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dos genes han sido identificados como causantes de la enfermedad&#58; PKD1&#44; en la regi&#243;n cromos&#243;mica 16p13&#46;3 &#40;85&#37; de los casos&#41;&#44; y PKD2&#44; en la regi&#243;n cromos&#243;mica 4q21 &#40;15&#37; de los casos&#41;&#46; La PQRAD se diagnostica con facilidad por ecograf&#237;a cuando los quistes ya est&#225;n presentes&#46; Sin embargo&#44; el an&#225;lisis gen&#233;tico puede ser utilizado cuando los resultados ecogr&#225;ficos son confusos&#44; o cuando se requiere un diagn&#243;stico definitivo en un individuo menor de 30 a&#241;os&#46; Una aplicaci&#243;n importante del diagn&#243;stico molecular es el consejo gen&#233;tico&#44; consistente en proporcionar al paciente informaci&#243;n sobre su enfermedad&#44; el patr&#243;n de herencia y el riesgo de trasmisi&#243;n a la descendencia &#40;50&#37;&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; puede aplicarse en familias con PQRAD para confirmar posibles donantes de ri&#241;&#243;n&#46; Por otro lado&#44; actualmente se est&#225;n llevando a cabo ensayos cl&#237;nicos en los que se pone a prueba la capacidad de ciertos f&#225;rmacos para frenar la progresi&#243;n de la enfermedad<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; Los pacientes con un diagn&#243;stico temprano podr&#237;an ser candidatos al tratamiento con estos nuevos agentes terap&#233;uticos en un futuro&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El an&#225;lisis molecular se puede llevar a cabo mediante b&#250;squeda directa de mutaciones o de forma indirecta&#44; por an&#225;lisis de ligamiento&#44; usando marcadores informativos &#40;microsat&#233;lites&#41;&#44; localizados en las proximidades de los genes de inter&#233;s&#46; Estos marcadores permiten realizar el seguimiento del cromosoma responsable de la enfermedad a trav&#233;s de las generaciones de la familia estudiada&#46; Dos series de microsat&#233;lites seleccionados en un estudio previo para PKD1 &#40;&#40;D16S521&#44; KG8&#44; AC2&#46;5&#44; CW2&#44; SM7&#41; y PKD2 &#40;D4S1538&#44; D4S1534&#44; D4S423&#44; D4S414&#41; fueron usadas para el an&#225;lisis de ligamiento en familias con PQRAD &#40;Figura 1&#41;&#46; La idoneidad de estos marcadores para nuestra poblaci&#243;n fue estudiada en 30 familias afectas<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Los marcadores fueron amplificados de forma individual y mezclados posteriormente para el an&#225;lisis&#44; permitiendo una identificaci&#243;n gen&#233;tica inequ&#237;voca del 97&#46;7&#37; de los pacientes y el 88&#46;7&#37; de los individuos sanos&#46; La sensibilidad y la especificidad del an&#225;lisis gen&#233;tico fueron 90&#46;7&#37; &#40;IC95&#37;&#58; 85&#46;7-95&#46;7&#41; y 86&#46;8&#37; &#40;IC95&#37;&#58; 80&#46;6-93&#46;0&#41;&#44; respectivamente&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En este trabajo&#44; se presenta un nuevo an&#225;lisis de microsat&#233;lites de PKD1 y PKD2 basado en PCR m&#250;ltiple y electroforesis capilar&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material y m&#233;todos</span></p><p class="elsevierStylePara">Un total de 110 individuos&#44; 52 afectos &#40;57&#44;7&#37; hombres&#41; y 58 sanos &#40;39&#44;7&#37; hombres&#41;&#44; fueron analizados por el nuevo sistema de PCR m&#250;ltiple&#46; Estos individuos pertenec&#237;an a 14 familias con PQRAD que fueron escogidas de manera aleatoria entre aquellas incluidas en el an&#225;lisis previo<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; El estudio fue aprobado por el Comit&#233; &#201;tico del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr&#46; Negr&#237;n&#46; Asimismo&#44; se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes en el estudio antes de su inclusi&#243;n en el mismo&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una nueva serie de cebadores fue dise&#241;ada para el desarrollo de la PCR m&#250;ltiple&#44; asegurando una eficiencia de amplificaci&#243;n equivalente para todos los fragmentos de ADN&#44; como se ha descrito previamente<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#46; La longitud de los fragmentos amplificados vari&#243; entre 75 y 158 pares de bases &#40;Tabla I&#41;&#46; El objetivo fue obtener cebadores con un contenido en GC en torno al 35-60&#37; y una temperatura de fusi&#243;n te&#243;rica de 60&#186;C&#177; 2&#186;C a una concentraci&#243;n de sales &#40;K&#43;&#44;Na&#43;&#44; Tris&#43;&#44; &#243; NH4&#43;&#41; de 180mM&#46; Como lugar de uni&#243;n de cebadores&#44; se evitaron las secuencias complejas&#44; homopol&#237;meros con m&#225;s de cinco bases&#44; y las estructuras secundarias potencialmente estables &#40;por debajo del umbral de -13 kcal mol&#8211;1 de energ&#237;a libre&#41; alrededor de cada regi&#243;n de marcadores&#44; para garantizar la sensibilidad y especificidad de la amplificaci&#243;n m&#250;ltiple<span class="elsevierStyleSup">6</span>&#46; Usando el programa disponible en Integrated DNA Technologies &#40;http&#58;&#47;&#47;www&#46;idtdna&#46;com&#47;Scitools&#47;Applications&#47;mFold&#47;&#41;&#44; se comprob&#243; que ninguno de los cebadores candidatos presentaba estructuras secundarias o en horquilla&#46; Los cebadores fueron sintetizados y purificados por HPLC por Bioron GmbH &#40;Ludwigshafen&#44; Germany&#41; y Applied Biosystems &#40;Foster City&#44; USA&#41;&#46; Para diferenciar los productos amplificados de tama&#241;o parecido se us&#243; fluorescencia multicolor&#44; marcando el cebador sentido de cada par con uno de los siguientes fluor&#243;foros&#58; 6-FAM&#44; HEX o NED&#46; Cada par de cebadores fue probado en una PCR individual&#44; con cinco muestras de ADN&#44; bajo id&#233;nticas condiciones de amplificaci&#243;n&#44; antes de desarrollar la reacci&#243;n de PCR m&#250;ltiple&#46; La cantidad de cada cebador incluida en la mezcla final fue establecida de forma emp&#237;rica&#44; de acuerdo con los resultados de pruebas sucesivas&#46; Igualmente&#44; se probaron diluciones seriadas de MgCl2&#44; desde 1&#46;5 mM a 5 mM&#44; para conseguir la m&#225;xima eficiencia de amplificaci&#243;n&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Debido a un ligero solapamiento entre el rango de tama&#241;os de CW2 y D4S414 en algunas muestras&#44; decidimos analizar los marcadores de PKD1 y PKD2 por separado&#46; Ambas reacciones conten&#237;an 1-10ng de ADN&#44; 3 mM MgCl2&#44; 200 &#181;M de cada dNTP&#44; 0&#46;05-0&#46;1 &#181;M de cada cebador&#44; y 0&#46;5 U de polimerasa AmpliTaq Gold &#40;Applied Biosystems&#41; en un volumen final de reacci&#243;n de 12&#46;5 &#181;l&#46; El protocolo de amplificaci&#243;n se llev&#243; a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 &#40;Applied Biosystems&#41;&#44; y consisti&#243; en una desnaturalizaci&#243;n a 95&#186;C durante 5 minutos&#44; seguida de 26 ciclos de 95&#186;C durante 30 segundos&#44; 65&#186;C durante 30 segundos&#44; y 72&#186;C durante 45 segundos&#44; con un paso de extensi&#243;n final de 20 minutos a 72&#186;C&#46; Se obtuvo un producto del tama&#241;o esperado para todos los loci&#46; Con objeto de analizar la robustez de la PCR m&#250;ltiple&#44; todas las muestras fueron analizadas por duplicado&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La detecci&#243;n de los fragmentos de PCR mediante electroforesis capilar se llev&#243; a cabo en un secuenciador ABI PRISM<span class="elsevierStyleSup">TM 310 </span>&#40;Applied Biosystems&#41;&#44; usando un capilar no recubierto de 47 cm de longitud y pol&#237;mero POP4 &#40;Applied Biosystems&#41;&#46; Para la electroforesis&#44; 1&#181;l de cada producto de PCR se mezcl&#243; con 20 &#181;l de formamida desionizada &#40;Applied Biosystems&#41; y 0&#46;2 &#181;l del marcador de peso molecular GeneScan-ROX &#40;Applied Biosystems&#41;&#46; Las muestras fueron inyectadas a 15 KV durante 5 segundos&#44; y separadas al mismo voltaje y una temperatura de 60&#186;C durante 24 minutos&#46; Para la estimaci&#243;n del tama&#241;o de los fragmentos se utiliz&#243; el programa GeneScan Analysis 3&#46;1&#46;2 &#40;Applied Biosystems&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">Inicialmente&#44; cuatro marcadores &#40;D4S423&#44; CW2&#44; D16S521 y SM7&#41; dieron una se&#241;al d&#233;bil&#44; sugiriendo una amplificaci&#243;n pobre con las mismas condiciones y cantidades de cebador&#46; Las reacciones mejoraron al aumentar la cantidad de cebador&#44; alcanzando as&#237; el equilibrio adecuado entre las se&#241;ales&#46; Los mejores resultados fueron obtenidos a una concentraci&#243;n de 3mM MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span> para todos los marcadores &#40;Figura 2&#41;&#46; Las concentraciones ligeramente superiores inhib&#237;an la amplificaci&#243;n&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La identificaci&#243;n de los haplotipos individuales mostr&#243; una concordancia del 100&#37; con los resultados previos del an&#225;lisis por PCR simple&#46; Los marcadores fueron totalmente informativos en todos los pacientes y en un 91&#46;4&#37; de los individuos sanos&#46; La PCR m&#250;ltiple mostr&#243; una especificidad del 88&#44;5&#37; &#40;IC95&#37;&#61; 75&#44;9-95&#44;2&#41;&#44; y una sensibilidad del 87&#44;9 &#40;IC95&#37;&#61; 76&#44;1-94&#44;6&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">&#160;</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara">Se ha descrito un gran n&#250;mero de marcadores para el an&#225;lisis de los genes PKD1 y PKD2&#46; En nuestro estudio previo<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#44; empleamos un sistema simple de PCR para amplificar dos series de marcadores microsat&#233;lites de PKD1 y PKD2&#46; Para desarrollar esta t&#233;cnica era necesario llevar a cabo nueve reacciones de PCR diferentes para cada individuo&#44; mezclar los productos de amplificaci&#243;n&#44; y finalmente preparar la muestra para electroforesis capilar&#46; Hasta la fecha&#44; el sistema de PCR m&#250;ltiple m&#225;s simple publicado hasta el momento para el an&#225;lisis de PQRAD es el de Vouk et al<span class="elsevierStyleSup">7</span>&#44; que consiste en tres reacciones de amplificaci&#243;n&#44; combinando marcadores de PKD1 y PKD2&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una parte importante de nuestro trabajo consisti&#243; en explorar varios aspectos de los m&#233;todos de PCR m&#250;ltiple&#46; Los cebadores fueron dise&#241;ados poniendo especial inter&#233;s en evitar el autoalineamiento y la formaci&#243;n de d&#237;meros&#44; obteniendo la m&#225;xima eficiencia y equilibrio entre las cantidades de los productos de amplificaci&#243;n&#46; Los cebadores fueron sometidos a HPLC para obtener mol&#233;culas puras y homog&#233;neas&#44; sin excedentes de fluor&#243;foros que pudieran interferir en la detecci&#243;n de los alelos&#46; Para evitar productos de amplificaci&#243;n inespec&#237;ficos se utiliz&#243; un programa de PCR Hot Start &#40;en el que la polimerasa se activa a temperaturas elevadas y los productos de PCR se van acumulando lentamente&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Hemos desarrollado un nuevo sistema de PCR m&#250;ltiple para genotipar 9 marcadores microsat&#233;lites de PQRAD en s&#243;lo dos reacciones&#46; Una ventaja adicional de este sistema es que permite el an&#225;lisis independiente de PKD1 &#243; PKD2&#46; Dado que un 85-90&#37; de la PQRAD est&#225; ligada a PKD1&#44; el an&#225;lisis de los marcadores de este gen ser&#225; suficiente para determinar las caracter&#237;sticas gen&#233;ticas de la familia en muchos casos&#46; El an&#225;lisis gen&#233;tico mediante el sistema de PCR m&#250;ltiple facilita tanto el consejo gen&#233;tico como el diagnostico temprano&#44; de creciente importancia en esta enfermedad&#46; En conclusi&#243;n&#44; esta estrategia junto con la detecci&#243;n autom&#225;tica de alelos&#44; permite realizar un an&#225;lisis gen&#233;tico fiable&#44; sencillo&#44; m&#225;s r&#225;pido y de menor coste que el basado en amplificaciones individuales de los microsat&#233;lites&#44; favoreciendo la inclusi&#243;n de los estudios familiares en la rutina cl&#237;nica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;figura1&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_figura1.jpg"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Figura 1&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;figura2&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_figura2.jpg"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Figura 2&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;tabla1&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_tabla1.gif"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Tabla 1&#46; </p>"
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Diagnóstico Genético de Poliquistosis Renal Autosómica Dominante mediante PCR múltiple1
Genetic diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease using multiplex-PCR
Nisa Buset Ríosa, María J. Torres Galvána, Juan J. Sánchezb, Carmen R. Hernándezc, Érika Hernándeza, José C. Rodríguez Pérezd
a Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria Las Palmas de Gran Canaria España,
b Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Santa Cruz de Tenerife, Santa Cruz de Tenerife, España,
c Servicio de Radiodiagnóstico, Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria Las Palmas de Gran Canaria España,
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dos genes han sido identificados como causantes de la enfermedad&#58; PKD1&#44; en la regi&#243;n cromos&#243;mica 16p13&#46;3 &#40;85&#37; de los casos&#41;&#44; y PKD2&#44; en la regi&#243;n cromos&#243;mica 4q21 &#40;15&#37; de los casos&#41;&#46; La PQRAD se diagnostica con facilidad por ecograf&#237;a cuando los quistes ya est&#225;n presentes&#46; Sin embargo&#44; el an&#225;lisis gen&#233;tico puede ser utilizado cuando los resultados ecogr&#225;ficos son confusos&#44; o cuando se requiere un diagn&#243;stico definitivo en un individuo menor de 30 a&#241;os&#46; Una aplicaci&#243;n importante del diagn&#243;stico molecular es el consejo gen&#233;tico&#44; consistente en proporcionar al paciente informaci&#243;n sobre su enfermedad&#44; el patr&#243;n de herencia y el riesgo de trasmisi&#243;n a la descendencia &#40;50&#37;&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; puede aplicarse en familias con PQRAD para confirmar posibles donantes de ri&#241;&#243;n&#46; Por otro lado&#44; actualmente se est&#225;n llevando a cabo ensayos cl&#237;nicos en los que se pone a prueba la capacidad de ciertos f&#225;rmacos para frenar la progresi&#243;n de la enfermedad<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; Los pacientes con un diagn&#243;stico temprano podr&#237;an ser candidatos al tratamiento con estos nuevos agentes terap&#233;uticos en un futuro&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El an&#225;lisis molecular se puede llevar a cabo mediante b&#250;squeda directa de mutaciones o de forma indirecta&#44; por an&#225;lisis de ligamiento&#44; usando marcadores informativos &#40;microsat&#233;lites&#41;&#44; localizados en las proximidades de los genes de inter&#233;s&#46; Estos marcadores permiten realizar el seguimiento del cromosoma responsable de la enfermedad a trav&#233;s de las generaciones de la familia estudiada&#46; Dos series de microsat&#233;lites seleccionados en un estudio previo para PKD1 &#40;&#40;D16S521&#44; KG8&#44; AC2&#46;5&#44; CW2&#44; SM7&#41; y PKD2 &#40;D4S1538&#44; D4S1534&#44; D4S423&#44; D4S414&#41; fueron usadas para el an&#225;lisis de ligamiento en familias con PQRAD &#40;Figura 1&#41;&#46; La idoneidad de estos marcadores para nuestra poblaci&#243;n fue estudiada en 30 familias afectas<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Los marcadores fueron amplificados de forma individual y mezclados posteriormente para el an&#225;lisis&#44; permitiendo una identificaci&#243;n gen&#233;tica inequ&#237;voca del 97&#46;7&#37; de los pacientes y el 88&#46;7&#37; de los individuos sanos&#46; La sensibilidad y la especificidad del an&#225;lisis gen&#233;tico fueron 90&#46;7&#37; &#40;IC95&#37;&#58; 85&#46;7-95&#46;7&#41; y 86&#46;8&#37; &#40;IC95&#37;&#58; 80&#46;6-93&#46;0&#41;&#44; respectivamente&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En este trabajo&#44; se presenta un nuevo an&#225;lisis de microsat&#233;lites de PKD1 y PKD2 basado en PCR m&#250;ltiple y electroforesis capilar&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material y m&#233;todos</span></p><p class="elsevierStylePara">Un total de 110 individuos&#44; 52 afectos &#40;57&#44;7&#37; hombres&#41; y 58 sanos &#40;39&#44;7&#37; hombres&#41;&#44; fueron analizados por el nuevo sistema de PCR m&#250;ltiple&#46; Estos individuos pertenec&#237;an a 14 familias con PQRAD que fueron escogidas de manera aleatoria entre aquellas incluidas en el an&#225;lisis previo<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; El estudio fue aprobado por el Comit&#233; &#201;tico del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr&#46; Negr&#237;n&#46; Asimismo&#44; se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes en el estudio antes de su inclusi&#243;n en el mismo&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una nueva serie de cebadores fue dise&#241;ada para el desarrollo de la PCR m&#250;ltiple&#44; asegurando una eficiencia de amplificaci&#243;n equivalente para todos los fragmentos de ADN&#44; como se ha descrito previamente<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#46; La longitud de los fragmentos amplificados vari&#243; entre 75 y 158 pares de bases &#40;Tabla I&#41;&#46; El objetivo fue obtener cebadores con un contenido en GC en torno al 35-60&#37; y una temperatura de fusi&#243;n te&#243;rica de 60&#186;C&#177; 2&#186;C a una concentraci&#243;n de sales &#40;K&#43;&#44;Na&#43;&#44; Tris&#43;&#44; &#243; NH4&#43;&#41; de 180mM&#46; Como lugar de uni&#243;n de cebadores&#44; se evitaron las secuencias complejas&#44; homopol&#237;meros con m&#225;s de cinco bases&#44; y las estructuras secundarias potencialmente estables &#40;por debajo del umbral de -13 kcal mol&#8211;1 de energ&#237;a libre&#41; alrededor de cada regi&#243;n de marcadores&#44; para garantizar la sensibilidad y especificidad de la amplificaci&#243;n m&#250;ltiple<span class="elsevierStyleSup">6</span>&#46; Usando el programa disponible en Integrated DNA Technologies &#40;http&#58;&#47;&#47;www&#46;idtdna&#46;com&#47;Scitools&#47;Applications&#47;mFold&#47;&#41;&#44; se comprob&#243; que ninguno de los cebadores candidatos presentaba estructuras secundarias o en horquilla&#46; Los cebadores fueron sintetizados y purificados por HPLC por Bioron GmbH &#40;Ludwigshafen&#44; Germany&#41; y Applied Biosystems &#40;Foster City&#44; USA&#41;&#46; Para diferenciar los productos amplificados de tama&#241;o parecido se us&#243; fluorescencia multicolor&#44; marcando el cebador sentido de cada par con uno de los siguientes fluor&#243;foros&#58; 6-FAM&#44; HEX o NED&#46; Cada par de cebadores fue probado en una PCR individual&#44; con cinco muestras de ADN&#44; bajo id&#233;nticas condiciones de amplificaci&#243;n&#44; antes de desarrollar la reacci&#243;n de PCR m&#250;ltiple&#46; La cantidad de cada cebador incluida en la mezcla final fue establecida de forma emp&#237;rica&#44; de acuerdo con los resultados de pruebas sucesivas&#46; Igualmente&#44; se probaron diluciones seriadas de MgCl2&#44; desde 1&#46;5 mM a 5 mM&#44; para conseguir la m&#225;xima eficiencia de amplificaci&#243;n&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Debido a un ligero solapamiento entre el rango de tama&#241;os de CW2 y D4S414 en algunas muestras&#44; decidimos analizar los marcadores de PKD1 y PKD2 por separado&#46; Ambas reacciones conten&#237;an 1-10ng de ADN&#44; 3 mM MgCl2&#44; 200 &#181;M de cada dNTP&#44; 0&#46;05-0&#46;1 &#181;M de cada cebador&#44; y 0&#46;5 U de polimerasa AmpliTaq Gold &#40;Applied Biosystems&#41; en un volumen final de reacci&#243;n de 12&#46;5 &#181;l&#46; El protocolo de amplificaci&#243;n se llev&#243; a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 &#40;Applied Biosystems&#41;&#44; y consisti&#243; en una desnaturalizaci&#243;n a 95&#186;C durante 5 minutos&#44; seguida de 26 ciclos de 95&#186;C durante 30 segundos&#44; 65&#186;C durante 30 segundos&#44; y 72&#186;C durante 45 segundos&#44; con un paso de extensi&#243;n final de 20 minutos a 72&#186;C&#46; Se obtuvo un producto del tama&#241;o esperado para todos los loci&#46; Con objeto de analizar la robustez de la PCR m&#250;ltiple&#44; todas las muestras fueron analizadas por duplicado&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La detecci&#243;n de los fragmentos de PCR mediante electroforesis capilar se llev&#243; a cabo en un secuenciador ABI PRISM<span class="elsevierStyleSup">TM 310 </span>&#40;Applied Biosystems&#41;&#44; usando un capilar no recubierto de 47 cm de longitud y pol&#237;mero POP4 &#40;Applied Biosystems&#41;&#46; Para la electroforesis&#44; 1&#181;l de cada producto de PCR se mezcl&#243; con 20 &#181;l de formamida desionizada &#40;Applied Biosystems&#41; y 0&#46;2 &#181;l del marcador de peso molecular GeneScan-ROX &#40;Applied Biosystems&#41;&#46; Las muestras fueron inyectadas a 15 KV durante 5 segundos&#44; y separadas al mismo voltaje y una temperatura de 60&#186;C durante 24 minutos&#46; Para la estimaci&#243;n del tama&#241;o de los fragmentos se utiliz&#243; el programa GeneScan Analysis 3&#46;1&#46;2 &#40;Applied Biosystems&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">Inicialmente&#44; cuatro marcadores &#40;D4S423&#44; CW2&#44; D16S521 y SM7&#41; dieron una se&#241;al d&#233;bil&#44; sugiriendo una amplificaci&#243;n pobre con las mismas condiciones y cantidades de cebador&#46; Las reacciones mejoraron al aumentar la cantidad de cebador&#44; alcanzando as&#237; el equilibrio adecuado entre las se&#241;ales&#46; Los mejores resultados fueron obtenidos a una concentraci&#243;n de 3mM MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span> para todos los marcadores &#40;Figura 2&#41;&#46; Las concentraciones ligeramente superiores inhib&#237;an la amplificaci&#243;n&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La identificaci&#243;n de los haplotipos individuales mostr&#243; una concordancia del 100&#37; con los resultados previos del an&#225;lisis por PCR simple&#46; Los marcadores fueron totalmente informativos en todos los pacientes y en un 91&#46;4&#37; de los individuos sanos&#46; La PCR m&#250;ltiple mostr&#243; una especificidad del 88&#44;5&#37; &#40;IC95&#37;&#61; 75&#44;9-95&#44;2&#41;&#44; y una sensibilidad del 87&#44;9 &#40;IC95&#37;&#61; 76&#44;1-94&#44;6&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">&#160;</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara">Se ha descrito un gran n&#250;mero de marcadores para el an&#225;lisis de los genes PKD1 y PKD2&#46; En nuestro estudio previo<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#44; empleamos un sistema simple de PCR para amplificar dos series de marcadores microsat&#233;lites de PKD1 y PKD2&#46; Para desarrollar esta t&#233;cnica era necesario llevar a cabo nueve reacciones de PCR diferentes para cada individuo&#44; mezclar los productos de amplificaci&#243;n&#44; y finalmente preparar la muestra para electroforesis capilar&#46; Hasta la fecha&#44; el sistema de PCR m&#250;ltiple m&#225;s simple publicado hasta el momento para el an&#225;lisis de PQRAD es el de Vouk et al<span class="elsevierStyleSup">7</span>&#44; que consiste en tres reacciones de amplificaci&#243;n&#44; combinando marcadores de PKD1 y PKD2&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una parte importante de nuestro trabajo consisti&#243; en explorar varios aspectos de los m&#233;todos de PCR m&#250;ltiple&#46; Los cebadores fueron dise&#241;ados poniendo especial inter&#233;s en evitar el autoalineamiento y la formaci&#243;n de d&#237;meros&#44; obteniendo la m&#225;xima eficiencia y equilibrio entre las cantidades de los productos de amplificaci&#243;n&#46; Los cebadores fueron sometidos a HPLC para obtener mol&#233;culas puras y homog&#233;neas&#44; sin excedentes de fluor&#243;foros que pudieran interferir en la detecci&#243;n de los alelos&#46; Para evitar productos de amplificaci&#243;n inespec&#237;ficos se utiliz&#243; un programa de PCR Hot Start &#40;en el que la polimerasa se activa a temperaturas elevadas y los productos de PCR se van acumulando lentamente&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Hemos desarrollado un nuevo sistema de PCR m&#250;ltiple para genotipar 9 marcadores microsat&#233;lites de PQRAD en s&#243;lo dos reacciones&#46; Una ventaja adicional de este sistema es que permite el an&#225;lisis independiente de PKD1 &#243; PKD2&#46; Dado que un 85-90&#37; de la PQRAD est&#225; ligada a PKD1&#44; el an&#225;lisis de los marcadores de este gen ser&#225; suficiente para determinar las caracter&#237;sticas gen&#233;ticas de la familia en muchos casos&#46; El an&#225;lisis gen&#233;tico mediante el sistema de PCR m&#250;ltiple facilita tanto el consejo gen&#233;tico como el diagnostico temprano&#44; de creciente importancia en esta enfermedad&#46; En conclusi&#243;n&#44; esta estrategia junto con la detecci&#243;n autom&#225;tica de alelos&#44; permite realizar un an&#225;lisis gen&#233;tico fiable&#44; sencillo&#44; m&#225;s r&#225;pido y de menor coste que el basado en amplificaciones individuales de los microsat&#233;lites&#44; favoreciendo la inclusi&#243;n de los estudios familiares en la rutina cl&#237;nica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;figura1&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_figura1.jpg"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Figura 1&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;figura2&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_figura2.jpg"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Figura 2&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><a href="grande&#47;116127&#95;tabla1&#46;jpg" class="elsevierStyleCrossRefs"><img src="116127_tabla1.gif"></img></a></p><p class="elsevierStylePara">Tabla 1&#46; </p>"
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ISSN: 02116995
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