VITAMINAOLEN IA. Vol. XVII. Núm. DE 1997 NEFR E OG NEFROTOXICIDAD 3. CyA Efecto de la vitamina E sobre la nefrotoxicidad de la ciclosporina A T. Parra, G. Arriba*, G. Pérez de Lema**, I. Arribas**, M. Goñi*, M. Rodríguez-Puyol** y D. Rodríguez-Puyol** Unidad de Investigación. *Sección de Nefrología. Hospital General Universitario de Guadalajara. Departamento de Medicina. Universidad de Alcalá de Henares. **Departamento de Fisiología y Farmacología. Universidad de Alcalá de Henares. RESUMEN Las especies reactivas de oxígeno han sido implicadas en la nefrotoxicidad de la ciclosporina A (CyA), bien directamente o bien a través de la activación de la peroxidación lipídica. Hemos demostrado previamente que la CyA provoca un aumento de la síntesis glomerular y de la excreción urinaria de tromboxano B2 (TXB2) en ratas. Nuestro objetivo fue evaluar el efecto que el antioxidante vitamina E (VitE) tiene sobre la función renal, peroxidación lipídica y síntesis de peróxido de hidrógeno (HO) en glomérulos aislados de ratas tratadas con CyA. Se utilizaron ratas Wistar macho de 250-275 g de peso. Se administró CyA me diante canulación oral (30 mg/kg/día) durante 30 días. En otro grupo se suple mentó el agua de bebida con VitE (-tocoferol, 0,05 mg/dl) y simultáneamente a la CyA (30 mg/kg/día). Los resultados se compararon con un grupo control y otro tratado exclusivamente con VitE. Se determinaron malonildialdehído (MDA) en suero y MDA, HO y TXB2 en glo mérulos aislados. La CyA produjo un deterioro de función renal y paralelamente aumentó la sín tesis glomerular de HO, MDA y TXB2; además, también aumentó el MDA sérico. La VitE no afectó a estos parámetros, pero evitó tanto el deterioro de función renal como el aumento de HO, MDA y TXB2 glomerular y de MDA sérico originados por la CyA. En conclusión, la CyA aumenta la síntesis de especies reactivas de oxígeno, pe roxidación lipídica y TXB2 a nivel glomerular. El antioxidante VitE inhibe los efec tos de la CyA sobre estos parámetros, sugiriendo un papel de las especies reac tivas de oxígeno en la nefrotoxicidad de la droga. Palabras clave: Ciclosporina A. Vitamina E., -tocoferol. Agua oxigenada. Ma lonildialdehído. Tromboxano B2. Recibido: 30-X-96. En versión definitiva: 21-II-97. Aceptado: 24-II-97. Correspondencia: Dr. Gabriel de Arriba de la Fuente. Sección de Nefrología. Hospital Universitario de Guadalajara. C/ Donante de Sangre, s/n. 19002 Guadalajara. 221 T. PARRA y cols. VITAMIN E TREATMENT ABOLISHES CYCLOSPORINE A NEPHROTOXICITY SUMMARY Reactive oxygen species have been implicated in cyclosporine A (CyA) neph rotoxicity directly or through the activation of the lipid peroxidation process. We have previously demonstrated that CyA increases glomerular synthesis and urinary excretion of tromboxoxane B2 (TXB2) in rats. Our aim was to analyze the effects of VitE (-tocoferol) on kidney function, lipid peroxidation and glomerular synthesis of hydrogen peroxide (HPO) in isola ted rat kidney glomeruli of rats treated with CyA. Male Wistar rats weighting 250-275 g were treated with oral CyA (30 mg/kg/day) for 30 days. In another group, rats drank water supplemented with VitE (0.05 mg/dl) and were treated with CyA (30 mg/kg/day). Results were compared with a control group and a group treated only with VitE. We determined malonyldialdehyde (MDA) in serum. Furthermore, in isolated glomeruli we analized MDA, HPO (by the peroxidase red pehnol method) and TXB2 (by radioimmunoassay). CyA induced kidney failure and increased serum MDA. CyA also increased glo merular synthesis of these mediators. We concluded that CyA caused deterioration in kidney function and increased glomerular synthesis of reactive oxigen species, lipid peroxidation and TXB2. VitE inhibited these effects suggesting a role of free radicals, probably through the in duction of lipid peroxidation and subsequent synthesis of TXB2, in CyA nephro toxocity. Key words: Cyclosporine A. Vitamin E. -tocopherol. Hydrogen peroxide. Ma lonildialdehyde. Tromboxane B2. INTRODUCCION El principal problema derivado de la terapéutica con ciclosporina A (CyA) es su capacidad nefrotóxica1-4. Aunque se ha avanzado mucho en el estudio de sus posibles mecanismos, todavía hoy persisten importantes lagunas de conocimiento respecto a los factores implicados, así como a la utilización de posibles tratamientos preventivos de la misma5-11. Hemos demostrado que la CyA es capaz de aumentar tanto la síntesis glomerular como la excreción urinaria de tromboxano (TX) en ratas12, y se ha postulado que el TX podría contribuir a la nefrotoxicidad aguda de la droga. Sin embargo, no se conocen con claridad los mecanismos por los que la CyA estimula la síntesis de TX. Por otro lado, los radicales libres han sido implicados en el daño originado por CyA13-16. Así, Wang y cols.16 han demostrado que la utilización de antioxidantes puede evitar la nefrotoxicidad de la CyA en un modelo experimental. Nuestro objetivo ha sido evaluar el efecto del tratamiento con el antioxidante -tocoferol sobre la función renal, peroxidación lipídica y síntesis de peróxido de hidrógeno (HO) en glomérulos aislados de ratas tratadas con CyA. 222 MATERIA L Y METODOS Animales de experimentación Se utilizaron ratas Wistar macho de 250-275 g de peso al comienzo de los experimentos criadas y seleccionadas en nuestro animalario. Se mantuvieron a 22 ± 2º C de temperatura y con un ciclo de luz análogo al solar. Los animales utilizados se mantuvieron y manipularon según la normativa europea sobre experimentación y protección animal. Fueron alimentados con dieta de mantenimiento rata-ratón estándar (IMP-R20, Letica, Barcelona), y tanto la dieta como el agua de bebida se suministraron ad libitum. La dosis de CyA se dispensa mediante canulación oral a las 9 de la mañana desde el comienzo del tratamiento hasta el día anterior al sacrificio y la suplementación con el -tocoferol se incluye en el agua de bebida. Diseño experimental Se realizaron cuatro grupos experimentales (con 10 animales por cada uno): control, que fue tratado con el excipiente de la CyA (etanol al 12,6%); VitE, animales a los que se suplementó con vitamina E en el agua de bebida a una dosis de 0,05 mg/dl; CyA, ani- VITAMINA E EN NEFROTOXICIDAD DE CyA males tratados con CyA a una dosis de 30 mg/kg/día; VitE + CyA, animales a los que se suplementó en el agua de bebida con VitE (0,05 mg/dl), que además fueron tratados con CyA (a una dosis de 30 mg/kg/día). La duración del experimento fue de 30 días. Muestras biológicas Se recoge orina de 24 horas al comienzo y al final de cada experimento. Los animales se sacrifican tras anestesia en campana con éter etílico. La extracción de sangre se realiza por canulación en la bifurcación aorto-femoral, recogiéndose una muestra en tubo con heparina para análisis bioquímico, se centrifuga y el suero se almacena a 4º C hasta el momento de su análisis. Otra muestra se recoge sobre EDTA para la determinación de niveles de CyA. Tras la exanguinación y muerte del animal se clampan las arterias renales y se perfunden los riñones a través de la aorta. De los riñones perfundidos se separa la corteza y por tamizado diferencial se extraen los glomérulos según un método previamente descrito17. Los glomérulos obtenidos se resuspenden en 2 ml de Tris-Glucosa (Tris 20 mM, NaCl 130 mM, KCl 5 mM, acetato sódico 10 mM, glucosa 5 mM, pH = 7,4) y se separan 100 µl para la determinación de proteínas. Las muestras para determinación de HO y MDA se procesan inmediatamente. El resto se incuba a 37º C en baño de agua durante 30 min; se centrifuga a 1.500 g durante 5 minutos, se alicuota el sobrenadante y se congela a ­80º C para determinación posterior del TXB2. Técnicas analíticas Análisis bioquímico Las determinaciones séricas y urinarias de creatinina, urea, glucosa e iones se llevaron a cabo en un autoanalizador bioquímico (Dimension AR, Dupont). La concentración de proteínas en glomérulos se determinó mediante el método de Lowry18. Los niveles de CyA en sangre se determinaron tras dilución (1:10) en tampón fosfato con estabilizador de proteínas; se empleó un «inmunoensayo de polarización por fluorescencia (FPIA)» (TDx Analyzer, Abbott). Producción de peróxido de hidrógeno (HO) La determinación se basa en el método de Baud y cols. con ligeras modificaciones para su aplicación a glomérulos19. Se utiliza una reacción enzimática con una peroxidasa añadida a las muestras. La cuantificación se realiza por detección colorimétrica con el indi- cador rojo fenol y lectura espectrofotométrica a 610 nm frente a blanco. Los resultados se leen frente a una curva estándar de peróxido de hidrógeno del 30% de riqueza en un intervalo de 0,25 µM a 25 µM. Medida de «sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS)» La denominación TBARS engloba a una serie de productos resultantes del proceso de peroxidación lipídica. Reaccionan con el ácido tiobarbitúrico por calentamiento en medio ácido, produciendo un cromóforo rosa correspondiente a cantidades equimoleculares de malonildialdehído (MDA) cuya concentración se determina por lectura espectrofotométrica a 533 nm20. Los TBARS constituyen un índice útil para medir la peroxidación lipídica21. El cálculo de las concentraciones se hace frente a una curva de calibración de 1,1,3,3 tetraetoxipropano (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) procesada de la misma manera que las muestras. Cuantificación de tromboxano B2 (TXB2) La cuantificación de TXA2 se lleva a cabo por medición de su metabolito estable el TXB2 inmunorreactivo mediante un RIA12 con anticuerpos específicos para TX (Sigma Inmuno Chemicals). La técnica presenta una recuperación del 93% para el estándar de 62,5 pg/0,1 ml y una sensibilidad de 3 pg/0,1 ml. El coeficiente de variación intraensayo es del 5-10%, y el del interensayo, del 12-15% según niveles. Análisis estadístico Los datos se analizaron mediante test para muestras no paramétricas de Friedman, Kruskal-Wallis o Mann Whitney. Los resultados se expresan como media ± error estándar y la significación estadística se fijó para p < 0,05. RESULTADOS Los niveles de CyA en sangre total en el grupo tratado con CyA fueron de 5.773 ± 981 ng/ml y en el grupo tratado con VitE y CyA de 5.470 ± 367 ng/ml, no existiendo diferencias entre ambos. La ingesta de comida y de agua fue similar y la ganancia de peso tampoco tuvo diferencias entre los grupos, aunque en las ratas tratadas con CyA ésta fue discretamente menor. Tampoco existieron diferencias entre la ingesta de agua en los animales de los cuatro grupos experimentales (tabla I). 223 T. PARRA y cols. Tabla I. Aumento de peso corporal y valores de ingesta. Control Vit. E CyA Vit. E + CyA Incremento de peso (g/día) ...... 5,4 ± 0,5 5,9 ± 1,1 3,7 ± 1,4 5,6 ± 1,5 Ingesta de comida (g/día) ........ 22,5 ± 1,1 18,9 ± 0,6 20,4 ± 1,8 17,9 ± 1,4 Ingesta de agua (ml/día) .......... 41,6 ± 4,5 38,0 ± 4,0 41,2 ± 4,5 37,1 ± 2,1 La CyA provocó un deterioro de función renal, manifestado por un aumento de la creatinina y urea séricas, con descenso del aclaramiento de creatinina. Además, indujo un aumento de la glucemia y de las cifras de potasio sérico. Finalmente, descendió de modo significativo la osmolaridad urinaria. El tratamiento con VitE no modificó ninguno de los parámetros anteriores en relación al grupo control. Por otro lado, la VitE evitó el deterioro de la función renal, así como el aumento de glucemia y del potasio sérico inducidos por la CyA, aunque no fue capaz de neutralizar los efectos de la CyA sobre la osmolaridad urinaria (tabla II). Fig. 1.--Síntesis glomerular de agua oxigenada (HO). p < 0,05 vs control. Tabla II . Parámetros analíticos séricos y urinarios. Control Suero Crea (mg/dl) ................ 0,54 ± 0,02 Urea (mg/dl) .............. 26,8 ± 3,6 CCrea (ml/min 100 g) 0,56 ± 0,12 Na (mmol/l) ................ 139,6 ± 1,4 K (mmol/l) .................. 4,4 ± 0,1 Gluc (mg/dl) .............. 175,6 ± 12,6 Orina Exc. Na (µmol/min) .... 0,35 ± 0,02 Exc. crea (mg/24 horas) 11,4 ± 2,2 Osmol. (mOsmol/kg) .. 1.627 ± 335 p < 0,05 vs. control Vit. E 0,56 ± 0,03 27.8 ± 1.7 0,48 ± 0,08 140,6 ± 0,7 4,3 ± 0,1 192,6 ± 8,2 CyA 0,80 ± 0,04* 35,5 ± 3,3* 0,30 ± 0,04* 136,3 ± 1,8 5,1 ± 0,3* 291,8 ± 20,8* Vit. E + CyA 0,60 ± 0,00 31,5 ± 1,8 0,50 ± 0,10 140,5 ± 1,2 4,5 ± 0,2 214,0 ± 26,3 0,20 ± 0,02* 9,4 ± 0,8 894 ± 150* 0,36 ± 0,05 0,20 ± 0,02* 14,6 ± 1,2 11,4 ± 0,8 1.953 ± 351 1.178 ± 102* Fig. 2.--Malonildialdehído sérico (MDA), medido como sustan cias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS). p < 0,05 vs control. Tras tratamiento con CyA se observó un aumento de la producción de HO glomerular en relación a las ratas controles o tratadas exclusivamente con VitE. En ratas tratadas simultáneamente con CyA y VitE no se modificó la síntesis de HO glomerular (figura 1). La CyA provocó un aumento del MDA sérico y glomerular, a diferencia de lo que sucedió en ratas controles y en las tratadas con VitE. Por otro lado, el tratamiento con VitE evitó el aumento de MDA inducido por CyA en suero y en glomérulos aislados (figs. 2 y 3). Finalmente, la VitE evitó también el aumento de la síntesis glomerular de TXB2 que había inducido la CyA (fig. 4). 224 Fig. 3.--Malonildialdehído glomerular (MDA), medido como sus tancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS). p < 0,05 vs control. VITAMINA E EN NEFROTOXICIDAD DE CyA Fig. 4.--Tromboxano B2 glomerular. p <0 05 vs control discusion como hemos demostrado previamente12 la cya es capaz de aumentar un modo dependiente del tiempo y dosis utilizada síntesis glomerular excreción urinaria txb2 en nuestro estudio se planteó hipótesis que este aumento podría estar relacionado con formación especies reactivas oxígeno posterior peroxidación lipídica el -tocoferol administró por vía oral varias razones primer lugar comprobó mediante nefelometría a las utilizadas disuelve adecuadamente agua no forma emulsiones otro lado una cómoda evita administración elevadas puntual utilizaron concentraciones altas vite para garantizar suplementación cantidad suficiente además teniendo cuenta ingesta hídrica hay diferencias entre unos grupos otros fue similar todos los experimentos interfirió absorción ya sus niveles sanguíneos fueron similares animales tratados exclusivamente o ésta antioxidante tuvo efectos sobre parámetros analíticos estudiados sin embargo neutralizar efecto deletéreo función renal estos hallazgos sugieren deterioro inducido mediado radicales libres wang cols 16 ratas uninefrectomizadas tratadas 12 5-25 mg kg día durante 4-8 semanas demuestra también vie mejoró aclaramiento creatinina flujo sanguíneo resistencia vascular grado fibrosis paralelo al descenso producido nivel urinario había aumentado tratamien- to nosotros demostramos neutralizó mda suero glomérulos aislados sugiriendo podrían mediados lípidos membrana tratamiento produjo otras alteraciones electrolíticas hiperglucemia e hipercaliemia ha postulado derivarse toxicidad directa droga islotes pancreáticos acción periférica insulina secundaria insuficiencia trastornos electrolíticos condicionados fármaco aunque autores proponen alteración glucógeno hepático22 nuestros datos glucemia ulterior inhibido mecanismo provocada parece ser multifactorial su génesis contribuyen probable tóxico directo túbulo suprarrenal disminución aldosterona23-25 resultados menos alguno están obstante puede descartar papel tener potasio sérico evitó desarrollo finalmente modificó osmolaridad simultáneamente hecho sugiere tubular está mediada mecanismos diferentes producción ho sabe anión superóxido células endoteliales26 laboratorio existen confirman mesangiales cultivadas aumentan respuesta cya27 mayor parte generada corteza proviene dismutación enzima dismutasa28 posible produzca mismo especulado metabolismo través superfamilia enzimas citocromo p-450 liberación más concretamente superóxido29 elimina eliminar reacti225 t parra vas así evitar índice grosero marcador observamos abolido microsomas hepáticos renales rata humanos30 bloquearse glutation dismutasa catalasa31 produce peróxido hidrógeno pero provocado comportándose scavenger inducción numerosos estudios han tx nefrotoxicidad inducida utilizando antagonistas sintetasa receptor tx32-37 conoce profundidad producir metabolitos ácido araquidónico junto productos f2-isoprostano16 protector capacidad serían inductores posiblemente conclusión apoyan inducen daño bien mediadores conocemos si antioxidantes exógenos influir inmunosupresores sería gran utilidad realización encaminados estudiar esta luz simultáneo clínica prevención secundarios agradecimientos trabajo sido financiado beca fis 93 19 cid becaria b fondo investigación sanitaria 226 agradecemos colaboración miembros unidad hospital general universitario guadalajara particular doctor fernando carballo alvarez doña inmaculada batanero blázquez milagros esteban santamaría presente recibió accésit básica fundación iñigo toledo convocatoria 1996 comunicados congreso nacional nefrología sen salamanca americano nueva orleáns bibliografia 1 robert m graham md: cyclosporine: mechanisms of action and toxicity cleve clin j med 61: 308-313 1994 2 chapman jr griffiths d harding ngl morris pj: reversibility cyclosporin nephrotoxicity after three months treatment lancet 1: 128-130 1985 3 barros ejg boim ma ajzen h ramos ol schor n: hemodynamics hormonal participation on kidney int 32: 19-25 1987 4 myers bd: what is transplant proc 21: 1430-1432 5 gerkens jf smith aj: effects captopril theophylline cyclosporine-induced in rats trans plantation 40: 213-214 6 kon v: causes endothelin-dependent acute failure 37: 486-492 1990 7 cairns hs fairbanks ld westwick neil gh: therapy vivo attenuates the response vasodilators isolated perfused rabbit br pharmacol 98: 463-468 1989 8 lamas s olivera lópez-novoa jm lópez-farré hernando l: effect bn 52021 function impairment en: braquet p editor ginkgo lides: chemistry biology pharmacology clinical pers pectives barcelona: prous 2: 547-559 9 dos santos ej pirotzky role plateletactivating factor thromboxane lipids 26: 1320-1323 1991 10 paller ms: prostaglandin e1 analogue misoprostol transplantation 45: 1126-1131 1988 11 coffman tm ruiz sanfilippo f: chronic inhibition preserves rejecting rat allografts 35: 24-30 arriba g pérez lema arribas i martín-carballido rodríguez-puyol d: ciclosporina aumenta tromboxano 126: 220-227 13 yoshimura r n nakatanis t: cyclosporine microsomal cytochrome systems nephrol 339-345 1993 14 walker rj lazzaro va duggin gg horvath js tiller dj: evidence that alterations metabolism lipid peroxidation may contribute 50: 487-492 15 duruibe okonmah blyden gt: liver glutathione content 39: 205-212 vitamina c salahudeen ak: accompanies nephrotoxicity: vitamin 7: 927-934 1995 17 misra rp: isolation glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving am pathol 58: 135-139 1972 18 lowry oh rosebrugh ng farr randall lj: protein measurement with folin phenol reagent biol chem 193: 265-269 1951 baud l ardaillou r: dexamethasone hydrogen peroxide production mesangial cells during phagocitosis physiol 250: f596-f604 1986 20 yagi k peroxidesin me dicine assay for serum level its significance academic press 1980 21 satoh k: cerebrovascular disorders determined new colorimetric method chim acta 90: 37-43 1978 22 betschart virji shinozuka h: a-induced hepatic glycogen suppl : 880-884 23 thiel g: experimental summary international workshop 25: s205s210 24 mason j: pathophysiology sanimmune man animals pediatr 4: 554-574 25 neild cameron davison grünfeld jp kerr ritz editores: ox ford textbood nephrology oxford: oxford university 1560-1569 26 diederich skopec dai fx: produces endothelial dysfunction increased superoxide hypertension pt 957-961 27 torrecillas iglesias i: reactive oxygen species mediates human cultured abstract book abstracts xvi congress society barcelona 469 28 shah sv pd ueda nath ka harvey gonick editor: current metabolites toxic st louis: mosby 18: 75-98 29 attenuation an antioxidant-inhibitor vitro 940-946 30 31 ahmed ss strobel hw napoli kl grevel adrenochrome reaction implicates radicals fk-506 microsomes exp ther 265: 1047-1054 32 smeesteers chaland giroux moutquin etienne douglas f corman st-louis daloze p: prevention synthetase inhibitor supl 658-664 33 gladue rp newborg mf: protective dazmegrel cyclosporine-treated tansplantation 52: 837-841 34 sr creech ea schaffer av martin ll rakhit fl klotman pe tm: synthase cgs 13080 41: 199-205 1992 35 grieve em: reversal biochem 1351-1354 36 perico rossini imberti malanchini cornejo gaspari bertani remuzzi blockade improves survival eith isograft soc 1398-1404 37 bunke wilder a: protection filtration rate antagonist l655 240 duringh low dose administration prostaglandins 43: 351-360 227