NEFROLOGIA. Vol. XV. Suplemento 1, 1995 Efectos tóxicos vasculares de la ciclosporina A C. Caramelo, A. López Farré, A. L. García Villalón, L. Sánchez de Miguel, M. J. Gallego, A. Riesco, M. Montón, I. Millás, J. Gómez Macías, L. Hernando y S. Casado Laboratorio de Nefrología e Hipertensión, Fundación Jiménez Díaz, y Departamento de Fisiología, Universidad Autónoma, Madrid. Nefrotoxicidad e hipertensión arterial son los dos efectos colaterales principales que acompañan a la utilización de ciclosporina A (CSA) 1-4. Estos trastorn o s , aunque dependientes de la dosis empleada, muestran una gran heterogeneidad entre los diversos individuos e insuficiente correlación con los niveles de CSA plasmática a los que se manifiestan 3; pueden ocurrir en forma aguda o crónica y no aparecen únicamente en pacientes con trasplante renal, habiéndose descrito en trasplantes de otros órganos, así com o también con el uso de CSA en situaciones distintas del trasplante, como uveítis o psoriasis 5, 6. L a toxicidad por CSA comparte con los análogos competitivos de la L-arginina la capacidad de inducir un modelo de hipertensión arterial de tipo farmacológico, circunstancia potencialmente aprovechable e n medicina experimental. Los efectos tóxicos de CSA en especies comunes de animales de laboratorio, como rata y conejo, parecen ser de magnitud significativamente menor que en los humanos y no se dispone de una explicación convincente para este hecho. Mecanismos de acción intracelular de la ciclosporina A Debido a su empleo como inmunosupresor, el mecanismo de acción celular de la CSA se ha estudiado en mayor detalle en células linfoides y debemos, por lo tanto, referirnos a ellas en forma obligatoria 7-9. En estas células (fig. 1), CSA se une a una proteína citosólica, la ciclofilina, inhibiendo su actividad peptidilprolina cis-trans isomerasa (rotamasa) y formando un c o m p l e j o tóxico CSA-ciclofilina. La diana de este complejo es una enzima citosólica, la calcineurina. La calcineurina es un complejo heterodimérico compuesto de una subunidad catalítica A y una subunidad reguladora B, que posee actividad enzimática serina/treonina fosfatasa dependiente de Ca2+-calmodulina. El efecto funcional de la inhibición de la actividad de calcineurina por CSA es la interrupción de VIAS DE ACCION INTRACELULAR DE LA CICLOSPORINA CyA CyA.......Ciclofilina Calcineurina ¿? ¿Factores de transcripción? F i g . 1.­Vías de acción intracelular de la ciclosporina. CyA = ciclosporina A. una vía de señalización dependiente de Ca2+ involucrada en el transporte celular de la subunidad citoplásmica de un factor de transcripción en las células T, el factor nuclear de células T-activadas (NF-AT), que es necesario para la expresión de genes inducida por antígenos. En ausencia de CSA, la calcineurina defosforila al NF-AT, provocando su translocación al núcleo celular. La resultante de estos efectos de CSA en los linfocitos es el bloqueo de la transición desde la fase G0 a G1 del ciclo celular (activación) y la inhibición de la expresión del RNA mensajero que codifica la síntesis de diversas proteínas. Sin embargo, no se conoce si un mecanismo similar es válido en el tejido vascular, ya que las vías de transmisión de señal de CSA están sin caracterizar en las células endoteliales y de músculo liso. En la práctica son escasos los datos referentes a efectos de la CSA en estos dos tipos celulares, un hecho un tanto sorprendente teniendo en cuenta las complicaciones vasculares del u s o de esta droga. Más aún, al desconocerse qué función cumplen en el endotelio vascular ciclofilinas y calcineurina, no es todavía posible abordar adecuadamente las vías que conducen al daño funcional. Por añadidura, la afectación por CSA de otros 61 C. CARAMELO y cols. mecanismos, descrita en otros tipos celulares, hace aún más compleja la tarea de definir las bases moleculares de su toxicidad. Los mecanismos propuest o s , como movilización de calcio, activación de proteína kinasa C, cambios en respiración mitocondrial o síntesis de proteínas de matriz, no han sido todavía explorados en células endoteliales, aunque se dispone de algunos datos en células de músculo liso vascular 1-4, 10 (ver más abajo). Toxicidad aguda por CSA Se caracteriza básicamente por una disminución del filtrado glomerular y del flujo sanguíneo renal, en el que puede tener un papel central la producción renal de endotelina 1 (ET-1). Del mismo modo, se han observado aumentos de la presión arterial y de las resistencias periféricas totales (RPT) 1, 2, 10, 11. El hecho de que el descenso del flujo sanguíneo predomine sobre el del filtrado glomerular implica un aumento de la fracción de filtración 1, 10. En trabajos realizados p r i n c i p a l m e n t e por el grupo de la Universidad de Vanderbilt se ha encontrado que el uso de antagonistas de ET-1 puede revertir parcial o totalmente los efectos vasoconstrictores renales de la administración de CSA 12, 13. En estudios más detallados, empleando vasos renales aislados, se ha encontrado que los efectos contráctiles de la CSA sobre la arteriola aferente glomerular se pueden bloquear con antagonistas de la u n i ó n de la ET-1 al receptor ET A, mientras que la c o n t r a c c i ó n por CSA de la arteriola eferente no se afecta por este mismo antagonista 14. Este punto de vista acerca de la importancia de ET-1 en los efectos agudos de la CSA no es compartido por otros autores en cuanto a la respuesta presora sistémica, postulándose que es la estimulación simpatoadrenal la responsable principal de la misma 15. Diversos estudios han sugerido que la CSA provoca una alteración en las señales de calcio en células contráctiles, que condiciona vasospasmo y contracción mesangial 10, 16, 17. Del mismo modo, se ha propuesto que un descenso en la producción de prostaglandinas vasodilatadoras por parte de las células mesangiales y del músculo liso vascular puede ser un mecanismo patogenético de especial relevancia 18-21. Toxicidad crónica por CSA Las lesiones vasculares que aparecen con la utiliz a c i ó n crónica de CSA pueden ser indistinguibles anatomopatológicamente de las que acompañan a la hipertensión arterial, aunque algunos autores consideran que los infiltrados proteicos y la inmunofluo62 rescencia para complemento observadas en la pared arteriolar son suficientes como para caracterizar a la arteriolopatía por CSA como una entidad independiente. La histología del daño renal incluye no sólo lesiones arteriolares, sino también fibrosis intersticial y atrofia tubular, que probablemente sean secundarios al daño vascular 1-4. No mencionamos en este artículo la toxicidad tubular directa por CSA, que constituye un capítulo independiente. En términos funcionales, las consecuencias de la toxicidad por CSA son un aumento de las RPT y renales (RVR) y una disminución del filtrado glomerular. Si bien los efectos agudos y crónicos sobre las RPT y RVR son parecidos, esto no significa que necesariamente estén mediados por los mismos mecanismos. Estos efectos suelen acompañarse clínicamente de hipertensión arterial, que se ha referido en proporciones diferentes en distintas series, entre un mínimo de 10 y un máximo del 60 % de los pacientes tratados; la amplitud de este rango se debe probablemente a la heterogeneidad de dosis y situaciones clínicas en que se ha empleado la CSA. Diversos estudios han analizado los posibles trastornos participantes en la toxicidad por CSA, pero los mecanismos precisos que permitan explicar el origen de las lesiones estructurales y funcionales son aún motivo de controversia, cuando no meras conjeturas. Efectos vasculares de la CSA en clínica humana y en animales de experimentación El hallazgo de elevación de la presión arterial acompañando al uso de CSA llevó a orientar los esfuerzos de investigación alrededor de dos posibilidades patogenéticas principales: la de la producción de sustancias vasoconstrictoras y la de la inhibición de mecanismos vasodilatadores. En la tabla I puede verse una lista de varios de los mecanismos de toxicidad vascular por CSA que se han propuesto. Dentro del contexto de este fenómeno tóxico con efectos en la presión arterial, se han descrito efectos de CSA sobre derivados del ácid o araquidónico, factor activador de las plaquetas (PAF) y vasodilatación dependiente del endotelio 1-4. Tabla I. Efectos de ciclosporina en células endoteliales ­ ­ ­ ­ ­ ­ Citotoxicidad. Hinchamiento y pérdida de fenestraciones. Cambios en síntesis de PGI2 y TxA2. Incremento de liberación de endotelina 1. Incremento de liberación de óxido nítrico. Acciones procoagulantes: · Liberación de factor VIII. · Disminución de la activación de trombodulina dependiente de proteína C. · Incremento de producción de tromboplastina. NEFROTOXICIDAD VASCULAR DE CICLOSPORINA GMPc (fmol/mg proteina) % relajación Control CyA Ach Ach + L-Arg Ach (log M) F i g . 2.­Diferencias en el efecto hipotensor de un agente dep e n d i e n t e de endotelio, acetilcolina (Ach), y de un agente independiente de entotelio, nitroprusiato sódico (SNF). Estudios en ratas Wistar, modificado de referencia 22, tratadas o no con ciclosporina A (CyA). Fig. 3.­Inhibición del efecto vasorrelajante de la acetilcolina (Ach) es arterias femorales de animales tratados con ciclosporina A (s) s con respecto a controles (+). Modificado de referencia 23. El postulado de la posible inhibición de mecanismos vasodilatadores llevó a proponer que la CSA tuv i e r a un efecto sobre el endotelio vascular, lugar principal de generación de metabolitos vasorrelajantes. En trabajos de diversos grupos, incluyendo nuestro laboratorio, se han hallado pruebas claras de que la CSA ejerce una parte principal de su toxicidad sob r e el endotelio vascular, sin afectar, al menos en etapas iniciales (inferiores a 2-3 semanas), al funcionalismo de la capa de células de músculo liso vascular 22-24. Este fenómeno se ilustra en la figura 2, en la que se observa una disminución del descenso de presión arterial ante bolos de un agente vasorrelajante que ejerce su acción por vía endotelial, la acetilcolina, comparado con la normalidad del efecto hipotensor de un vasodilatador independiente de endotelio, el nitroprusiato sódico. Ambos agentes ejercen su acción hipotensora por medio de estimulación vía óxido nítrico de la producción de guanosín monofosfato cíclico (GMPc) en las células de músculo liso de las paredes de los vasos arteriales; sin embargo, mientras que el nitroprusiato libera óxido nítrico de su propia molécula, la acetilcolina provoca la generación endógena del mismo por parte de la célula endotelial. En la figura 3 puede verse cómo este fenómeno de disminución de vasorrelajación ocurre también en vasos aislados extraídos de ratas tratadas con CSA 23. Un aspecto de interés adicional se representa en la figura 4: los vasos obtenidos de animales tratados con CSA presentan una producción disminuida de GMPc; s i n embargo, al añadir un exceso de L-arginina al medio, no sólo se consigue restablecer una producción normal de GMPc, sino que llegan a alcanzarse valores supranormales. Este dato confirma que la alteración producida por CSA no afecta a la guanilato % disminución de MAP Control CyA Ach 300 Ach 10 SNP Fig. 4.­Efecto del tratamiento con ciclosporina A (CyA) sobre la producción de GMPc por segmentos de arteriolas. Reversión por L-arginina (L-Arg). Modificado de referencia 23. c i c l a s a , enzima generadora de GMPc; más aún, el hecho de que el aporte de L-arginina, sustrato de la óxido nítrico sintasa, produzca un aumento intenso de GMPc indica que la actividad óxido nítrico sintasa no sólo no está inhibida, sino que puede hallarse incrementada. En este sentido están en curso estudios e n nuestro laboratorio tendentes a caracterizar la producción de óxido nítrico por los vasos arteriales de animales tratados con CSA y establecer por qué tipo de óxido nítrico sintasa está mediada. Efectos de la ciclosporina en células endoteliales La tabla I recoge los principales datos de la literatura acerca de los efectos endoteliales de CSA. Las primeras pruebas acerca de una posible toxicidad en63 C. CARAMELO y cols. dotelial de la CSA provienen de observaciones en los vasos renales de pacientes tratados con esta droga. P o r razones desconocidas, estas lesiones son más marcadas en la especie humana que en los modelos animales y consisten inicialmente en el desarrollo de vacuolas y posterior necrosis y desprendimiento celular en el endotelio de arteriolas y pequeñas arterias renales. Al desprenderse, estas células endoteliales dejan expuestas zonas de membrana basal y matriz, que ofrecen un terreno apropiado para la acumulación de fibrina y plaquetas. Diversos autores han referido la aparición de alteraciones de células endoteliales en cultivo al ser tratadas con CSA, tal como se detalla en la tabla II 4, 9, 25-30. Estos cambios implican la existencia de efectos citotóxicos de CSA sobre el endotelio, de mecanismo bioquímico aún desconocido, pero con proyección funcional en al menos dos áreas: la regulación del tono vascular y del equilibrio entre factores pro y anticoagulantes. El primer grupo de trastornos podría explicar la aparición de hipertensión arterial y el segundo las lesiones con aspecto s i m i l a r al síndrome urémico hemolítico/púrpura trombótica trombocitopénica halladas en algunos pacientes con intoxicación por CSA 1. cionado con la isoenzima inducible de óxido nítrico sintasa. Abundando en el mismo tema, existen datos en células de origen nervioso y endoteliales indicando una disminución de formación de óxido nítrico en períodos cortos de incubación, atribuibles a una inhibición de la actividad de la forma constitutiva de la sintasa de óxido nítrico 32. Este dato de posible incremento de expresión de sintasa de óxido nítrico inducible, así como la expresión de HSP70 y fragmentac i ó n de DNA, sugieren la puesta en marcha de mecanismos de transcripción de señales de síntesis proteica y expresión génica por la acción de CSA y requieren una mayor profundización experimental. Efectos de la ciclosporina en células de músculo liso vascular y mesangiales Varios grupos han buscado la existencia de efectos d i r e c t o s de la CSA sobre estos tipos celulares, que son la pieza clave de los efectos de hipercontractilid a d vascular y disfunción glomerular asociados al uso de CSA. Los principales resultados de estos estudios se enumeran en la tabla II. Entre estos datos debemos destacar el efecto de CSA incrementando la movilización de calcio, hallado tanto en células mesangiales como de músculo liso vascular 10, 16, 17, y el bloqueo de la inducción por citoquinas de la sintasa i n d u c i b l e de óxido nítrico en presencia de CSA 33. Este último resultado podría presuponer una diferencia entre células endoteliales, en las que la CSA aumenta la producción de óxido nítrico y mesangiales, en las que ocurre lo contrario. Un corolario interesante de los efectos de la CSA sobre células endoteliales se ha encontrado en experimentos recientes de nuestro laboratorio, en los que se observa una disminución de captación de calcio por células de músculo liso coincubadas con endotelio tratado con CSA 30. Bunchman y Brookshire han descrito un fenómeno de proliferación de músculo liso secundario a un aumento de producción de ET-1 por células endoteliales tratadas con CSA 34. Si bien la proyección patofisiológica de estos hallazgos no está aún claramente establecida, dirigen la atención hacia las posibles interacciones existentes entre los diversos tipos celulares de la pared arterial sometidos a tratamiento con GSA. Alternativas preventivas o terapéuticas para bloquear la toxicidad por CSA La carencia de una droga inmunosupresora de eficacia equivalente a la CSA, pero desprovista de toxicidad, ha llevado a continuar con la utilización de ésta, a pesar de los efectos secundarios que conlleva, Tabla II. Efectos de ciclosporina en células de músculo liso y mesangiales ­ Aumento del pico de Ca2+ citosólico por acción de vasoconstrictores. ­ Aumento de la entrada y salida de calcio. ­ Aumento de la síntesis de factor activador de las plaquetas. ­ Inhibición del efecto de interleuquina 1 B sobre la expresión de la sintasa inducible de óxido nítrico. ­ Aumento de la expresión del receptor ET B de la endotelina. ­ Incremento de proliferación vía endotelina generada por células endoteliales. En trabajos recientes de nuestro laboratorio hemos encontrado que la exposición de células endoteliales b o v i n a s en cultivo a diversas concentraciones de GSA conlleva un incremento marcado de la producción de óxido nítrico, que, sin embargo, no sólo no se acompaña de un aumento, sino de un descenso en la producción de GMP cíclico, segundo mensajero reconocido del óxido nítrico. Al mismo tiempo, las células expuestas a CSA expresan proteínas asociadas al sufrimiento celular (HSP70) y fragmentación del DNA, que sugieren la existencia de una agresión endotelial por parte de la CSA (López Farré y cols., datos no publicados). El aumento de la producción de óxido nítrico tras períodos de incubación relativamente prolongados (18-24 h) 30, pero no en espacios de tiempo cortos (4 o menos horas) 31, sugiere que el referido aumento de óxido nítrico podría estar rela64 NEFROTOXICIDAD VASCULAR DE CICLOSPORINA y ha creado la necesidad de desarrollar abordajes preventivos o terapéuticos para limitar la magnitud de las acciones adversas. En este sentido, uno de los aspectos más inquietantes de la toxicidad por CSA es la posibilidad de que los efectos tóxicos estén directamente relacionados o sean idénticos a los inmunosupresores 35. En esta línea de razonamiento habría que preguntarse si al intentar una maniobra terapéutica que bloquee la toxicidad no estemos haciendo lo mismo con el efecto terapéutico de la droga. Este es un tema aún por resolver y la respuesta estará probablemente en la elucidación de los mecanismos intracelulares de toxicidad por CSA. Entre tanto, diversos grupos han realizado ensayos farmacológicos con fin e s antitóxicos, que si bien en algunos casos han conseguido resultados potencialmente aplicables, no han proporcionado aún una solución práctica eficaz al problema. Los ensayos referidos han estado, naturalmente, estrechamente relacionados con las diversas hipótesis acerca de la patogenia de la toxicidad por CSA 36-40. La tabla III recoge algunos de los principales agentes empleados contra el daño renal y vascular por CSA. Puede verse la considerable variabilid a d de los compuestos utilizados, entre los que destacan análogos o precursores de derivados vasodilatadores y antagonistas de derivados vasoconstrictores de la cicloxigenasa. En estudios de nuestro lab o r a t o r i o se ha descrito que el precursor de óxido nítrico, L-arginina, ejerce un efecto protector sobre la disminución de función renal y el déficit de la vasodilatación dependiente de endotelio producidos por CSA en ratas normales 22, 23. Estos resultados se han visto confirmados posteriormente por otros grupos 41, aunque todavía resta por establecerse el mecanismo preciso por el cual la L-arginina y su producto el óxid o nítrico disminuyen la toxicidad de CSA. Como confirmación indirecta de la importancia de esta vía, en la reciente reunión de la Sociedad Americana de Nefrología se han presentado varias comunicaciones demostrando un incremento del deterioro de la función renal por CSA en presencia de antagonistas de la formación de óxido nítrico 42-44. Los datos patofisiológicos obtenidos recientemente y que acabamos de reseñar, si bien no han resuelto aún todas las incógnitas, permiten augurar la aparición de alternativas preventivas de uso clínico que permitan limitar la toxicidad de CSA en un plazo no excesivamente lejano. Si se conseguirá este objetivo antes o después de la aparición de terapéuticas antirrechazo más eficaces que las pautas actuales de inmunosupresión es en realidad la principal incógnita. 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Aceite de pescado (eicosapentanoico). Antagonistas de tromboxano. Antagonistas del factor activador de las plaquetas. Antagonistas de endotelina 1. L-arginina. Bloqueantes de canales de calcio. Antagonistas dopaminérgicos D1: fenoldopam. 65 C. CARAMELO y cols. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. t i o n by rat mesangial cells in culture. Kidney Int 3 5 : 1 1 6 1 1167, 1989. Kurtz A, Pfeilschifter J, Kuhn K y Koch KM: Cyclosporine A inh i b i t s PGE 2 r e l e a s e from vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Com 147:542-549, 1987. Brown Z y Held GH: Cyclosporin inhibits prostacyclin production by cultured human endothelial cells. Transplant Proc 19:1178-1180, 1987. Stunnock NDC y Struthers AD: Hormonal and other mechanisms involved in the pathogenesis of cyclosporin-induced n e p h r o t o x i c i t y and hypertension in man. C l i n Sci 8 6 : 1 - 9 , 1990. 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