Aplicación práctica de métodos estereológicos renales en modelos animales experimentales

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Flecha blanca: escala presente para cálculo de la magnificación. Línea roja: Δx o distancia entre puntos. B) Microfotografía de un campo histológico con objetivo 10× de la corteza renal según corte transversal, con malla superpuesta con 6 disectores. Línea roja: Δx y Δy (iguales por ser un disector cuadrado)." ] ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónEl riñón es un órgano esencial en el mantenimiento de la homeostasis, siendo la nefrona su unidad estructural y funcional. El número, tamaño y distribución de los componentes de la nefrona (glomérulos, túbulos…) aportan información importante acerca de la función renal, haciendo su cuantificación relevante en estudios frente a traumas, químicos y/o enfermedades. En estos casos, así como en situaciones de normalidad, los estudios estereológicos nos permiten detectar y cuantificar modificaciones macro o microscópicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045">1</a>.La estereología es una rama de la morfometría que permite, aplicando fórmulas matemáticas basadas en la probabilidad geométrica estadísticamente significativa, obtener información tridimensional de células o estructuras biológicas a partir de cortes microscópicos bidimensionales, seriados, paralelos y equidistantes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050">2</a>.Dada la dificultad de los estudios estereológicos y la carencia de una bibliografía clara sobre el desarrollo de los mismos, el objetivo de este trabajo es explicar paso a paso, de forma sencilla y con ejemplos, utilizando un modelo animal, cómo calcular los principales parámetros estereológicos del riñón, y de esa forma sentar unas bases de fácil comprensión que puedan ser aplicadas en futuros estudios experimentales, contribuyendo así a la resolución de muchos problemas de patología, fisiología y bioquímica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0050">2,3</a>.Material y métodosPreparación de la muestraLos riñones de ratón son extraídos y fijados durante 24h en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente. Posteriormente se lavan con agua, se someten a sucesivos baños de alcohol etílico de concentraciones crecientes, se aclaran con xilol y se incluyen totalmente en parafina (cada riñón en un molde independiente). Una vez hechos los bloques, se conservan en archivadores a temperatura ambiente.Elaboración de los cortes histológicosConviene empezar con un estudio piloto que incluya uno o 2 animales, para ir corrigiendo errores y ajustando los pasos (por ejemplo, cuántos campos utilizamos para medir glomérulos, cuántos disectores por campo histológico, etc.)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060">4</a>.Colocamos un bloque con un riñón en el microtomo y lo seccionamos en su totalidad en secciones de 5 micras de espesor. Para el cálculo del volumen y la densidad numérica no influye la orientación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045">1</a> (en nuestro laboratorio realizamos cortes transversales). Otro de los problemas que se puede plantear al abordar este objetivo es si es necesario, o no, que la corteza renal sea isótropa para aplicar el método, y si el tamaño de las partículas puede inducir a error.Como se ha explicado previamente en artículos clásicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065">5</a>, ese problema puede ser resuelto con el adecuado muestreo, que dé a cada partícula, en este caso glomérulos, la misma probabilidad de ser contada.Seleccionaremos para el estudio estereológico las secciones o cortes n.o 100 y 106, 200 y 206,… y así sucesivamente hasta el final.Solo escogeremos aquellos cortes que al extenderlos sobre el porta no estén rotos ni plegados. Si esto sucede en el corte que nos corresponda seleccionar, avanzaremos 5 micras o lo necesario hasta obtener un corte óptimo, siempre que luego se mantenga la distancia de 25 micras con su correspondiente sección pareada, y continuemos con el sistema establecido inicialmente.Las secciones 100, 200… sirven para calcular el volumen total del riñón o volumen de referencia según Cavalieri, y las llamaremos «secciones volumen». Se obtienen de una forma sistemática (los cortes tienen siempre la misma distancia entre ellos o T), uniforme (son cortes paralelos entre sí) y al azar (el primer corte se escoge de forma arbitraria entre los cortes 0 y T, siendo T igual a 100 cortes en este caso). Es importante obtener un número mínimo de cortes (mayor o igual a 6) para poder obtener dicho volumen con un coeficiente de error aceptable<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045">1,3,4</a>.Las secciones 106, 206,… son secciones pareadas que utilizaremos para estimar la densidad numérica (n.o de glomérulos/mm3) según el método del disector físico. El motivo por el que estén separadas 6 cortes de su sección par («sección volumen») se debe a que la distancia óptima entre dichas secciones debe ser aproximadamente 1/3 del diámetro medio de la estructura a medir (en este caso, el glomérulo)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070">6</a>. En el caso de los glomérulos de riñón del ratón adulto correspondería a unas 25 micras aproximadamente<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075">7,8</a> (a 5 cortes de 5 micras de espesor). Las 2 secciones pareadas se colocan en el mismo porta.Análisis estereológicoPara calcular el volumen total realizaremos microfotografías de las «secciones volumen» donde pueda verse la totalidad del riñón (objetivos 1× y 1,25×). Cada fotografía debe incorporar su escala correspondiente. Sobre ellas superpondremos una malla de puntos de la que calcularemos la distancia entre cada punto o marca y lo llamaremos Δx, midiendo con un calibre su distancia en mm (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A). Una vez tenemos la malla sobre el riñón, contamos el n.o de puntos o marcas que «caen» encima de la imagen renal (lo llamaremos ∑P).<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>Como la microfotografía puede ser mayor o menor según el tamaño del monitor donde se proyecte, utilizamos la escala de la fotografía para evitar que ello afecte al estudio, y la medimos sobre el monitor con un calibre. Con este valor podemos calcular la magnificación o M:<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia>Ahora, ya podemos aplicar la siguiente fórmula:<elsevierMultimedia ident="eq0010"></elsevierMultimedia>T=distancia entre «secciones volumen».a/p (área asociada a cada punto) =, Δx2 es la distancia entre dos puntos de la malla y M es la magnificación.∑P=sumatorio de puntos que caen dentro de la estructura a medir (riñón), superponiendo una malla de puntos sobre la misma, en cada una de las fotografías resultantes (por ejemplo, si tenemos 6 «secciones volumen», entonces ∑P=∑P1 +…+∑P6).Para el cálculo de la densidad numérica según el método del disector físico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045">1,6,7</a> aplicamos una malla con los disectores sobre las microfotografías de los cortes 100, 200 … («secciones de referencia») y luego las comparamos con sus pareadas 106, 206…. (secciones «look up»). Para ello, hacemos 2 microfotografías (objetivo 10×) de cada sección pareada (siempre con la escala) que nos permitirán ver simultáneamente las 2 secciones. Una vez hemos localizado la misma zona histológica en ambos cortes pareados, superponemos la plantilla con los 6 disectores (podrían ser más o menos) en la imagen de referencia (100, 200…) y contamos cuántos glomérulos (∑Q¿) de la imagen de referencia (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A) caen dentro del marco de recuento (counting frame) sin tocar las líneas prohibidas (líneas rectas) y no aparecen en la imagen «look up» (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>B).Esto se debe realizar sobre 10 campos corticales aleatorios de cada «sección volumen» obtenida (buscando referencias histológicas para asegurar la misma localización en las 2 secciones pareadas).Para que el estudio esté bien hecho, tenemos que contar entre 100-200 glomérulos o ∑Q¿, ya que así, al aplicar la fórmula para el cálculo del coeficiente de error o estimación en el error de la varianza, este tendría un valor aproximado de 0,1.<elsevierMultimedia ident="eq0015"></elsevierMultimedia>Por último, contamos el número de disectores (∑P) utilizados en el recuento de glomérulos para calcular sobre qué volumen de riñón se están contando los glomérulos. En el caso ejemplo serían: 60 disectores por cada «sección volumen» (6 disectores superpuestos sobre 10 campos histológicos) × n.o total de «secciones volumen» que hayamos obtenido.Finalmente aplicamos la siguiente fórmula para obtener la densidad numérica:<elsevierMultimedia ident="eq0020"></elsevierMultimedia>a/f (área del marco de recuento o disector) = ΔX x ΔyM2.h: distancia entre secciones pareadas del disector (en este caso, 25 micras).∑Q¿: sumatorio de partículas o glomérulos contados según el disector, en todas las «secciones volumen».∑P: sumatorio de disectores utilizados para medir los glomérulos, en todas las «secciones volumen».Una vez tenemos la densidad numérica (Nv), podemos realizar una estimación del n.o total de glomérulos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0055">3,4</a>:N.o total de partículas=volumen total×densidad numérica (Nv).ResultadosComenzamos seccionando el riñón de un ratón 0F1 adulto (Charles River, Barcelona, España) en secciones de 5 micras de espesor, con una T de 500 micras (lo que equivale a 100 cortes de separación entre «secciones volumen»).Cálculo del volumen total según CavalieriDebido al tamaño del riñón, obtenemos 10 «secciones volumen» y las fotografiamos con un objetivo 1,25× en el microscopio, incorporando la escala (que para este objetivo corresponde a una escala de 500μm, y medida sobre la foto son 15,5mm).Aplicamos la malla de puntos y hacemos el siguiente recuento (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>).<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Con esos datos podemos calcular:<elsevierMultimedia ident="eq0025"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0030"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0035"></elsevierMultimedia>T=500 micras o 0,5mm.<elsevierMultimedia ident="eq0040"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0045"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0050"></elsevierMultimedia>Cálculo de la densidad numérica con el disector físicoHacemos 2 microfotografías (objetivo 10×) de cada sección pareada (escala de 200 micras que mide 41mm). Localizamos la misma zona histológica en ambos cortes pareados, superponemos la plantilla con los 6 disectores en la «imagen o sección de referencia» (100, 200…) y contamos cuántos glomérulos (∑Q¿) caen dentro del marco de recuento (counting frame) sin tocar las líneas prohibidas (líneas rectas) y no aparecen en la imagen «look up» (sección pareada). Repetimos esta acción sobre 10 campos de cada «sección volumen o de referencia».Contamos el n.o de disectores empleados y aplicamos la fórmula:<elsevierMultimedia ident="eq0055"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0060"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0065"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0070"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0075"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0080"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0085"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0090"></elsevierMultimedia>Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses." "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:10 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "xres805686" "titulo" => "Resumen" "secciones" => array:1 [ 0 => array:1 [ "identificador" => "abst0005" ] ] ] 1 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec803812" "titulo" => "Palabras clave" ] 2 => array:3 [ "identificador" => "xres805687" "titulo" => "Abstract" "secciones" => array:1 [ 0 => array:1 [ "identificador" => "abst0010" ] ] ] 3 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec803811" "titulo" => "Keywords" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Introducción" ] 5 => array:3 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Material y métodos" "secciones" => array:3 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0015" "titulo" => "Preparación de la muestra" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0020" "titulo" => "Elaboración de los cortes histológicos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0025" "titulo" => "Análisis estereológico" ] ] ] 6 => array:3 [ "identificador" => "sec0030" "titulo" => "Resultados" "secciones" => array:2 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0035" "titulo" => "Cálculo del volumen total según Cavalieri" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0040" "titulo" => "Cálculo de la densidad numérica con el disector físico" ] ] ] 7 => array:2 [ "identificador" => "sec0045" "titulo" => "Conflicto de intereses" ] 8 => array:2 [ "identificador" => "xack269812" "titulo" => "Agradecimientos" ] 9 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "fechaRecibido" => "2015-10-15" "fechaAceptado" => "2016-04-19" "PalabrasClave" => array:2 [ "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec803812" "palabras" => array:3 [ 0 => "Estereología renal" 1 => "Densidad glomerular" 2 => "Glomérulos" ] ] ] "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec803811" "palabras" => array:3 [ 0 => "Renal stereology" 1 => "Glomerular density" 2 => "Glomeruli" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "resumen" => array:2 [ "es" => array:2 [ "titulo" => "Resumen" "resumen" => "Los riñones son órganos vitales que realizan funciones de excreción, equilibrio hidroelectrolítico y producción de hormonas. La nefrona es su unidad estructural y funcional. El número, tamaño y distribución de los componentes de la nefrona contienen información relevante sobre la función renal. La estereología es una rama de la morfometría que permite, aplicando reglas matemáticas, obtener información tridimensional de estructuras biológicas a partir de cortes microscópicos bidimensionales, seriados, paralelos y equidistantes. Ante la complejidad de los estudios estereológicos y la carencia de una bibliografía clara sobre el desarrollo de los mismos, el objetivo de este trabajo es explicar de forma sencilla y con ejemplos, utilizando un modelo animal, los conceptos básicos de estereología, así como el cálculo de los principales parámetros estereológicos renales y que estos puedan ser aplicados en futuros estudios experimentales." ] "en" => array:2 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "The kidneys are vital organs responsible for excretion, fluid and electrolyte balance and hormone production. The nephrons are the kidney's functional and structural units. The number, size and distribution of the nephron components contain relevant information on renal function. Stereology is a branch of morphometry that applies mathematical principles to obtain three-dimensional information from serial, parallel and equidistant two-dimensional microscopic sections. Because of the complexity of stereological studies and the lack of scientific literature on the subject, the aim of this paper is to clearly explain, through animal models, the basic concepts of stereology and how to calculate the main kidney stereological parameters that can be applied in future experimental studies." ] ] "multimedia" => array:20 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 558 "Ancho" => 1501 "Tamanyo" => 230044 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "A) Microfotografía con objetivo 1,25× de corte transversal de riñón de ratón (hematoxilina-eosina), con malla de puntos superpuesta para recuento de puntos y cálculo del volumen según Cavalieri. Flecha blanca: escala presente para cálculo de la magnificación. Línea roja: Δx o distancia entre puntos. B) Microfotografía de un campo histológico con objetivo 10× de la corteza renal según corte transversal, con malla superpuesta con 6 disectores. 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entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Total (∑P) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">935 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">589 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Total \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">175 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">294 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Cortical + Medular \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " colspan="2" align="left" valign="top">1.524</td><td class="td" title="table-entry " align="" valign="top"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="" valign="top"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="" valign="top"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></tbody></table> """ ] "imagenFichero" => array:1 [ 0 => "xTab1352119.png" ] ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Valores de los puntos sobre la corteza y la médula renal para el cálculo del volumen total del ejemplo. 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Notas técnicas

Aplicación práctica de métodos estereológicos renales en modelos animales experimentales

Practical application of stereological methods in experimental kidney animal models

María Teresa Fernández Garcíaa,

Autor para correspondencia

fernandezgarteresa@uniovi.es

Autor para correspondencia.

, Paula Núñez Martínezb, Vanessa García de la Fuentea, Marta Sánchez Pitiota, María del Carmen Muñiz Salgueiroa, Carmen Perillán Méndezb, Juan Argüelles Luisb, Aurora Astudillo Gonzáleza,c

a Unidad de Histopatología Molecular en Modelos Animales de Cáncer, Instituto Universitario Oncológico del Principado de Asturias, Oviedo, Asturias, España

b Área de Fisiología, Departamento de Biología Funcional, Universidad de Oviedo, Oviedo, Asturias, España

c Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, Asturias, España

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aplicando f&#243;rmulas matem&#225;ticas basadas en la probabilidad geom&#233;trica estad&#237;sticamente significativa&#44; obtener informaci&#243;n tridimensional de c&#233;lulas o estructuras biol&#243;gicas a partir de cortes microsc&#243;picos bidimensionales&#44; seriados&#44; paralelos y equidistantes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Dada la dificultad de los estudios estereol&#243;gicos y la carencia de una bibliograf&#237;a clara sobre el desarrollo de los mismos&#44; el objetivo de este trabajo es explicar paso a paso&#44; de forma sencilla y con ejemplos&#44; utilizando un modelo animal&#44; c&#243;mo calcular los principales par&#225;metros estereol&#243;gicos del ri&#241;&#243;n&#44; y de esa forma sentar unas bases de f&#225;cil comprensi&#243;n que puedan ser aplicadas en futuros estudios experimentales&#44; contribuyendo as&#237; a la resoluci&#243;n de muchos problemas de patolog&#237;a&#44; fisiolog&#237;a y bioqu&#237;mica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">2&#44;3</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Material y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Preparaci&#243;n de la muestra</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los ri&#241;ones de rat&#243;n son extra&#237;dos y fijados durante 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en paraformaldeh&#237;do al 4&#37; a temperatura ambiente&#46; Posteriormente se lavan con agua&#44; se someten a sucesivos ba&#241;os de alcohol et&#237;lico de concentraciones crecientes&#44; se aclaran con xilol y se incluyen totalmente en parafina &#40;cada ri&#241;&#243;n en un molde independiente&#41;&#46; Una vez hechos los bloques&#44; se conservan en archivadores a temperatura ambiente&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Elaboraci&#243;n de los cortes histol&#243;gicos</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Conviene empezar con un estudio piloto que incluya uno o 2 animales&#44; para ir corrigiendo errores y ajustando los pasos &#40;por ejemplo&#44; cu&#225;ntos campos utilizamos para medir glom&#233;rulos&#44; cu&#225;ntos disectores por campo histol&#243;gico&#44; etc&#46;&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Colocamos un bloque con un ri&#241;&#243;n en el microtomo y lo seccionamos en su totalidad en secciones de 5 micras de espesor&#46; Para el c&#225;lculo del volumen y la densidad num&#233;rica no influye la orientaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">1</span></a> &#40;en nuestro laboratorio realizamos cortes transversales&#41;&#46; Otro de los problemas que se puede plantear al abordar este objetivo es si es necesario&#44; o no&#44; que la corteza renal sea is&#243;tropa para aplicar el m&#233;todo&#44; y si el tama&#241;o de las part&#237;culas puede inducir a error&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como se ha explicado previamente en art&#237;culos cl&#225;sicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#44; ese problema puede ser resuelto con el adecuado muestreo&#44; que d&#233; a cada part&#237;cula&#44; en este caso glom&#233;rulos&#44; la misma probabilidad de ser contada&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Seleccionaremos para el estudio estereol&#243;gico las secciones o cortes n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> 100 y 106&#44; 200 y 206&#44;&#8230; y as&#237; sucesivamente hasta el final&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Solo escogeremos aquellos cortes que al extenderlos sobre el porta no est&#233;n rotos ni plegados&#46; Si esto sucede en el corte que nos corresponda seleccionar&#44; avanzaremos 5 micras o lo necesario hasta obtener un corte &#243;ptimo&#44; siempre que luego se mantenga la distancia de 25 micras con su correspondiente secci&#243;n pareada&#44; y continuemos con el sistema establecido inicialmente&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las secciones 100&#44; 200&#8230; sirven para calcular el volumen total del ri&#241;&#243;n o volumen de referencia seg&#250;n Cavalieri&#44; y las llamaremos &#171;secciones volumen&#187;&#46; Se obtienen de una forma sistem&#225;tica &#40;los cortes tienen siempre la misma distancia entre ellos o T&#41;&#44; uniforme &#40;son cortes paralelos entre s&#237;&#41; y al azar &#40;el primer corte se escoge de forma arbitraria entre los cortes 0 y T&#44; siendo T igual a 100 cortes en este caso&#41;&#46; Es importante obtener un n&#250;mero m&#237;nimo de cortes &#40;mayor o igual a 6&#41; para poder obtener dicho volumen con un coeficiente de error aceptable<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;3&#44;4</span></a>&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las secciones 106&#44; 206&#44;&#8230; son secciones pareadas que utilizaremos para estimar la densidad num&#233;rica &#40;n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> de glom&#233;rulos&#47;mm<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#41; seg&#250;n el m&#233;todo del disector f&#237;sico&#46; El motivo por el que est&#233;n separadas 6 cortes de su secci&#243;n par &#40;&#171;secci&#243;n volumen&#187;&#41; se debe a que la distancia &#243;ptima entre dichas secciones debe ser aproximadamente 1&#47;3 del di&#225;metro medio de la estructura a medir &#40;en este caso&#44; el glom&#233;rulo&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>&#46; En el caso de los glom&#233;rulos de ri&#241;&#243;n del rat&#243;n adulto corresponder&#237;a a unas 25 micras aproximadamente<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">7&#44;8</span></a> &#40;a 5 cortes de 5 micras de espesor&#41;&#46; Las 2 secciones pareadas se colocan en el mismo porta&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">An&#225;lisis estereol&#243;gico</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para calcular el volumen total realizaremos microfotograf&#237;as de las &#171;secciones volumen&#187; donde pueda verse la totalidad del ri&#241;&#243;n &#40;objetivos 1&#215; y 1&#44;25&#215;&#41;&#46; Cada fotograf&#237;a debe incorporar su escala correspondiente&#46; Sobre ellas superpondremos una malla de puntos de la que calcularemos la distancia entre cada punto o marca y lo llamaremos &#916;x&#44; midiendo con un calibre su distancia en mm &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>A&#41;&#46; Una vez tenemos la malla sobre el ri&#241;&#243;n&#44; contamos el n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> de puntos o marcas que &#171;caen&#187; encima de la imagen renal &#40;lo llamaremos &#8721;P&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como la microfotograf&#237;a puede ser mayor o menor seg&#250;n el tama&#241;o del monitor donde se proyecte&#44; utilizamos la escala de la fotograf&#237;a para evitar que ello afecte al estudio&#44; y la medimos sobre el monitor con un calibre&#46; Con este valor podemos calcular la magnificaci&#243;n o M&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia></p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ahora&#44; ya podemos aplicar la siguiente f&#243;rmula&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0010"></elsevierMultimedia></p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">T<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>distancia entre &#171;secciones volumen&#187;&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">a&#47;p &#40;&#225;rea asociada a cada punto&#41; &#61;&#44; &#916;x<span class="elsevierStyleSup">2</span> es la distancia entre dos puntos de la malla y M es la magnificaci&#243;n&#46;</p><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleBold">&#8721;</span>P<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>sumatorio de puntos que caen dentro de la estructura a medir &#40;ri&#241;&#243;n&#41;&#44; superponiendo una malla de puntos sobre la misma&#44; en cada una de las fotograf&#237;as resultantes &#40;por ejemplo&#44; si tenemos 6 &#171;secciones volumen&#187;&#44; entonces &#8721;P<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8721;P1 &#43;&#8230;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8721;P6&#41;&#46;</p><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para el c&#225;lculo de la densidad num&#233;rica seg&#250;n el m&#233;todo del disector f&#237;sico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;6&#44;7</span></a> aplicamos una malla con los disectores sobre las microfotograf&#237;as de los cortes 100&#44; 200 &#8230; &#40;&#171;secciones de referencia&#187;&#41; y luego las comparamos con sus pareadas 106&#44; 206&#8230;&#46; &#40;secciones <span class="elsevierStyleItalic">&#171;look up&#187;</span>&#41;&#46; Para ello&#44; hacemos 2 microfotograf&#237;as &#40;objetivo 10&#215;&#41; de cada secci&#243;n pareada &#40;siempre con la escala&#41; que nos permitir&#225;n ver simult&#225;neamente las 2 secciones&#46; Una vez hemos localizado la misma zona histol&#243;gica en ambos cortes pareados&#44; superponemos la plantilla con los 6 disectores &#40;podr&#237;an ser m&#225;s o menos&#41; en la imagen de referencia &#40;100&#44; 200&#8230;&#41; y contamos cu&#225;ntos glom&#233;rulos &#40;&#8721;Q¿&#41; de la imagen de referencia &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>A&#41; caen dentro del marco de recuento <span class="elsevierStyleItalic">&#40;counting frame&#41;</span> sin tocar las l&#237;neas prohibidas &#40;l&#237;neas rectas&#41; y no aparecen en la imagen <span class="elsevierStyleItalic">&#171;look up&#187;</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>B&#41;&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Esto se debe realizar sobre 10 campos corticales aleatorios de cada &#171;secci&#243;n volumen&#187; obtenida &#40;buscando referencias histol&#243;gicas para asegurar la misma localizaci&#243;n en las 2 secciones pareadas&#41;&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para que el estudio est&#233; bien hecho&#44; tenemos que contar entre 100-200 glom&#233;rulos o &#8721;Q¿&#44; ya que as&#237;&#44; al aplicar la f&#243;rmula para el c&#225;lculo del coeficiente de error o estimaci&#243;n en el error de la varianza&#44; este tendr&#237;a un valor aproximado de 0&#44;1&#46;<elsevierMultimedia ident="eq0015"></elsevierMultimedia></p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por &#250;ltimo&#44; contamos el n&#250;mero de disectores &#40;&#8721;P&#41; utilizados en el recuento de glom&#233;rulos para calcular sobre qu&#233; volumen de ri&#241;&#243;n se est&#225;n contando los glom&#233;rulos&#46; En el caso ejemplo ser&#237;an&#58; 60 disectores por cada &#171;secci&#243;n volumen&#187; &#40;6 disectores superpuestos sobre 10 campos histol&#243;gicos&#41; &#215; n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> total de &#171;secciones volumen&#187; que hayamos obtenido&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalmente aplicamos la siguiente f&#243;rmula para obtener la densidad num&#233;rica&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0020"></elsevierMultimedia></p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">a&#47;f &#40;&#225;rea del marco de recuento o disector&#41; &#61; &#916;X&#8201;x&#8201;&#916;yM2&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">h&#58; distancia entre secciones pareadas del disector &#40;en este caso&#44; 25 micras&#41;&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleBold">&#8721;</span>Q<span class="elsevierStyleBold">¿</span>&#58; sumatorio de part&#237;culas o glom&#233;rulos contados seg&#250;n el disector&#44; en todas las &#171;secciones volumen&#187;&#46;</p><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleBold">&#8721;</span>P&#58; sumatorio de disectores utilizados para medir los glom&#233;rulos&#44; en todas las &#171;secciones volumen&#187;&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una vez tenemos la densidad num&#233;rica &#40;Nv&#41;&#44; podemos realizar una estimaci&#243;n del n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> total de glom&#233;rulos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;4</span></a>&#58;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">N&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> total de part&#237;culas<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>volumen total<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>densidad num&#233;rica &#40;Nv&#41;&#46;</p></span></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Resultados</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Comenzamos seccionando el ri&#241;&#243;n de un rat&#243;n 0F1 adulto &#40;Charles River&#44; Barcelona&#44; Espa&#241;a&#41; en secciones de 5 micras de espesor&#44; con una T de 500 micras &#40;lo que equivale a 100 cortes de separaci&#243;n entre &#171;secciones volumen&#187;&#41;&#46;</p><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">C&#225;lculo del volumen total seg&#250;n Cavalieri</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Debido al tama&#241;o del ri&#241;&#243;n&#44; obtenemos 10 &#171;secciones volumen&#187; y las fotografiamos con un objetivo 1&#44;25&#215; en el microscopio&#44; incorporando la escala &#40;que para este objetivo corresponde a una escala de 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#44; y medida sobre la foto son 15&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#41;&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Aplicamos la malla de puntos y hacemos el siguiente recuento &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Con esos datos podemos calcular&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0025"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0030"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0035"></elsevierMultimedia></p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">T<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>500 micras o 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#46;<elsevierMultimedia ident="eq0040"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0045"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0050"></elsevierMultimedia></p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">C&#225;lculo de la densidad num&#233;rica con el disector f&#237;sico</span><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hacemos 2 microfotograf&#237;as &#40;objetivo 10&#215;&#41; de cada secci&#243;n pareada &#40;escala de 200 micras que mide 41<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#41;&#46; Localizamos la misma zona histol&#243;gica en ambos cortes pareados&#44; superponemos la plantilla con los 6 disectores en la &#171;imagen o secci&#243;n de referencia&#187; &#40;100&#44; 200&#8230;&#41; y contamos cu&#225;ntos glom&#233;rulos &#40;&#8721;Q¿&#41; caen dentro del marco de recuento <span class="elsevierStyleItalic">&#40;counting frame&#41;</span> sin tocar las l&#237;neas prohibidas &#40;l&#237;neas rectas&#41; y no aparecen en la imagen <span class="elsevierStyleItalic">&#171;look up&#187;</span> &#40;secci&#243;n pareada&#41;&#46; Repetimos esta acci&#243;n sobre 10 campos de cada &#171;secci&#243;n volumen o de referencia&#187;&#46;</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Contamos el n&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> de disectores empleados y aplicamos la f&#243;rmula&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0055"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0060"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0065"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0070"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0075"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0080"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0085"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="eq0090"></elsevierMultimedia></p></span></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Conflicto de intereses</span><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="center" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Puntos sobre cortical&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="center" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">N&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> de disectores&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">46&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">24&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">39&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">94&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">86&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">22&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">32&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">105&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">58&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">26&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">40&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">77&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">29&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">40&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">94&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">57&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">65&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Total &#40;&#8721;P&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">935&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">589&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Total&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">175&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">294&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Cortical &#43; Medular&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " colspan="2" align="left" valign="top">1&#46;524</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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Información del artículo

ISSN: 02116995
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.nefro.2016.04.002

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