NEFROLOGÍA. Vol. XXV. Número 2. 2005 Daño vascular en la insuficiencia renal crónica. El aumento de depósitos vasculares de nitrotirosina y citocinas se acompaña de una elevación de la expresión vascular de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) P. Gómez-Fernández, J. Pérez-Requena*, V. Sánchez-Margalet**, J. Esteban***, M. Murillo-Carretero****, M. Almaraz-Jiménez Servicio de Nefrología Hospital de Jerez. *Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Puerta del Mar. **Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla. ***Departamento central de investigación área de salud, Universidad de Cádiz. ****Área de fisiología. Facultad de Medicina. Universidad de Cádiz. RESUMEN La insuficiencia renal crónica (IRC) se acompaña de un aumento de la morbimortalidad cardiovascular debido a la concurrencia de factores de riesgo cardiovascular tradicionales y otros factores inherentes a la uremia como estrés oxidativo, hiperhomocisteinemia, anomalías del metabolismo fosfocálcico, anemia y fenómenos inflamatorios entre otros. Para analizar la repercusión vascular de la IRC, en este trabajo se hace un estudio histomorfométrico (grosor íntima-media) y de los depósitos vasculares (inmuno-histoquímica) de la proteína quimiotáctica de monocitos (MPC-1) de la arteria radial en 13 sujetos con IRC, Se determinan, también, la expresión vascular( western blot) de nitrotirosina (marcador del efecto de especies reactivas de oxígeno (ROS) sobre el óxido nítrico (ON), de la MCP-1 (citocina con efecto aterogénico) y de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), y la actividad de la NOS. Los hallazgos se comparan con los observados en la arteria pudenda, arteria muscular de las mismas características que la radial, en un grupo control sano (n: 16), de edad y sexo similares a los enfermos. El grosor de la íntima y de la media fue mayor en los enfermos (íntima 108 ± 16 vs 14 ± 2,5 µ, p < 0,001; media: 291 ± 19 vs 153 ± 15 µ, p < 0,001). La expresión vascular de la MCP-1 en los enfermos fue más elevada que en los controles (2 ± 0,15 vs 0,6 ± 0,12 u, p < 0,001). La expresión de la proteína se correlacionó con los depósitos inmunohistoquímicos de la misma (r: 0,98, p < 0,0001). Las arterias de los enfermos con IRC tenían mayor expresión de nitrotirosina que las de los sujetos sanos (2,1 ± 0,1 vs 0,42 ± 0,1 u, p < 0,0001). No existieron diferencias significativas en la actividad de la NOS entre los dos grupos. La expresión de la eNOS, sin embargo, fue significativamente más elevada en los enfermos con IRC (1,73 ± 0,1 vs 0,67 ± 0,1 u, p < 0,001). La expresión de la nitrotirosina y de la eNOS se correlacionó directamente con la presión arterial Recibido: 11-II-2004. En versión definitiva: 6-VIII-2004. Aceptado: 12-IX-2004. Correspondencia: Dr. Pablo Gómez-Fernández Servicio de Nefrología. Hospital del SAS Ctra. Circunvalación, s/n 11407 Jerez (Cádiz) 155 P. GÓMEZ-FERNÁNDEZ y cols. sistólica. No obstante, las diferencias entre los grupos persistieron tras los ajustes a los valores de presión arterial. Estos resultados demuestran que en la IRC, a nivel de la arteria radial, existen cambios preaterosclerosos, y un aumento de los depósitos de nitrotirosina, marcador del efecto de ROS sobre el ON. Secundariamente a la disminución de la bioactividad del ON, se produce un aumento compensador de la expresión vascular de la eNOS. Palabras clave: Aterosclerosis. Insuficiencia renal crónica. Nitrotirosina. Estrés oxidativo. Óxido nítrico. VASCULAR DAMAGE IN CHRONIC RENAL FAILURE. THE INCREASE OF VASCULAR NITROTYROSINE AND CYTOCHINES ACCUMULATION IS ACCOMPANIED BY AN INCREASE OF ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE (ENOS) EXPRESSION SUMMARY Patients with chronic renal failure (CRF) are at a greatly increased risk of cardiovascular mortality. This fact could be due to the presence of conventional risk factor and specific uremic as increase of oxidative stress, hyperhomocystaenemia, deranged calcium-phosphate metabolism and chronic inflammatory state. In order to analyce the vascular effects of CRF, we studied the histomorphometric characteristics (intima-media tickness and monocyte chemoattractant protein (MCP-1) accumulation (inmunohistochemical) on radial artery from 13 patients with CRF. We determined by Western blot analysis, the vascular nitrotyrosin abundance (footprint of nitric oxide (NO) inactivation by reactive oxygen species (ROS), and the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression. The NOS activity was, also, determined. The results were compared with those obtained in pudenda artery from a healthy control group (n: 16). The CRF group showed a significant increase in intima and media tickness 108 ± 16 vs 14 ± 2,5 µ, p < 0,001 and 291 ± 19 vs 153 ± 15 µ, p < 0,001, respectively). The CRF group exhibited a marked elevation of MCP-1 vascular expression (2 ± 0,15 vs 0,6 ± 0,12 u, p < 0,001). A significant positive correlation was found between MCP-1 vascular expression and its inmunohistochemical deposits (r: 0,98, p < 0,0001). Nitrotyrosin abundance (western blot) was significantly increased in artery of CRF patients (2,1 ± 0,1 vs 0,42 ± 0,1 u, p < 0,0001). No significant differences was found in NOS activity between CRF and control groups. However, eNOS expression was greatly increased in the CRF patients (1,73 ± 0,1 vs 0,67 ± 0,1 u, p < 0,001). A significant positive correlation was found between nitrotyrosin and eNOS expression and systolic arterial pressure. However, the differences between CRF and control groups persisted after statistically fitting to arterial pressure. The present study demonstrate that in CRF there are arterial preatherosclerotic changes and an increase of vascular nitrotyrosin accumulation, wich is the footprint of NO inactivation by ROS. The secondary NO inactivation can, in turn, contribute to eNOS vascular upregulation. Key words: Atherosclerosis. Oxidative stress. Nitrotyrosin. Chronic renal failure. Nitric oxide. 156 DAÑO VASCULAR EN LA IRC INTRODUCCIÓN Diversos estudios demuestran que la insuficiencia renal crónica (IRC) se acompaña de un aumento de la morbi-mortalidad cardiovascular 1-3. En la IRC, con frecuencia, coexisten múltiples factores de riesgo cardiovascular (hipertensión arterial, diabetes, dislipemia, entre otros) 4. Este hecho, sin embargo, no explica en su totalidad el exceso de morbimortalidad cardiovascular 3. En la IRC hay alteraciones metabólicas que pueden incidir en el daño vascular y propiciar fenómenos de aterosclerosis, sustrato de la mayoría de eventos cardiovasculares. El óxido nítrico (ON) ejerce múltiples efectos antiaterogénicos: vasodilatacion, inhibición de agregación plaquetaria, inhibición de la proliferación de la fibra muscular lisa y disminución de la producción de proteína quimiotáctica de monocitos (MCP), entre otros 5-7. La abundancia de ON depende, fundamentalmente, de su síntesis por las diversas isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) y de su destrucción por especies reactivas de oxígeno (ROS) como el anión superóxido (O2-). La combinación O2- y ON produce peroxinitrito (ONOO-), potente agente oxidante que reacciona con residuos de tirosina de las proteínas, produciéndose nitrotirosina que sirve como marcador de la inactivación de ON por ROS 8, 9. En la IRC se han descrito un aumento del estrés oxidativo y alteraciones metabólicas con capacidad de modificar la vía del óxido nítrico, que podrían condicionar disfunción endotelial y favorecer la aterosclerosis que acompaña a la IRC 10, 11. Para investigar la posible repercusión vascular de estos hechos, en el presente estudio se determina la expresión a nivel vascular de nitrotirosina, MCP-1 y óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), se hace un análisis inmuhistoquímico de la MCP-1, y un estudio histomorfométrico de la arteria radial de sujetos con IRC. MATERIAL Y MÉTODOS Se estudiaron 13 enfermos (6 mujeres, 7 hombres), de una edad de 49 ± 4 años, con IRC. Ninguno tenía diabetes mellitus ni otras enfermedades sistémicas Ia causa de la IRC era: glomerulonefritis crónica 7, poliquistosis renal 3, nefropatía vascular 2, pielonefritis crónica 1. Se incluyeron en el estudio enfermos que en el transcurso de los dos últimos meses no recibiesen tratamiento con bloqueantes del sistema renina-angiotensina, calcioantagonistas ni estatinas, y no fumasen durante los dos últimos años. En el momento de realizar la fístula arteriovenosa radiocefálica previa a la inclusión en hemodiáli- sis, se tomaban varias muestras de la arteria radial que eran inmediatamente introducidas y mantenidas en tubos que se metían en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. Como grupo control se estudiaron 16 sujetos sanos, 7 mujeres, 9 hombres, de una edad de 44 ± 2 años, no fumadores, que fueron intervenidos de forma programada de varices en miembros inferiores. En el momento de la operación se tomaban varias muestras de la arteria pudenda, arteria muscular de características similares a la radial, que fueron procesadas y estudiadas exactamente igual que las muestras de los enfermos. Tanto los enfermos como los controles dieron su consentimiento tras informarles de la naturaleza del estudio. Para el estudio histomorfométrico del grosor de la íntima y de la media e inmunohistoquímico de MCP1 se usó un sistema de análisis de imagen por computador (Micro Image semiautomatic, Olympus). Las secciones arteriales teñidas con el anticuerpo eran digitalizadas con un microscopio Bx-60 conectado a una cámara de vídeo color JVC y a un sistema de análisis (image sofware de Olympus). Después de la adquisición de la imagen se asignaba a cada pixel un rango de valor de 0 a 255. Las áreas marcadas en la íntima y la media eran delimitadas, y, tras mejora de la imagen y segmentación para definir un valor umbral, se hacía un análisis automático. Los resultados se expresan como área de inmunotinción y área fraccional íntima-media. Para el estudio de la expresión de la eNOS, nitrotirosina y MCP-I, las muestras se homogeinizaban con un Politron en tampón Tris 50 mM, ph 7,4,1 mM EDTA, I% Triton X-100 con un cóctel de inhibidores de proteasas. El homogeneizado se centrifuga a 15.000 rpm y el sobrenadante se recuperaba. Se determina la concentración de proteínas. Se desnaturaliza con buffer Laemili para electroforesis SDS-PAGE de gradiente 8-16%. Tras separación electroforética se electrotransfieren las proteínas a una membrana de nitrocelulosa para análisis por inmunoblot. La membrana se bloquea con leche descremada, y se incuba con el anticuerpo monoclonal específico de eNOS (BD Biosciences, San José, CA, USA), nitrotirosina (Cell Signaling Technology) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) y MCP-1 (Santa Cruz, CA, USA). Tras lavar la membrana, se incuba con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa. Finalmente, se incuba con un sustrato quimioluminiscente y se expone una película radiográfica o papel de fotografía. Las bandas se escanean y se analizan las densidades ópticas por el programa PCBAS. La determinación de la actividad de la NOS se hizo midiendo la formación de [3H] L-citrulina a partir de [3H]L-arginina, según metodologia previamen157 P. GÓMEZ-FERNÁNDEZ y cols. te descrita 12. Tras centrifugación del homogeneizado, el sobrenadante se incubó con tubos duplicados en presencia de tampón fósfato 50 mM, Cl2Ca 0,2 mM, C12Mg 1 mM, L-arginina 0,05 mM, NADPH 0,1 µM, valina 8 µµ, [3H]L-arginina 9,3 mCi/l. En otros dos tubos a la solución anterior se añadió EGTA para quelar el calcio e inhibir la actividad NOS constitutiva (cNOS), calcio dependiente. En otros dos tubos se añadió a todo lo anterior L-NAME 2 µM con lo que se inhibe al 100% la actividad NOS y permite descartar cualquier activación metabólica de la L-arginina no dependiente de la NOS. Así, mediante los cálculos adecuados se puede diferenciar actividad cNOS e iNOS. Tras la incubación, se adicionaron 900 µl de agua a 0 ºC y 500 µl de resina Dowex50. Una vez precipitada la resina se añadió al sobrenadante líquido de centelleo. La [3H]citrulina se leyó en un contador beta (LK 1410). La actividad NOS obtenida se dividió por la concentración de proteínas del homogeneizado expresándose como pmoles/g­1/minuto­1. Las muestras arteriales se identificaban con un código. Ninguno de los investigadores que realizaban los diferentes estudios (histomorfometría, inmunohistoquímica, western blot, actividad de la NOS) conocían el origen de la muestra. Para el estudio estadístico se usó la prueba de MannWhitney para la comparación de variables cuantitativas entre el grupo de enfermos y el grupo control, y el Chi-cuadrado para las variables cualitativas. Para el análisis de la influencia de alguna variable incontrolada se usó el análisis de la covarianza. La determinación de la relación entre las diversas variables se hizo por análisis de regresión simple. Los resultados se expresan como media ± error estándar (X ± ES). Valores de p < 0,05 se consideraron significativos. RESULTADOS No hubo diferencias en la edad y en la distribución de sexos entre los enfermos y los controles. Obviamente, los niveles de creatinina sérica del grupo con IRC fueron significativamente superiores a los del grupo control (6,5 ± 0,3 vs 0,90 ± 0,03 mg/dl, p < 0,001). Los valores de presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD) fueron más altos en los enfermos (PAS: 147 ± 4 vs 121 ± 3 mmHg, p < 0,001; PAD: 82 ± 2 vs 69 ± 2 mmHg, p < 0,001). En el estudio histológico en una muestra arterial de 1 enfermo con IRC se observó calcificación de la media. En 2 muestras de arteria radial y 2 de arteria pudenda se consideró que existía material insuficiente para el estudio. Tanto el grosor de la íntima y de la media arterial como su cociente fueron mucho más 158 elevados en los enfermos con IRC (íntima: 108 ± 16 vs 14 ± 2,5 µ, p < 0,001; media: 291 ± 19 vs 153 ± 15 µ, p < 0,001; íntima/media: 28 ± 4 vs 8 ± 1%, p < 0,001) (fig. 1). A instancias de uno de los revisores del trabajo, de forma diferida en algunos casos en los que fue posible se determinó, el cociente luz/pared arterial. Este cociente fue significativarnente menor en los enfermos [0,66 ± 0,15 µ (n: 5)] que en los controles (1,24 ± 0,15 µ (n: 7) (p = 0,04). El estudio inmunohistoquímico mostró mayor depósito arterial de MCP-1 en los enfermos que en los controles (8,5 ± 0,8 vs 2,5 ± 0,4 µ2, p 0,001) (fig. 2). La expresión de la proteína MCP-1 (western blot) fue significativamente más elevada en los enfermos (2,0 ± 0,15 vs 0,60 ± 0,12, p < 0,001) (fig. 2). Las arterias de los enfermos con IRC evidenciaron mucha mayor expresión de proteínas con residuos de tirosina nitrosilada (nitrotirosina) que las arterias de sujetos normales (2,10 ± 0,1 vs 0,42 ± 0,1, p < 0,001) (fig. 3). La actividad de la cNOS fue inferior en los enfermos sin alcanzar significación estadística (46 ± 5 vs 59 ± 8 pmol.g.tejido­1.min­1) La actividad iNOS fue prácticamente idéntica (47 ± 7 vs 48 ± 5 pmol.g.tejido­1.min­1). La expresión de la proteína eNOS a nivel arterial fue, sin embargo, más A B Figura 1. DAÑO VASCULAR EN LA IRC A 2,5 C 2 p < 0,001 Unidades 1,5 1 0,5 0 Control IRC B D Figura 2. elevada en los sujetos con IRC (1,73 ± 0,1 vs 0,67 ± 0,1 u, p < 0,001). Se demostró una relación directa entre la expresión (western blot) de MCP-1 y sus depósitos inmunohistoquímicos (r: 0,891, p < 0,0001), y entre los valores de PAS con la expresión de nitrotirosina (r: 0,750, p < 0,0005) y eNOS (r: 0,708, p < 0,0005).Tras el ajuste a los valores de PAS persistieron las diferencias significativas en la expresión de nitrotirosina y de eNOS entre los enfermos y el grupo control. DISCUSIÓN Nuestros resultados demuestran que en los sujetos con IRC avanzada, a nivel de la arteria radial, exis- te un mayor grosor de la íntima y de la media, y un aumento de los depósitos de nitrotirosina, marcador de inactivación de ON por radicales libres, y de la citocina MCP-1. Estos hechos se acompañan de una elevada expresión vascular de eNOS. La actividad de la cNOS vascular, sin embargo, es normal. La necesidad de cirugía programada para la realización de la fístula arteriovenosa e intervención de varices ofrece la oportunidad de tomar muestras de arteria radial y pudenda, en enfermos con IRC y en sujetos sanos, respectivamente. Dado que en la regulación de la estructura vascular intervienen factores hemodinámicas y la existencia de peculiaridades reológicas en cada territorio vascular, es posible que la comparación de estas dos arterias suponga alguna limitación. Sin embargo, las dos son arterias mus159 P. GÓMEZ-FERNÁNDEZ y cols. A 2,5 B 2 p < 0,001 Unidades 1,5 1 0,5 0 Control Figura 3. IRC culares de mediano tamaño y, además, posibilitan el estudio sin los problemas éticos que supondría tomar muestras de arteria radial de sujetos sanos. Por otra parte, la determinación en un subgrupo de sujetos, del cociente luz/pared vascular, parámetro que «normaliza» el tamaño del vaso, demuestra que el grosor de la pared vascular de los enfermos renales está aumentado. Aunque se ha considerado que la arteria radial está exenta de aterosclerosis, motivo por el que se ha usado con frecuencia en la cirugía de revascularización cardíaca, estudios recientes demuestran que los hallazgos histopatológicos de aterosclerosis son más frecuentes a nivel de la arteria radial que de la arteria torácica interna 13. Por otra parte, se ha demostrado por métodos no invasivos que, comparados con un grupo sano, los sujetos con aterosclerosis coronaria, tienen mayores alteraciones estructurales de la arteria radial 14. Estos hechos permiten afirmar que el estudio de la arteria radial puede servir como marcador de las alteraciones biológicas y estructurales vasculares que acompañan a la IRC. La diferencia de las cifras de presión arterial entre los enfermos y controles, y la correlación directa entre valores de la presión arterial y abundancia vascular de nitrotirosina y MCP-1 sugieren la existencia de una relación entre hipertensión arterial y los hallazgos vasculares bioquímicos y estructurales, observados en nuestro estudio. La HTA puede acompañarse de un aumento del estrés oxidativo que, a su vez, induce una elevación de nitrotirosina, citocinas y mayor grosor íntimamedia 15, 16. En otro orden, la disminución de la bioactividad del óxido nítrico reflejada por el au160 mento de la nitrotirosina, podría contribuir a la elevación de la presión arterial en la insuficiencia renal, como se ha demostrado a nivel experimental 17. La persistencia de diferencias significativas en la abundancia de nitrotirosina y MCP-1, entre los enfermos y los controles, tras el ajuste a los valores de presión arterial, sugiere que existen otros factores inherentes a la uremia responsables de estos hechos. En la insuficiencia renal crónica se produce un aumento del estrés oxidativo 11. La mayor cantidad de nitrotirosina vascular en los enfermos estudiados por nosotros, refleja este hecho. El aumento del estrés oxidativo, a su vez, puede contribuir a la producción de citocinas como MCP-1 y a la aterosclerosis precoz de la IRC 18, 19. Estos fenómenos se potencian por la inactivación del óxido nítrico por las ROS, hecho también reflejado por los mayores depósitos de nitrotirosina, lo que promueve un déficit funcional de ON y disfunción endotelial 20. No podemos definir la causa del aumento de la expresión de eNOS en la arteria de los enfermos renales. Las fuerzas de cizallamiento que acompañan a los cambios hemodinámicos secundarios a hipertensión arterial y a la anemia podrían contribuir a este hecho 21, 22. La HTA no parece ser el único argumento ya que la mayor expresión de eNOS persiste tras la corrección estadística a los valores de presión arterial. Por otra parte, en un estudio previo, comprobamos que los sujetos con HTA esencial tienen una disminución de la expresión de la eNOS a nivel arterial 23. En cultivos celulares se ha demostrado que el ON ejerce una retrorregulación negativa sobre la expresión de eNOS a través de un proceso DAÑO VASCULAR EN LA IRC mediado por c-GMP 24. Por tanto, es posible que el déficit funcional de ON secundario a inactivación por ROS o a un defecto funcional de la eNOS desacoplada por estrés oxidativo 25 pueda inducir un aumento compensador de la expresión de eNOS. Frente a una elevada expresión de la eNOS, la actividad de la cNOS (formada por la eNOS y nNOS), aunque más baja, no alcanzó diferencias significativas con el grupo control. Pese a que nuestro ensayo no nos permite discriminar por separado la actividad de eNOS y nNOS, se puede especular que una actividad normal con una expresión elevada reflejan un defecto funcional relativo. En la IRC se acumulan falsos sustratos de NOS como metil-L-arginina asimétrica (ADMA) que reduce la actividad de la NOS 12, 26, y, además, puede existir un déficit de cofactores necesarios para la actividad de la NOS como la tetrahidrobiopterina (TH4) 27. Creemos que ninguno de estos hechos justifican un defecto funcional de la NOS ya que en nuestro ensayo, como se describe en la metodología, se aportan suficientes cantidades de L-arginina y TH4. Es posible que en la IRC existan otro tipo de alteraciones de la fosforilización de la eNOS que pueden reducir su actividad 28. En resumen, en la IRC existen, a nivel de la arteria radial, cambios histológicos preaterosclerosos, y un aumento de los depósitos de nitrotirosina, reflejo de la acción de ROS sobre ON. En el grupo de enfermos con IRC estudiado se objetiva también una elevación de la expresión vascular de la eNOS cuyo mecanismo no está completamente aclarado si bien podría significar un aumento compensador a la disminución de la bioactividad del ON. La presencia de las alteraciones morfológicas y bioquímicas descritas a nivel de una arteria muscular pueden adquirir más intensidad en las arterias elásticas. Así podría justificarse la calificación de la IRC como un estado «vasculopático» 29 y el elevado riesgo cardiovascular de los enfermos con insuficiencia renal crónica 1-3. BIBLIOGRAFÍA 1. Muntner P, He J, Hamin L, Loria C, Whelton PK: Renal Insufficiency and Subsequent Death Resulting from Cardiovascular Disease in the United States. J Am Soc Nephrol 13: 745-753, 2002. 2. 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