14. ANTICUERPOS ANTI-HLA 1/1/04 00:56 Página 62 NEFROLOGÍA. Vol. XXIV. Número Extraordinario (IV). 2004 Anticuerpos anti HLA postrasplante. Un nuevo método de monitorización M. López-Hoyos, G. Fernández-Fresnedo, J. M. Pastor y M. Arias Servicio de Inmunología, Hematología y Hemoterapia y Nefrología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander. INTRODUCCIÓN La nefropatía crónica del aloinjerto es la principal causa de pérdida del injerto renal a largo plazo 1. Se trata de un proceso mediado por el sistema inmunitario en respuesta a numerosos factores, incluidos no inmunológicos 2. Es evidente que en esa reacción inmunitaria juegan un papel fundamental los linfocitos T. No obstante, los anticuerpos (Ac) anti-HLA, que son el único medio de demostrar en la práctica un estado de aloinmunización, están ganando importancia en su papel de mediación de la nefropatía crónica del aloinjerto. De hecho, Terasaki ha sugerido una teoría humoral del trasplante que establece un papel relevante de los Ac anti-HLA en la producción del engrosamiento endotelial de los vasos del injerto que, finalmente, conduce a la pérdida del riñón trasplantado 3. Aún más, los avances metodológicos producidos recientemente en la detección de estos Ac ha abierto una línea de investigación acerca de la utilidad de su presencia, no sólo en el período previo al trasplante renal sino, lo que es más novedoso, después del trasplante 4. En la presente revisión se resumirán diversos datos de la literatura más reciente y se hará un especial hincapié en la experiencia de nuestro grupo en cuanto al papel de los Ac anti-HLA en el rechazo agudo y la importancia que pueden tener en la monitorización post-trasplante renal. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE AC ANTI-HLA Ensayo de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento (CDC) El CDC, ampliamente conocido y clásicamente utilizado en los laboratorios de histocompatibilidad, emplea un panel de linfocitos viables (alrededor de 60) con un fenotipo HLA conocido representativo de Correspondencia: Dr. Marcos López Hoyos Servicio Inmunología Hospital Universitario Marqués de Valdecilla 39008 Santander E-mail: inmlhm@humv.es la población general, que se añaden en cada uno de los pocillos de una placa de Terasaki 5. Esta prueba no sólo determina la especificidad de los Ac sino también el grado de reacción, lo que se conoce como %PRA (porcentaje de Ac reactivos contra el panel), que representa el número de células del panel que reaccionan con el suero 6. Citometría de flujo (CMF) La CMF detecta la presencia de Ac anti-HLA mediante el uso de Ac frente a inmunoglobulinas humanas conjugados a fluorocromos, sin necesidad de que el complemento se fije. El empleo de fluorescencia es lo que hace esta técnica mucho más sensible que la CDC clásica 4. En un principio este método utilizaba, como en la CDC, un panel de linfocitos T (clase I) y B (clase II). Sin embargo, de este modo pueden detectarse autoanticuerpos dirigidos frente a otros antígenos distintos del HLA presente en esos linfocitos 7. Además, esta técnica depende de la disponibilidad de los linfocitos con las especificidades HLA deseadas. Para evitarlo, se ha ideado un sistema con micropartículas que llevan pegadas en su superficie moléculas de HLA-I y HLA-II 8. De este modo, se puede realizar la combinación de antígenos HLA que se desee y determinar la especificidad en un solo tubo. En ese tubo se incubarían las micropartículas con el suero a estudio y tras los lavados pertinentes se añadiría un Ac anti-IgG humana conjugado a fluorocromos. La presencia de Ac se objetiva en el citómetro de flujo al incidir sobre la muestra un haz de láser, el cual excita el fluorocromo que va conjugado al Ac y emite luz a una determinada longitud de onda. Esta señal luminosa se capta por unos detectores y un complejo sistema informático es capaz de transformar el mensaje luminoso al lenguaje informático, el cual se puede interpretar mediante el empleo de un software adecuado. En principio, se puede emplear cualquier citómetro de flujo disponible en el mercado. Además, muy recientemente se ha adaptado un sistema de CMF de cribado múltiple que consiste en un panel de micropartículas coloreadas cubiertas con antígenos HLA-I y ­II. Se trata de la tecnología de- 62 14. ANTICUERPOS ANTI-HLA 1/1/04 00:56 Página 63 ANTICUERPOS ANTI HLA POSTRASPLANTE nominada Luminex®, mediante la que se pueden realizar hasta 100 combinaciones de antígenos en una sola suspensión y un mismo ensayo de forma semiautomática 9. Una gran ventaja de la CMF es que permite cuantificar objetivamente la concentración de los Ac antiHLA mediante la intensidad media de fluorescencia que alcanza el suero (mean fluorescence intensity, MFI). En una monitorización post-trasplante, no sólo la presencia de Ac, sino las variaciones de la MFI (concentración del Ac) podrían servir teóricamente de marcador de la evolución del paciente y su injerto 10. Otra forma de medir la intensidad de la reacción es determinando el porcentaje de PRA a partir del porcentaje de células positivas para los Ac anti-HLA de clase I o de clase II. El último adelanto metodológico de la CMF, que ofrece un abanico muy amplio e ilimitado de antígenos HLA, es el empleo de antígenos únicos recombinantes 11. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) En el ELISA las moléculas de HLA solubles se adhieren al fondo de los pocillos de una placa, en lugar de a las micropartículas, mediante distintos procedimientos. Estos antígenos pueden proceder de plaquetas o de líneas celulares transformadas con distintos HLA. Al igual que en las otras técnicas de screening de Ac anti-HLA, la mezcla de antígenos debe ser representativa de la población general 12. El suero se incuba con el HLA pegado a la placa. En caso de que existan Ac específicos de moléculas HLA, estos se unirán a ellas y quedarán fijados en la placa. En caso contrario, todas las inmunoglobulinas se eliminarán con los lavados. En un paso posterior la presencia de los Ac fijados se determinará tras incubación con un Ac dirigido frente a IgG humana conjugado a un enzima. En caso de que haya Ac anti-HLA ese enzima producirá una reacción colorimétrica (y no fluorescencia como la CMF) al actuar sobre su sustrato en el último paso de la técnica. Esa reacción se cuantifica en un espectofotómetro. Mediante ELISA se detectan todos los Ac antiHLA I, tanto fijadores de complemento como los no fijadores. Aunque no se suelen determinar en la rutina diaria, es posible adaptar la técnica para medir Ac anti-HLA de clase IgM. En un principio, la técnica se diseñó para determinar sólo Ac de clase I aunque actualmente también se ha adaptado para detectar los de clase II 13. Una vez que se ha detectado la presencia de Ac anti-HLA (clase I ó II), la especificidad frente a la que se dirigen esos Ac se puede determinar también mediante ELISA. La metodología es similar a la descrita para el cribado. La diferencia radica en que en el fondo del pocillo no se adhiere una mezcla de Ag HLA de clase I ó II 4. En este caso cada pocillo tiene pegado unas pocas moléculas HLA bien caracterizadas y que no tienen reacción cruzada entre ellas 4. Los datos obtenidos en unidades de densidad óptica se transforman en %PRA con un software específico. Aunque todavía no está disponible, es muy probable que los antígenos HLA recombinantes también se puedan adaptar al ELISA, al igual que ocurre con la CMF. Ventajas e inconvenientes (tabla I) A pesar de que es posible realizar el CDC con un aparataje disponible en cualquier laboratorio, las nuevas técnicas que se están introduciendo en la práctica clínica consiguen una mayor sensibilidad. Además, permiten determinar la especificidad de los Ac anti-HLA con más objetividad y facilidad. Por otro lado, la manera de cuantificar la presencia de estos Ac (unidades de densidad óptica en el ELISA o MFI en la CMF) permite obtener una información cuantitativa y objetiva acerca de la intensidad de la reacción, la cual es posible que se pueda emplear en el futuro como dato para la monitorización inmunológica de los trasplantes 14. Tanto el ELISA como la CMF (cuando se usan micropartículas) no precisan del empleo de linfocitos viables ni de actividad de complemento. Los datos de mayor peso en contra de estas técnicas por el momento son su coste elevado y la escasez de estudios mostrando su utilidad clínica 14. Finalmente, el porcentaje de pacientes que desarrollan Ac anti-HLA después del trasplante no varía excesivamente según se emplee la técnica de ELISA o la CMF, aunque esta última parece tener una mayor sensibilidad 4. PRODUCCIÓN DE AC ANTI-HLA POST-TRASPLANTE Y EVOLUCIÓN DEL INJERTO Y DEL PACIENTE Independientemente de la técnica empleada, la incidencia de rechazo agudo en caso de positividad de Ac anti-HLA post-trasplante renal con cualquiera de las tres técnicas es 2-10 veces mayor que si no se detectan. De igual modo, la ausencia de producción de Ac anti-HLA parece acompañarse de un menor porcentaje de rechazo crónico y una mayor supervivencia del injerto 3, 4. 63 14. ANTICUERPOS ANTI-HLA 1/1/04 00:56 Página 64 M. LÓPEZ-HOYOS y cols. Tabla I. Ventajas y desventajas de las tres técnicas utilizadas para detectar Ac anti-HLA en suero Ventajas Microlinfocitotoxicidad Equipamiento sencillo Barato Posibilidad prueba cruzada Desventajas Detecta otros anticuerpos Precisa experiencia Subjetividad Precisa células viables Necesario complemento Equipamiento complejo Caro Precisa experiencia Detecta autoantígenos (con células) Citometría de flujo Detecta Ac anti-HLA Objetividad Intensidad de reacción No autoantígenos (con micropartículas) No precisa complemento Ac anti-HLA-I y ­II con un solo tubo Posibilidad prueba cruzada Automatismo (Luminex®) Detecta Ac anti-HLA Objetividad No precisa células No precisa complemento Automatismo Muchas reacciones en una placa ELISA Equipamiento complejo Precio medio entre CDC y CMF Duda con valores «borderline» No posibilidad prueba cruzada Curiosamente, los Ac anti-HLA determinados por ELISA, tanto relacionados con el donante como no, se han asociado a una mayor frecuencia de rechazo. Sin embargo, si los Ac se detectan por CDC, únicamente aquellos relacionados con el donante se asocian con rechazo agudo y crónico 4. Por lo tanto, queda por determinar si la mayor sensibilidad del ELISA para detectar los Ac no específicos del donante tiene relevancia clínica o es un problema técnico. Ac anti-HLA y rechazo agudo Uno de los primeros trabajos aplicando las nuevas metodologías 15 determinó la relación existente entre la evolución clínica del injerto y los cambios en cuanto a la presencia o no de Ac anti-HLA en un suero recogido en los primeros seis meses después del trasplante respecto al suero de la prueba cruzada previa al trasplante. Los pacientes se dividieron en 4 grupos según la presencia o no de Ac anti-HLA en esos sueros (pre-trasplante/post-trasplante): -/-, -/+, +/- y +/+. El análisis de Ac se realizó mediante ELISA, CDC y CMF. El grupo +/+ tuvo un mayor riesgo de rechazo que el grupo -/- con independencia de la técnica empleada. En cambio, el grupo -/+ presentó un mayor riesgo de rechazo cuando los Ac se estudiaron mediante CDC o CMF pero no con ELISA. Además, la concordancia entre métodos fue relativamente baja para el ELISA con las 64 otras dos. Por ello, los autores consideraban el ELISA y la CDC como técnicas complementarias en el cribado de Ac anti-HLA 15. En ese mismo trabajo la presencia de Ac anti-HLA-II casi siempre coincidió con la de Ac anti-HLA-I. Muy pocos sueros fueron positivos sólo para HLA-II y, en tal caso, sólo se detectaron con el ELISA, pero no con la CMF. Además, los Ac anti-HLA-II no se asociaron a un mayor riesgo de rechazo por lo que se les concedió una importancia clínica mínima 15. En nuestro centro hemos estudiado los cambios producidos en los niveles de Ac anti-HLA-I y ­II específicos del donante después del trasplante renal en comparación con la situación previa al trasplante, mediante ELISA en 71 pacientes no hipersensibilizados 16. Además, quisimos analizar si la producción de novo de estos Ac guardaba alguna relación con las lesiones producidas en el injerto en términos de rechazo y de evolución. Los pacientes incluidos en el estudio se dividieron en dos grupos: (A) aquellos pacientes que produjeron Ac anti-HLA I y/o II específicos del donante o que sufrían un aumento de reactividad > 40% respecto a la muestra pre-trasplante y (B) aquellos sujetos en los que no se comprobó ni una producción de nuevos Ac específicos del donante ni un aumento de reactividad. 16 de los 71 trasplantados estudiados desarrollaron rechazo agudo, con una mayor proporción en el grupo Ac anti-HLA específicos del donante respecto al grupo sin ellos 16. Estos datos reflejan una sensibilidad del 63% de la detección 14. ANTICUERPOS ANTI-HLA 1/1/04 00:56 Página 65 ANTICUERPOS ANTI HLA POSTRASPLANTE de Ac anti-HLA post-trasplante renal para el screening de rechazo agudo, alcanzando una especificidad muy elevada de casi el 95%. De igual forma, mucho más elevado fue el porcentaje de pacientes del grupo A que perdió el injerto y en todos los casos, excepto uno, debido a rechazo agudo. En el grupo B, sólo en 1 de los 9 casos en que se perdió el injerto se debió a rechazo agudo. En el grupo A, 8 pacientes sufrieron rechazo agudo, predominando los de tipo vascular de grado II y III de la clasificación de Banff 16. Además, 7 de esos 8 pacientes desarrollaron Ac anti-HLA-I, lo cual demuestra una clara relación de los Ac de clase I con los episodios de rechazo agudo. El análisis del efecto de los Ac anti-HLA-II sobre la evolución del injerto no rindió ningún resultado significativo, básicamente debido a la producción concomitante de Ac de clase I y II. Un dato llamativo de nuestro trabajo, y muchas veces no considerado, fue la elevada frecuencia de Ac anti-HLA DQ (incluso más que DR). Este hecho remarca la importancia de considerar los mismatches de DQ, además de los DR. Nuestro hallazgo ha sido también puesto en evidencia recientemente por otro trabajo de Worthington y cols. 17. Otra similitud entre nuestro estudio y el de Worthington y cols. fue la frecuencia considerable de detección de Ac anti-HLA después del rechazo agudo. Una explicación factible puede ser la adsorción de los aloanticuerpos específicos del donante al injerto previamente y durante el rechazo 13. Se asume que durante el rechazo los Ac dirigidos frente al HLA del donante se adsorben al injerto y sólo se detectarían circulando en la sangre aquellos Ac libres, después de saturar la unión al injerto. De hecho, muy recientemente se ha demostrado la fijación de los Ac anti-HLA específicos del donantes al injerto rechazado, gracias a la detección de esos Ac en muestras eluidas de biopsias de riñones rechazados 18. Como consecuencia del estudio descrito y de la experiencia de nuestro grupo, proponemos un plan de monitorización en el período post-trasplante renal consistente en la detección de Ac anti-HLA bien mediante ELISA y/o CMF de forma semanal durante el primer mes post-trasplante. En los siguientes dos meses, la monitorización se haría cada 2 semanas (fig. 1). Después de ese tiempo, el seguimiento y estudio de Ac anti-HLA específicos del donantes se realizaría de acuerdo a la clínica del paciente 16. En resumen, existe una serie de consideraciones que se deben tener en cuenta a la hora de relacionar la detección de Ac anti-HLA en el período posttrasplante renal con el desarrollo de un rechazo agudo 3. Estas son: TX 1 mes 2 mes 3 mes Semanalmente Quincenalmente Anual (Ref. 3) Fig. 1.--Propuesta de protocolo de monitorización de Ac antiHLA después del trasplante renal. En los primeros tres meses después del trasplante renal la monitorización sería más intensiva para prevenir el rechazo agudo, mientras que posteriormente se realizaría anualmente, en busca de una posible evolución hacia rechazo crónico. · Dependencia de la especificidad de los anticuerpos (específicos del donante o no; anti-HLA-I o ­II). · Dependencia de la severidad y tratamiento del rechazo agudo. · Dependencia del isotipo IgG o IgM. · Debate acerca de la sensibilidad y especificidad de la técnica empleada para detectar estos Ac. Queda además pendiente de clarificarse el papel de estos Ac en el rechazo. Con las diversas mejoras metodológicas se ha llegado a detectar Ac anti-HLA después del trasplante en el 96% de los casos. Si realmente tienen algún papel patogénico, deberían detectarse en un porcentaje similar antes de los rechazos 3, 4. Ac anti-HLA y rechazo crónico Hasta la fecha no se había considerado la importancia que pudieran tener los Ac anti-HLA en el desencadenamiento de un rechazo crónico. Sin embargo, recientemente han aparecido dos trabajos que hacen hincapié en ello. Un artículo de la Universidad de Tainan (Taiwan), con la colaboración de Terasaki, pone de manifiesto en el 100% de los casos la formación de Ac antiHLA previos al desarrollo de rechazo crónico demostrado mediante biopsia 19. Por el contrario, sólo el 27% de los pacientes que mantuvieron una función renal estable produjeron estos Ac después del trasplante. Aunque no se establece con claridad, parece intuirse de dicho trabajo que la asociación establecida entre la producción de Ac post-trasplante y el rechazo crónico fue independiente de otros factores inmunológicos (por ejemplo, rechazos agudos previos) y no-inmunológicos implicados en la nefropatía crónica del injerto. La importancia de este trabajo radica en ser el primero que muestra una asociación entre la producción de Ac anti-HLA des65 14. ANTICUERPOS ANTI-HLA 1/1/04 00:56 Página 66 M. LÓPEZ-HOYOS y cols. pués del trasplante y el desarrollo de rechazo crónico. Además, muestran la cronología de detección de Ac anti-HLA positivos en 14 pacientes sin Ac antiHLA pre-trasplante. Dado que los Ac aparecen al menos un año antes en la gran mayoría de los paciente, Lee y cols. defienden la idea de emplear la detección de Ac anti-HLA de forma anual para monitorizar a los receptores de un trasplante renal y predecir así un rechazo crónico 19. Según los autores 19 y Terasaki 3, el daño producido por los Ac necesita de un tiempo variable y, en ocasiones, una cantidad de tiempo considerable hasta que su acción se manifiesta. En la actualidad está en marcha un estudio prospectivo internacional con 1.629 pacientes que pretende confirmar los hallazgos preliminares de Lee y cols 3. El hallazgo anterior también parece corroborarse en el trabajo de Wortinghton y cols. comentado anteriormente, en el sentido de que los sujetos que desarrollaron Ac anti-HLA-I específicos del donante tuvieron fallo del injerto mucho antes que aquellos que sólo produjeron Ac anti-HLA de clase II 17. No obstante, en este trabajo no se correlacionaron estos hallazgos con la histopatología de los rechazos. CONCLUSIÓN Las facilidades técnicas y la mejoría en la sensibilidad introducidas por el ELISA y la CMF en la detección de Ac anti-HLA, hacen plantearse el empleo de estos Ac como herramientas para la monitorización de los receptores de un trasplante renal. Es muy probable que próximamente aparezcan más trabajos confirmando los datos obtenidos hasta la fecha y que se han resumido aquí. Este tipo de monitorización se convertirá con toda probabilidad en una práctica rutinaria en la clínica. Si la teoría humoral del trasplante se consolida, es muy probable que los tratamientos inmunosupresores se dirijan más hacia el brazo humoral de la respuesta inmunitaria que hacia el celular. BIBLIOGRAFÍA 1. Halloran PF, Melk A, Barth C: Rethinking chronic allograft nephropathy: the concept of accelerated senescence. J Am Soc Nephrol 10: 167-181, 1999. 2. Merino R, Fernández-Fresnedo G, Arias M: Rechazo de trasplantes. Medicine 8: 1342-1349, 2002. 3. Terasaki PI: Humoral theory of transplantation. Am J Transplant 3: 665-673, 2003. 4. McKenna RM, Takemoto SK, Terasaki PI: Anti-HLA antibodies after solid organ transplantation. Transplantation 69: 319-326, 2000. 5. Ruiz JC, Arias M, Pastor JM: Manual de Nefrología. Harcourt Eds: 707-724, Madrid, 2002. 6. Terasaki PI, Kreisler M, Mickey RM: Presensitizatin and kidney trasplant failures. Postgrad Med J 47: 89-100, 1971. 7. 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