en los casos sanguíneos es una NADH/NADPH oxidasa asociada a membrana expresada por las células endoteliales, las células de músculo liso vascular, y los fibroblastos, que presenta algunas similaridades con la oxidasa fagocítica (comentado más adelante). Los términos «estrés oxidativo» y «estado redox» se usan a menudo indistintamente, sin prestar atención a su significado real. A diferencia del estrés oxidativo, definido anteriormente, el estado redox o potencial redox de una célula se refiere al ambiente químico dentro la célula en lo que concierne al número de equivalentes reductores disponibles. Esto se puede estimar examinando los cocientes entre los llamados «pares redox». Estos incluyen al lactato/piruvato, al NADH/NAD+, y al cociente entre el glutatión reducido y el oxidado. La exposición de las 61 G. ZALBA y cols. Hormonas (Angotensina II) Citoquinas (TNF) Fuerzas físicas (Estiramiento cíclico) NADH/NADPH oxidasa SOD + e­ O2 ­ O2 Catalasa ­ H+ H2O Adhesión de los monocitos + 2H+ H2O2 productos de reacción del O2 . Mientras que el H2O2 emerge principalmente de la dismutación intra- y ex­ tracelular del O2 por las abundantes superóxido dis­ mutasas, el OONO se forma por la reacción rápida ­ del O2 con el NO (véase más adelante). Es por eso ­ que, muy probablemente la generación de O2 juegue un papel fundamental como fuente de otras muchas especies reactivas del oxígeno. FUENTES ENZIMÁTICAS DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO EN LOS TEJIDOS VASCULARES Aunque hay una mirada de enzimas y de sistemas enzimáticos que potencialmente podrían producir especies reactivas del oxígeno en las células vasculares, tres han sido extensamente estudiadas en los últimos años. Estas comprenden la NADH/NADPH oxidasa, la xantina óxido-reductasa, y la sintasa de NO (NOS), y se comentarán separadamente más adelante. NADH/NADPH oxidasa. La principal fuente de especies reactivas del oxígeno en la adventicia vascular y tanto en células endoteliales como de músculo liso vascular son oxidasas unidas a membrana que emplean NADH y NADPH como substratos 3-5. La estructura de estos sistemas enzimáticos todavía tiene que ser claramente dilucidada. Las NADH/NADPH oxidasas vasculares muestran ciertas similitudes, pero también notables diferencias con la NADPH oxidasa de neutrófilos. Las enzimas vasculares tienen una menor tasa y no muestran el clásico «estallido» de actividad propio de la enzima de neutrófilos. Estas enzimas prefieren predominantemente NADH como substrato 6. Las NADH/NADPH oxidasas de células endoteliales y células de músculo liso vasculares probablemente tampoco son todas iguales. En las células endoteliales se han encontrado todos los componentes de la enzima NADPH oxidasa funcional 7. Por el contrario, en las células de músculo liso sólo se ha podido identificar p22phox y se ha probado su participación en la producción aumentada ­ de O2 tras estimulación con angiotensina II y 3, 8, 9 TNF . Es interesante señalar que, al parecer la actividad de estas oxidasas está regulada por citoquinas, fuerzas físicas, y hormonas tisulares que están muy involucradas en la patogénesis de las enfermedades vasculares relacionadas con el estrés oxidativo (fig. 1). La exposición de células de músculo liso vascular en cultivo a angiotensina II y TNF aumentó la actividad de las NADH/NADPH oxidasas y se observó la formación subsecuente de especies reactivas del oxígeno 3, 4. De acuerdo con esto, el tratamiento de ratas con angiotensina II aumentó la producción ­ Reactividad alterada de las CMLV Crecimiento de las CMLV Vasoconstricción Remodelado vascular Inflamación vascular Hipertensión Aterosclerosis Fig. 1.--Formación y acciones potenciales del anión superóxido ­ (O2 ) en la pared vascular. SOD, superóxido dismutasa; H2O2, peróxido de hidrógeno; CMLV, células de músculo liso vascular. células a condiciones oxidantes puede consumir equivalentes reductores y de este modo alterar el estado redox; no obstante el estado redox se puede alterar de otras formas. Por ejemplo, el tratamiento de células con lactato puede aumentar los niveles de NADH, mediante la conversión de NAD+ en NADH vía la acción de la lactato deshidrogenasa. La exposición a elevadas concentraciones de piruvato puede conseguir el efecto contrario. Asimismo, el estado redox también puede ser alterado por el estrés oxidativo; no obstante un estado redox alterado no tiene por qué cambiar necesariamente el ambiente oxidativo. Se piensa que en la pared vascular, el aumento de estrés oxidativo, principalmente por generación ex­ cesiva de O2 , altera diversas funciones fisiológicas importantes (fig. 1). La regulación del flujo sanguíneo, la inhibición de la agregación plaquetaria, la inhibición de la adhesión leucocitaria, y el control del crecimiento celular están influenciados por el estrés oxidativo. Estos fenómenos modulan en última instancia el diámetro de los vasos, el remodelado y la formación de las lesiones 1, 2. Las especies reactivas del oxígeno que parecen tener relevancia en la bio­ ­ ­ logía vascular incluyen el O2 , el OH , el OONO , los hidroperóxidos lipídicos, los radicales hidroperóxidos y probablemente los radicales tipo hidroxilo. ­ Tanto el H2O2 como el OONO se generan como 62 ESTRÉS OXIDATIVO VASCULAR Y DISFUNCIÓN ENDOTELIAL vascular de O2 independientemente de la hipertensión concomitante, como evidencian experimentos paralelos que empleaban infusiones continuadas de ­ noradrenalina 10. La generación de O2 inducida por angiotensina II era dependiente de NADH/NADPH y lo más probable es que ocurriese en el músculo liso 11. También se ha probado que el estiramiento ­ cíclico aumenta la producción tanto de O2 como de H2O2 por parte de las células endoteliales y de las células de músculo liso vascular 12-14. Xantina oxido-reductasa. La xantina óxido-reductasa es una molibdoenzima capaz de catalizar la oxidación de la hipoxantina y la xantina en el proceso del metabolismo de las purinas. Existen dos formas interconvertibles de la xantina óxido-reductasa, la xantina deshidrogenasa y la xantina oxidasa. La primera reduce NAD+, mientras que la última prefiere oxígeno molecular llevando a la producción tanto de ­ O2 como de H2O215. Se ha demostrado que los estadios tempranos de colesterolemia se asocian con una ­ producción aumentada de O2 derivada de la xantina oxidasa endotelial 16, 17. Tanto la inhibición de la xantina oxidasa con oxipurinol como su desplazamiento del lugar de unión de la heparina mediante infusión de heparina mejoró el deterioro en la relajación vascular dependiente de endotelio. Recientemente, se ha probado que la xantina oxido-reductasa se localiza asimétricamente en la superficie externa de células endoteliales humanas en cultivo 18. El papel de la xantina oxidasa en la producción vascular de especies reactivas del oxígeno no está todavía bien definido, en parte debido a que en la forma oxidasa, la enzima no se inhibe con oxipurinol y puede emplear NADH como substrato para la reducción de oxígeno 15, y de este modo puede enmascararse como una NADH oxidasa, similar al sistema enzimático descrito anteriormente. Los métodos para separar la función de los dos sistemas enzimáticos no están todavía universalmente disponibles. NOS endotelial. Otra fuente potencial de produc­ ción de O2 vascular es la isoforma endotelial de la NOS (eNOS). Estudios anteriores con NOS neuronal demostraron que este tipo de enzima es capaz de producir especies reactivas del oxígeno si la L-arginina o la tetrahidrobiopterina están ausentes 19, 20. Es interesante el hecho de que, también se ha observado que el co-factor de la NOS tetrahidro biopterina ­ es capaz de generar O2 de forma no enzimática, y que esto limita la capacidad de la NOS para producir NO libre en ausencia de la superóxido dismutasa21. Recientemente, estos estudios se han extendido a la eNOS. Xia y cols., han demostrado que en ausencia de tetrahidro­ biopterina, la eNos puede generar O2, probablemente vía su centro hemo. En este estudio, la producción de ­ O2 por parte de la eNOS no se vio afectada por la L- ­ O­ 2 NO OONO Injuria O­ 2 OONO ­ ­ Detoxificación R-SNO2 R-SON Daño del ADN, lípidos y proteínas NO Lesión vascular Protección vascular Fig. 2.--Formación y acciones potenciales del peroxinitrito ­ (OONO ­) en la pared vascular. O2 , anión superóxido; NO, óxido nítrico; R-SNO2, nitrosotiol. arginina22. Vasquez-Vivar y cols., han observado que la ­ eNOS puede producir cantidades considerables de O2 23 mediante dos mecanismos distintos . En ausencia de co-factores suficientes, el dominio oxigenasa de la eNOS ­ es capaz de generar O2 a partir de la disociación del complejo hemo ferroso-dioxígeno. Estos investigadores también han demostrado que las flavinas del dominio ­ reductasa de la eNOS pueden producir O2. Mientras que ­ la generación de O2 por parte de la eNOS puede ser demostrada en preparaciones bioquímicas in vitro, no está tan claro que las enzimas NOS estén alguna vez tan desprovistas de sus co-factores in vivo como para ­ poder servir como fuente de O2. Pritchard y sus cols. han constatado que el tratamiento de células endoteliales en cultivo con lipoproteína de baja densidad (LDL) ­ nativa, puede aumentar su producción de O2 en una forma que parece ser dependiente de eNOS, quizá debida a la disociación de la L-arginina de la eNOS24. El mecanismo mediante el cual las LDL podrían afectar de esta manera a la función de la eNOS no ha sido definido, sin embargo, un mecanismo tal podría tener consecuencias patológicas sustanciales. ­ REACCIONES DEL O2 CON EL NO EN LA PARED VASCULAR Tanto el O2 como el NO son radicales altamente reactivos e inestables. Por lo tanto, no es sorprendente que reaccionen muy rápido a un ritmo estimado de 6,7 × 109 mol s­1 para formar como pro­ ducto principal OONO (fig. 2) 25. Esta reacción es 63 ­ G. ZALBA y cols. aproximadamente tres veces más rápida que la dis­ mutación de O2 por la superóxido dismutasa, esto implica que posiblemente la generación aumentada ­ de O2 en la pared vascular inhiba las funciones fi­ siológicas del NO. Además el OONO es un oxi­ dante fuerte y es más estable que el NO o el O2 26. ­ A pH neutro, el OONO puede protonarse para formar ácido peroxinitroso que por ruptura homolítica puede producir radicales tipo hidroxilo y dióxido de nitrógeno que también son oxidantes fuertes 27, 28. ­ Aunque el OONO puede producir vasodilatación, este efecto ocurre a concentraciones mucho mayores que las concentraciones vasorrelajantes efectivas del NO 29-32. Las reacciones de oxidación ­ inducidas por el OONO tales como la modificación de grupos hierro-sulfuro, dedos de zinc, proteínas con grupos tioles, y lípidos de membrana probablemente estén implicadas en numerosos procesos fisiopatológicos 22, 27, 33. Los efectos probablemente relacionados con las enfermedades vasculares están ilustrados en la figura 2. Además de su exagerada producción a partir de ­ ­ NO y O2 , el excesivo OONO también puede provenir de una metabolización deficiente de este compuesto por los agentes «detoxificantes» presentes en el ambiente vascular. Hasta ahora se han descrito ­ dos vías de metabolización del OONO : una implicando la generación de componentes nitrosotioles 34 y la otra incluyendo un mecanismo tiol-independiente que todavía no ha sido identificado 35. IMPORTANCIA FISIOPATOLÓGICA Poco después del descubrimiento del EDRF (factor relajante derivado de endotelio) se hizo aparente que algunas enfermedades se asocian con un deterioro de la vasorrelajación dependiente de endotelio. En conejos y monos hipercolesterolémicos, la varorrelajación mediada por acetilcolina es casi nula o ha cambiado a vasoconstricción 36, 37. Se han hecho observaciones similares en pacientes con enfermedad arterial coronaria 38, 39 o con factores de riesgo que predisponen a la aterosclerosis 40. Del mismo modo, la vasorrelajación dependiente de endotelio es anormal en enfermedades tales como la insuficiencia cardíaca, la diabetes y la hipertensión 41. En la mayoría de estos desórdenes, hay una pérdida de producción endotelial y/o biodisponibilidad de NO. Esta alteración de la función vascular se ha denominado en la literatura científica disfunción endotelial. Aunque este término es ampliamente empleado, es bastante impreciso. La disfunción endotelial puede referirse al deterioro de otras funciones endoteliales importantes distintas a la va64 sodilatación, incluyendo las propiedades anticoagulantes y anti-inflamatorias del endotelio 2, 42. Con todo, el término disfunción endotelial ha llegado a ser ampliamente utilizado, y de hecho, la pérdida de NO en estas condiciones puede contribuir a alteraciones en otros aspectos de la función vascular. Es casi seguro que los mecanismos que subyacen a la alteración de la relajación vascular dependiente de endotelio en diversas enfermedades son multifactoriales, y parecen depender de la condición patológica específica, de su duración, y del lecho vascular que se estudie. El tratamiento con L-arginina o con tetrahidrobiopterina ha mejorado la vasodilatación mediada por NO en algunos casos, lo que sugiere que puede existir una deficiencia bien del substrato de la enzima eNOS o bien de uno de sus co-factores críticos. Las alteraciones en la señalización celular endotelial pueden deteriorar la activación apropiada de la eNOS en respuesta a estímulos neurohumorales o mecánicos. En aterosclerosis muy avanzadas, la expresión de eNOS en el endotelio decae, casi seguro disminuyendo la relajación vascular dependiente de endotelio. Por último, existen claras evidencias de que en algunas enfermedades, la producción de NO no está alterada, pero su biodisponibilidad está reducida debido a la inactivación oxidativa por la ­ producción excesiva de O2 en la pared vascular 43. Se han encontrado evidencias de este fenómeno en condiciones tan diversas como la hipercolesterolemia, la hipertensión, el tabaquismo, la aterosclerosis, la diabetes y la insuficiencia cardíaca 44. Es más, algunas de las alteraciones vasculares presentes en estas condiciones se pueden atribuir a los efectos ­ perjudiciales de un exceso de OONO 45. RESUMEN Y PERSPECTIVAS Cada vez hay más datos provenientes de experimentos animales e investigaciones clínicas que indican que una serie de enfermedades cardiovasculares ­ se asocian con una producción aumentada de O2 vascular, deteriorando las importantes funciones del NO de producción endotelial y potenciando la disponibi­ lidad del dañino OONO . Los mecanismos mediante los cuales las células vasculares producen un ex­ ceso de O2 están saliendo a la luz ahora, y probablemente serán un objetivo para futuras terapias. Por ejemplo, datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que la administración crónica del antagonista del receptor de la angiotensina II tipo 1 (AT1) irbesartan a ratas con hipertensión espontánea ­ corrige la producción aumentada de O2 dependiente de las NADH/NADPH oxidasas en la pared vascu- ESTRÉS OXIDATIVO VASCULAR Y DISFUNCIÓN ENDOTELIAL lar 46. Además, este efecto se asoció con la restauración de la función endotelial normal en los animales tratados. Se requieren estudios posteriores para investigar si el bloqueo de los receptores AT1 también corregirá la disfunción endotelial vía la supresión del estrés oxidativo en los pacientes hipertensos. BIBLIOGRAFÍA 1. 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N E F R O L O G I A 66 O T I C I A S FRANCISCO MADUELL CANALS PREMIO TOYP 2000 EN INNOVACIÓN MÉDICA Francisco Maduell Canals, Nefrólogo del Hospital General de Castellón, ha sido elegido uno de los diez jóvenes excelentes del mundo y ha recibido el prestigioso premio TOYP («The Outstanding Young Persons») que otorga The Junior Chamber International. Ha sido galardonado en la categoría de Innovación Médica. El programa se instituyó inicialmente, en el año 1938, en los EE.UU. por The United States Junior Chamber y desde entonces han sido TOYP's personajes tan famosos como Orson Welles, Howard Hugues, Nelson Rockefeller, John F. Kennedy, Henry Kissinger, Gerald Ford y más recientemente Bill Clinton. La Junior Chamber International instituyó los premios a nivel mundial en el 1982 con la participación de más de 120 países. El premio otorgado a Francisco Maduell representa el primero y único que ha conseguido un ciudadano español.