NEFROLOGÍA. Vol. XXV. Número 2. 2005 ORIGINALES El ácido retinoico todo-trans induce apoptosis en células mesangiales humanas: implicación de la quinasa activada por estrés p38 J. C. Sepúlveda*, V. Moreno Manzano*, M. Alique*, P. Reyes*, M. Calvino**, J. Pérez de Hornedo**, T. Parra** y F. J. Lucio* *Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. **Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Guadalajara. Guadalajara. RESUMEN El ácido retinoico todo-trans (AR-t) se utiliza en clínica en el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda y el cáncer renal. También presenta efecto terapéutico en diversas formas de enfermedad renal experimental. Las células mesangiales son una de las dianas farmacológicas de AR-t mejor estudiadas: presentan receptores de ácido retinoico (RAR) y receptores X de retinoides (RXR) y el AR-t, a concentraciones entre 1 y 10 µM, inhibe su crecimiento. Este efecto se ha relacionado con la acción antiproliferativa del AR-t, aunque no se ha estudiado la participación de mecanismos apoptóticos cuando se utilizan mayores concentraciones de AR-t. El presente trabajo demuestra que AR-t 25 µM induce apoptosis de células mesangiales humanas en cultivo, caracterizada por estudios de microscopía óptica y de fluorescencia (tinciones de Giemsa y naranja de acridina, respectivamente), electroforesis del ADN fragmentado, citometría de flujo (anexina-V/ioduro de propidio) e inmunocitoquímica (TUNEL). Ni HX531 (pan-antagonista RXR), ni AGN193109 (pan-antagonista RAR) redujeron el grado de muerte celular inducido por el AR-t, lo que sugiere un mecanismo independiente de receptores. Resultados previos de nuestro grupo indican que dos de los tres miembros de las quinasas activadas por mitógenos (MAP), ERK (quinasa regulada por estímulos extracelulares) y JNK (quinasa de c-Jun), están implicados en efectos no apoptóticos del AR-t en células mesangiales. Nos centramos, pues, en el potencial pro-apoptótico del tercer miembro, la quinasa activada por estrés p38. Confirmamos su implicación en la apoptosis inducida por el AR-t porque: 1) su inhibidor farmacológico, SB203580, previno dicha apoptosis 2) El AR-t indujo en pocos minutos la fosforilación de p38, manteniéndose fosforilada durante las 8 horas posteriores; y 3) dicha fosforilación se inhibió por preincubación con SB203580. Estos datos sugieren una posible toxicidad renal del AR-t, pero también su utilidad para controlar la proliferación patológica de células mesangiales. Palabras clave: Ácido retinoico todo-trans. Célula mesangial. Quinasa p38. Apoptosis. Receptores de ácido retinoico. Receptores X de retinoides. Recibido: 5-III-2004. En versión definitiva: 5-VIII-2004. Aceptado: 12-IX-2004. Correspondencia: Dr. Francisco Javier de Lucio Cazaña Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina Universidad de Alcalá Alcalá de Henares (Madrid) E-mail: javier.lucio@uah.es 131 J. C. SEPÚLVEDA y cols. ALL-TRANS RETINOIC ACID INDUCES APOPTOSIS IN HUMAN MESANGIAL CELLS: INVOLVEMENT OF STRESS ACTIVATED P38 KINASE SUMMARY All-trans retinoic acid (AR-t) is used for treating acute promyelocytic leukemia and renal cell carcinoma and it also has therapeutic value in several animal models of renal disease. Among its renal targets, mesangial cells have been widely studied: they have both retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors (RXR) and the cell growth is inhibited when human mesangial cells are incubated with 1-10 µM AR-t. Although his effect has been related with the antiproliferative action of AR-t, there are no studies on the involvement of apoptosis in AR-t induced cell growth when higher concentrations of retinoid are used. Our studies show that 25 µM AR-t triggers mesangial cell apoptosis assessed by light and fluorescence microscopy (Giemsa stain and acridine orange stain, respectively), DNA electrophoresis, flow cytometry (annexin-V) and immunocytochemistry (TUNEL). AR-t induced apoptosis was not inhibited by preincubation with the RXR pan-antagonist HX531 nor with the RAR pan-antagonist AGN 193109, this suggesting RAR and RXIR are not involved in AR-t induced cell death. Previous results of our group showed that ERK (extracellular regulated kinase) and JNK (c-Jun kinase), t wo members of the MAP (mitogen activated protein) kinase family, are involved in non apoptotic effects of AR-t on mesangial cells. Therefore we focussed on the stress activated p38 kinase, the third member of the MAPK family, to investigate its involvement in AR-t induced apoptosis. The results confirmed a role of p38 since: 1) preincubation with SB203589, a p38 inhibitor, inhibited ARA induced apoptosis; 2) incubation with AR-t induced p38 phosphorilation after few minutes and p38 remained phosphorilated for at least 8 hours and 3) AR-t induced p38 phosphorilation was inhibited by SB203589. These data suggest that AR-t migth have toxic side effects on the kidney but also suggest that AR-t could be an useful inhibitor of pathological mesangial cell expansion. Key words: All-trans retinoic acid. Mesangial cell. P38 kinase. Apoptosis. Retinoic acid receptor. Retinoid X receptor. INTRODUCCIÓN El ácido retinoico todo-trans (AR-t) ha demostrado su utilidad en el tratamiento de diversas formas de enfermedad renal experimental 1-3. Las células mesangiales glomerulares son una de las dianas farmacológicas del AR-t mejor estudiadas: estas células presentan receptores de ácido retinoico (RAR) , y y receptores X de retinoides (RXR) , y y el tratamiento con AR-t ejerce sobre dichas células el bien conocido efecto supresor del crecimiento celular de este derivado de la vitamina A 4. Además el AR-t protege a las células mesangiales de la apoptosis inducida por peróxido de hidrógeno (H2O2), inhibe la expresión mesangial de moléculas implicadas en la adhesión de monocitos así como la propia adhesión de estos leucocitos a cultivos de células mesangiales 4 y ha demostrado su 132 eficacia en la prevención y tratamiento de la nefritis inducida por anti-Thy1.1 3, una nefritis donde la lesión y proliferación mesangial son particularmente importantes. Conocer más sobre los mecanismos implicados en el control por AR-t del número de células mesangiales es importante por dos razones: 1) Porque la proliferación y la apoptosis mesangial están implicadas en los fenómenos de lesión y reparación glomerular, de manera que la modulación de estos fenómenos tiene un evidente interés terapéutico 5. 2) Porque el AR-t ya se usa en clínica como tratamiento de la leucemia promielocítica aguda 6 y podría afectar directamente a la función renal al reducir el número de células glomerulares. Efectivamente, muchos retinoides ejercen un efecto negativo sobre el crecimiento celular ya que inhiben la proliferación y/o inducen apoptosis 7. EL ÁCIDO RETINOICO INDUCE APOPTOSIS MESANGIAL En el caso de las células mesangiales sabemos que el efecto antiproliferativo interviene en la inhibición del crecimiento celular4 cuando se emplean concentraciones de AR-t no superiores a 10 µM. Sin embargo, no se conoce si podrían participar mecanismos de tipo apoptótico a mayores concentraciones. En el presente trabajo analizamos la acción de AR-t a altas concentraciones sobre las células mensagiales, confirmando que induce apoptosis. A continuación, evaluamos el papel de los receptores RAR y RXR en este fenómeno. Por otro lado, estudios anteriores nuestros indican que dos de los tres miembros de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK), ERK (quinasa regulada por estímulos extracelulares) y JNK (quinasa de c-Jun) son activados por concentraciones de AR-t que no inducen muerte en células mesangiales 8, 9 y, de hecho, la inducción de JNK está implicada en efectos antiapoptóticos del AR-t en dichas células 9. En este sentido, resultaba de interés establecer la implicación del tercer tipo de MAPK, la p38 quinasa, que se activa por estrés celular y puede tener un claro papel en la inducción de apoptosis por diversas sustancias químicas, entre las que se encuentran moléculas de síntesis relacionadas con los retinoides 10, 11. MATERIAL Y MÉTODOS Diseño experimental Se utilizaron células confluentes (pases 4 a 8) y quiescentes mediante incubación durante 48 horas con medio suplementado con un 0,5% de suero de ternera fetal. A continuación se incubaron con AR-t 25-100 µM (10 µM es una concentración inocua y, de hecho, protege a las células mesangiales frente al peróxido de hidrógeno 9) en experimentos preliminares que indicaron que bastan 16 horas de incubación con AR-t 25 µM para producir muerte mesangial identificada por la incorporación de azul tripán al interior celular, lo que revela la pérdida de permeabilidad selectiva de la membrana celular. A continuación realizamos los siguientes estudios: (1) Identificación de apoptosis por la presencia de núcleos picnóticos, intensa concentración de la cromatina y fragmentación nuclear en estructuras esféricas en células teñidas con Giemsa o con naranja de acridina, por la confirmación de que los fragmentos nucleares se teñían mediante TUNEL (marcado in situ de los extremos 3-OH del ADN), por la demostración por electroforesis de fragmentos de ADN con un tamaño internucleosomal y por la detección por citometría de flujo de la translocación de fosfatidilserina desde la cara interna a la cara ex- terna de la membrana plasmática (anexina V). (2) Papel de los receptores de retinoides y de la vía de la p38 en la apoptosis inducida por el AR-t. En estos experimentos, antes de añadir AR-t preincubamos con el pan-antagonista RXR (HX531) y el pan-antagonista RAR (AGN193109) 8 con objeto de identificar una posible intervención de los receptores de retinoides en la apoptosis. Del mismo modo, para evaluar la implicación de la quinasa activada por estrés p38, preincubamos con su inhibidor SB 203580 antes de añadir AR-t. Dado que en este último caso, se previno la apoptosis, pasamos a confirmar que AR-t promovía la activación de p38 mediante el correspondiente ensayo de kinasas. Reactivos Rochefarma S.A. (España) suministró AR-t gratuitamente A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos utilizados procedían de Sigma Chemical Co. El material, medios y sueros para cultivo celular se obtuvieron de Gibco. Cultivo de células mesangiales glomerulares humanas Estas células se obtuvieron a partir de porciones corticales de riñones de adulto, como hemos descrito previamente 4, estableciéndose la identidad celular morfológicos, inmunohistoquímicos y funcionales 4. El medio de cultivo utilizado fue RPMI 1640 enriquecido con 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina (200 mM), penicilina G sódica (100 µg/ml) y sulfato de estreptomicina (100 µg/ml), tamponado con HEPES (ácido N-2 hidroxi-etil-piperazina-N-2-etanosulfónico) 20 mM y bicarbonato sódico (NaHCO3) 24 mM. Ensayos de apoptosis y viabilidad celular (1) Microscopía Las células para microscopía óptica se fijaron con formaldehído al 4% en salino tamponado con fosfatos y se tiñeron durante una hora con Giemsa; para microscopía de fluorescencia las células se tiñeron durante 10 minutos con naranja de acridina (4 µg/ml). (2) Detección in situ de la apoptosis. Tras fijar las células durante 20 minutos en formaldehído al 4% en salino tamponado con fosfatos, se realizó el ensayo de TUNEL utilizando el kit de detección in situ cell death kit (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. (3) Análisis de la exclusión de azul tripán. Las 133 J. C. SEPÚLVEDA y cols. A) 100 Viabilidad celular (%) 50 Pasado dicho tiempo se lavó con tampón y se procedió al análisis por citometría de flujo. (5) Electroforesis de ADN. Las células se lisaron en tampón de lisis (EDTA 10 mM, Tritón X-100 0,5% en Tris-HCI 10 mM, pH 7,4). Tras centrifugar, el sobrenadante se incubó con proteinasa K (300 µg/ml) durante 1 hora y el ADN se precipitó con isopropanol, procediendo a una nueva centrifugación. El precipitado se disolvió en 10 µl de Tris-EDTA (pH 7,6) que contenía RNAasa (300 µg/ml). La presencia de fragmentación internucleosómica del ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Ensayo de la quinasa activada por estrés p38 Las células se lisaron con tampón de muestra (SDS 2%, glicerol 5%, azul de bromofenol 0,003% y mercaptoetanol 1% en Tris-HCI 125 mM, pH 6,8), se hirvieron durante 5 minutos y se pasaron varias veces a través de agujas 23-G. Tras centrifugar, los sobrenadantes se cargaron en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los análisis de la forma fosforilada (activa) de p38 y de p38 total (fosforilada y no fosforilada) se realizaron usando el kit PhosphoPlus p38 MAP Kinase antibody (New England Biolabs, UK) siguiendo las instrucciones del fabricante. Análisis estadístico Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar de la media. Los datos se compararon usando el test no paramétrico U de MannWhitney. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los experimentos se realizaron al menos 4 veces por triplicado. 0 AR-t ­ + B) CONTROL AR-t Fig. 1.--Inducción de apoptosis por AR-t. A) El histograma muestra la incorporación de azul tripán tras incubación con AR-t 25 µM/48 h (*p < 0,01 vs control). B) Las fotografías muestran morfología apoptótica tanto con tinción de Giemsa (panel superior) como con naranja de acridina (panel inferior). RESULTADOS Como resultado del estudio morfológico de las células mesangiales a la exposición de AR-t 25 µM, un número muy significativo de ellas presentó la morfología típica de apoptosis (ver diseño experimental) (fig. 1 B). En la figura 1 A, se presenta la cuantificación de células muertas tras 48 h de incubación con AR-t. La técnica del TUNEL (fig. 2 A) confirmó que las alteraciones de la morfología nuclear iban asociadas a la fragmentación de] ADN (fig 2 B). Finalmente, los resultados de la citometría de flujo demostraron que el AR-t producía un aumento del marcado celular con anexina V (fig. 2 C). Con objeto de averiguar el mecanismo de actuación del AR-t usamos antagonistas para cada tipo de re- células se tripsinizaron y tiñeron con azul tripán, realizando el recuento en cámara de Neubauer de las células viables y no viables (4) Tinción anexina V/ioduro de propidio. Las células tripsinizadas se incubaron en un tampón compuesto por HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, KCI 5 mM, MgCI2 1 mM, CaCI2 1,8 mM pH 7,4 que contiene anexina-V conjugada con 0,5 µL de anexina-V conjugada con FITC (fluoresceína) y con 5 µL de ioduro de propidio, durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. 134 EL ÁCIDO RETINOICO INDUCE APOPTOSIS MESANGIAL A) CONTROL AR-t C) CONTROL Ioduro de propidio Anexina-FITC B) C AR-t M AR-t Ioduro de propidio (unidades relativas de fluorescencia) Anexina-FITC Fig. 2.--Inducción de apoptosis por AR-t (tratamiento con AR-t 25 µM/24 h). A) Tinción de TUNEL. B) Electroforesis de ADN C, control, AR-t, ácido retinoico todo-trans; M, patrón de ADN de diversos pesos moleculares. C) Citometría de flujo: diagrama de puntos de la unión de anexina-V marcada con fluoresceína (FITC) y captación de ioduro de propidio. ceptor de retinoides: el pan-antagonista RXR (HX531) y el pan-antagonista RAR (AGN193109) 8. Nuestros resultados (fig. 3) indican que ninguno de los antagonistas redujo significativamente el grado de muerte celular inducido por el AR-t, lo que sugiere que ésta sucede siguiendo un mecanismo independiente de receptores RAR y RXR. Hay que tener en cuenta que los antagonistas per se tuvieron alguna toxicidad, lo que podría ocultar un posible efecto protector frente a la apoptosis por retinoides. Los resultados se obtuvieron en experimentos realizados tras 48 horas de incubación; en incubaciones de sólo 12 horas con AR-t, de apoptosis, ninguna toxicidad en los grupos con antagonistas y tampoco se encontró inhibición alguna de las cifras de apoptosis inducida por AR-t (resultados no mostrados). Observamos la implicación de p38 en la apoptosis inducida por el AR-t porque 1) su inhibidor farmacológico, SB203580, previno dicha apoptosis (figs. 4 A 100 Células muertas (%) 50 0 AR-t AGN193109 HX531 ­ ­ ­ + ­ ­ ­ + ­ + + ­ ­ ­ + + ­ + Fig. 3.--Los pan-antagonistas de receptores RAR (AGN193109) y RXR (HX531) no inhiben la muerte celular inducida por AR-t. La cuantificación de células viables (exclusión de azul tripán) se realizó tras preincubar 30 min con los antagonistas (1 µM) e incubar con AR-t (25 µM/48 h; *p < 0,01 vs control). 135 J. C. SEPÚLVEDA y cols. A) SB SB + AR-t Anexina-FITC Ioduro de propidio (unidades relativas de fluorescencia) Ioduro de propidio Anexina-FITC B) 100 C) Células muertas (%) 0 AR-t 25 µM 50 0,1 0,3 1 4 8 (h) Fosfo-p38 p38 total Fosfo-p38 p38 total AR-t 25 µM + SB 203580 0 Control SB AR-t SB + AR-t Fig. 4.--La quinasa p38 interviene en la apoptosis inducida por AR-t. A) Citometría de flujo: Tras preincubar con un inhibidor de p38 (SB 203580 25 µM/1 h), las células se incubaron AR-t 25 µM/24 h (SB + AR-t) o con vehículo de AR-t (SB). PE: anexina-V marcada con fluoresceína (FITC). B) Cuantificación de células viables (exclusión de azul tripán). Las células se preincubaron con SB 203580 25 µM/1 h (SB y SB + AR-t) y se incubaron 48 h con AR-t 25 µM (AR-t y SB + AR-t) o con su vehículo (Control y SB); *p < 0,01 vs control, SB y SB + ARt; **p < 0,01 vs control, SB, y AR-t. C) Activación de p38. Células pre-incubadas como antes con SB 203580 se incubaron con AR-t 25 µM (0-8 h). Fosfo-p38: p38 fosforilada (activa); p38 total: p38 fosforilada y no fosforilada. y B), 2) El AR-t indujo en pocos minutos la fosforilación de p38, manteniéndose fosforilada durante las 8 horas posteriores (fig. 4 C) y 3) dicha fosforilación se inhibió por preincubación con SB203580 (fig. 4 C). DISCUSIÓN El AR-t es el metabolito activo más importante de la vitamina A ya que, con excepción de algunos aspectos de la visión y de la reproducción, reproduce 136 la práctica totalidad de los efectos biológicos de la vitamina A 12. Sin embargo, la apoptosis que induce sobre células mesangiales (figs. 1 y 2) aparece a una concentración muy superior a sus niveles plasmáticos fisiológicos, que se encuentran en el rango nanomolar 13. Por ello, no resulta sorprendente que los antagonistas de sus receptores RAR, que se saturan en el rango nanomolar 7, no bloqueen la apoptosis inducida por el AR-t (fig. 3). Los receptores RXR no se activan por el AR-t, sino por su isómero: el ácido 9-cis-retinoico7. Pero cuando el AR-t se encuentra a elevada J. C. SEPÚLVEDA y cols. concentración (micromolar o superior), una parte puede isomerizar espontáneamente a ácido 9-cis-retinoico 14. Por ello sería posible que, a la concentración 25 µM de AR-t, la apoptosis mesangial dependiese de la activación de receptores RXR por ácido 9-cis-retinoico procedente de la isomerización de aquél. Sin embargo, la preincubación de las células mesangiales con un antagonista RXR no modificó la apoptosis inducida por AR-t. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que dicha apoptosis sucede por una vía independiente de receptores RAR y RXR. La familia de las MAPK incluye tres variedades, ERK, JNK y p38, que se activan como respuesta a una gran variedad de estímulos y median señales importantes para la generación de respuestas biológicas 15 incluyendo respuestas mesangiales a AR-t 8, 9. En el presente trabajo demostramos la implicación de p38 en la apoptosis inducida por el AR-t porque 1) su inhibidor farmacológico, SB203580, previno dicha apoptosis (figs. 4 A y B). 2) El AR-t indujo en pocos minutos la fosforilación de p38, manteniéndose fosforilada durante las 8 horas posteriores (fig. 4 C) y 3) dicha fosforilación se inhibió por preincubación con SB203580 (fig. 4 C). La participación de p38 en la apoptosis de células mesangiales ha sido previamente descrita 16 y tampoco es inusual que existan efectos del AR-t independientes de sus receptores pero dependientes de una quinasa: se ha descrito que concentraciones de AR-t superiores a 10 µM pueden unirse a la proteina quinasa C con alta afinidad en sistemas in vitro 17 y modular la actividad de esta quinasa. Mas recientemente tambien se ha demostrado que p38 se activa con t-RA 18 lo cual tiene enorme interés ya que esto implica efectos como la activación de factores de transcripción 19, producción de citoquinas 19; o inducción de la diferenciación de células eritroides 20 entre otros. El tratamiento con ATRA de la leucemia promielocítica aguda induce tasas de remisión muy elevadas --debido a que se produce la diferenciación de los promielocitos-- pero raramente confirmadas al nivel molecular. Los tratamientos con ATRA encapsulado en liposomas parecen superar este problema al conseguir unos niveles de ATRA estables con un pico plasmático en torno a 11 µM 21 frente a los 1-4 µM utilizados rutinariamente 22, 23. Aunque 11 µM es algo inferior a la concentración 25 µM precisa para inducir apoptosis mesangial, dada la tendencia a incrementar los niveles pico plasmáticos de ATRA para mejorar su efecto terapéutico, no parece improbable que puedan alcanzarse en breve concentraciones plasmáticas de ATRA suficientemente elevadas para producir la apoptosis de células mesangiales. A su vez, menores concentraciones de AR-t pueden inhibir tanto la apoptosis como la proliferación mesan138 gial 4. Estos datos sugieren que el AR-t tiene la capacidad de modular el número de células mesangiales del glomérulo. La relevancia clínica de la capacidad reguladora del número de células mesangiales se basa en dos premisas: por una parte, la hiperplasia de células mesangiales es una característica común a muchas formas de glomerulonefritis, de manera que la apoptosis constituye un mecanismo importante para la resolución de la hipercelularidad glomerular en varias formas de glomerulonefritis humana y experimental. Por otra lado, la participación de la apoptosis en la hipocelularidad de las glomerulonefritis crónicas también se ha documentado en modelos animales y en el ser humano 24, 25. Sin embargo, será preciso realizar más estudios en modelos animales de glomerulonefritis para clarificar si el AR-t y otros retinoides podrían incorporarse al arsenal terapéutico del nefrólogo. BIBILIOGRAFÍA 1. Moreno-Manzano V, Mampaso F, Sepúlveda-Muñoz JC, Alique M, Chen S, Ziyadeh FN, lglesias-de la Cruz MC, Rodríguez J, Nieto E, Orellana JM, Reyes P, Arribas I, Xu Q, Kitamura M, Lucio Cazana FJ: Retinoids as a potential treatment for experimental puromycin-induced nephrosis. Br J Pharmacol 139: 823-831, 2003. 2. Oseto S, Moriyama T, Kawada N, Nagatoya K, Takeji M, Ando A, Yamamoto T, Imai E, Hori M: Therapeutic effect of all-trans retinoic acid on rats with anti-GBM antibody glomerulonephritis. Kidney Int 64: 1241-1252, 2003. 3. 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