NEFROLOGÍA. Vol. XXI. Suplemento 3. 2001 Avances moleculares y terapéuticos en la diabetes: perspectivas de futuro E. Salido, D. Hernández y A. Torres Unidad de Investigación y Servicio de Nefrología. Hospital Universitario de Canarias. La Laguna, Tenerife. DEFINICIÓN MOLECULAR DE LA PREDISPOSICIÓN HEREDITARIA A LA DIABETES MELLITUS La asociación familiar de la diabetes mellitus (DM) se conoce desde hace tiempo, y tanto la tipo 1 como la tipo 2, siendo enfermedades multifactoriales de determinismo complejo, presentan un componente hereditario importante, al que hay que sumar contribuciones ambientales necesarias para el desarrollo de la enfermedad. El peso específico del componente hereditario se suele estimar con estudios de concordancia entre gemelos univitelinos, que demuestran que la contribución hereditaria es más importante en la DM tipo 2 (concordancia 70-90%) que en la tipo 1 (concordancia 25-50%). Esto se traduce en que un familiar de primer grado de un paciente con DM tipo 1 tiene un riesgo de padecer la enfermedad del 5-10% (comparado con un 0,4% de riesgo para la población general), mientras que para la DM tipo 2 es de un 30-40%. Se han seguido dos estrategias en la búsqueda de los genes responsables de la predisposición hereditaria a las formas habituales de DM: 1. Estudio de genes candidatos, genes que codifican proteínas que juegan un papel conocido en la fisiopatología de la enfermedad. Se trata de estudios de casos y controles donde se busca una posible asociación (también conocidos como estudios de asociación) entre variantes alélicas de genes seleccionados a priori y el desarrollo de la enfermedad. 2. Rastreos del genoma (genome-wide scanning), donde se busca en parejas de hermanos la presencia de ligamiento genético para heredar determinadas regiones del genoma, definidas por marcadores polimórficos, y el desarrollo de la enfermedad. La contribución de cada gen identificado en la patogenia de la enfermedad se cuantifica con el parámetro estadístico s, que refleja el grado de asociación familiar para cada locus. El efecto de más de un gen sobre el desarrollo de la enfermedad se puede ajustar a dos modelos: 1. Epistasis: la presencia de una variante genética en un locus afecta la contribución del otro locus, generalmente porque ambos genes forman parte de la misma vía patogénica; 2. Heterogeneidad Genética: varios genes pueden, de manera independiente, contribuir al desarrollo de la enfermedad. Debido a que la contribución genética es más importante en la diabetes tipo 2 que en la tipo 1, nos centraremos en ella. GENES DE LA DM TIPO 2 La DM tipo 2 es la enfermedad metabólica más frecuente, y afecta a más de 250 millones de personas en el mundo. Es además la primera causa de ceguera, insuficiencia renal y enfermedad vascular periférica en el adulto. La DM tipo 2 es producida por dos defectos fisiológicos: a) Resistencia Periférica a la Insulina (RPI), y b) Defecto Secretor de Insulina por parte de la célula . Aunque existe mucha controversia sobre cual de estos defectos es el «primario», existe bastante consenso en los siguientes aspectos 1: a) La presencia de RPI predice el desarrollo futuro de DM tipo 2; b) En las etapas precoces de la enfermedad, la célula secreta suficiente insulina para compensar la RPI y mantener los niveles de glucosa dentro de la normalidad, y sólo cuando la función secretora comienza a claudicar aparece la hiperglicemia; y c) Factores genéticos determinan el riesgo de padecer la enfermedad. El determinismo genético de la DM tipo 2 es notablemente complejo: han de heredarse simultáneamente varios alelos de riesgo de un conjunto de genes implicados en el control de la RPI y la función secretora de la célula . Por su relación con la RPI, los genes que intervienen en fenómenos tan variados como el control de la ingesta, la composición de la masa corporal y la obesidad también juegan un papel importante en esta forma de DM. Es más, los factores ambientales que contribuyen al desarrollo de DM tipo 2 aún no han sido identificados claramente. Un hecho que complica el análisis genético de la predisposición a la DM tipo 2 es que diferentes subgrupos de genes de susceptibilidad pueden estar implicados en distintas poblaciones e incluso en diversas familias dentro de la misma población. A diferencia de la DM tipo 1, donde Correspondencia: A. Torres Unidad de Investigación Hospital Universitario de Canarias Ofra, s/n. 38320 La Laguna Tenerife 112 PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LA DIABETES un locus (región HLA) aporta un porcentaje importante de la susceptibilidad genética, en la DM tipo 2 parece que no hay un locus que justifique de por sí más del 10% del riesgo genético. Además, al tratarse de una enfermedad de presentación en el adulto, es difícil contar con familias amplias, que incluyan padres, para el análisis genético. A pesar de estas limitaciones, se ha avanzado notablemente en la definición de los factores genéticos de la DM tipo 2. Como en el caso de la DM tipo 1, se ha utilizado tanto la estrategia del gen candidato como los rastreos del genoma mediante análisis de ligamiento. Además, las investigaciones a nivel molecular en variantes infrecuentes de DM que presentan un patrón de herencia monogénico (en total responsables de menos del 5% de los casos de DM) han resultado bastante informativas. La estrategia del gen candidato ha sido ampliamente utilizada en la búsqueda de genes responsables de la DM tipo 2. Los conocimientos fisiopatológicos de la enfermedad permiten proponer una serie de genes implicados en numerosas funciones: sensor de la glucosa en la célula , síntesis y secreción de insulina, acción de la insulina, metabolismo de la glucosa en tejidos periféricos, regulación del apetito y del peso corporal, y la producción de inhibidores de la acción de la insulina (tabla I). Asimismo, también se ha demostrado una asociación de determinados polimorfismos en diferentes genes con la DM tipo 2 (tabla II). El principal problema con estas asociaciones ha sido que después de la descripción original, otros estudios no fueron capaces de replicar los hallazgos en diversas poblaciones. Además, los estudios de familias en búsqueda de ligamiento con estos loci han resultado esencialmente negativos. Una excepción es IRS-1 (sustrato 1 del receptor de la insulina), donde se ha detectado ligamiento con la edad de presentación de la DM tipo 2. Otro elemento importante a la hora de dar relevancia a los genes candidatos propuestos es que se pueda reproducir in vitro alguna característica diferencial de los alelos en cuestión. Para el IRS-1, el cambio Gly972Arg se ha demostrado asociado a una peor progresión de la señal emitida por el receptor de insulina una vez estimulado por insulina 2. La estrategia de búsqueda de genes de la DM tipo 2 mediante rastreo del genoma en busca de ligamiento ha rendido varias regiones de interés, en general diferentes según las poblaciones analizadas. Un resumen de estos hallazgos ha sido publicado recientemente 3. GENES INVOLUCRADOS EN LA SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA Y DIABETES TIPO 2 Como se comentó más arriba, la RPI es uno de los trastornos básicos en la DM tipo 2, por lo que se ha prestado gran atención en los últimos años a los mecanismos celulares y moleculares implicados en la acción de la insulina. La insulina es el principal regulador del metabolismo energético. Cuando la glucosa y otros nutrientes son absorbidos del tracto gastrointestinal, se induce la liberación de insulina. Ésta activa el transporte de glucosa al tejido muscular y adiposo, promoviendo la síntesis y depósito de glucógeno y triglicéridos, respectivamente. En el hígado, la insulina promueve la síntesis de glucógeno y disminuye la liberación de glucosa a través de la inhibición de la glucogenolisis y de la gluconeogénesis. Finalmente, la insulina inhibe la lipolisis en el tejido adiposo, la producción de aminoácidos en el músculo, y la cetogénesis en el hígado. En situaciones de ayuno prolongado, los niveles bajos de insulina estimulan la movilización de triglicéridos del tejido adiposo generándose ácidos grasos libres (AGL), de glucosa en el hígado a partir de la glucogenolisis y gluconeogénesis, y aminoácidos en el músculo los cuales pueden ser utilizados por el hígado en la gluconeogénesis. Como el músculo no dispone de glucosa 6-fosfatasa, la glucogenolisis del músculo no provee glucosa en las situaciones de ayuno. El receptor de insulina (IR) es una tirosina kinasa que añade grupos fosfato a dos sustratos proteicos del IR, el IRS-1 y el IRS-2, localizados justo debajo de la membrana cellular (fig. 1). Una vez fosforiladas, estas dos proteínas se unen a varias moléculas efectoras; una vía efectora incluye la activación de la cascada ras/MAP kinasa que, aunque no es necesaria para activar el transporte de glucosa, juega un papel importante en la acción mitogénica de la insulina (fig. 1). La otra vía efectora activa la enzima fosfatidilinositol 3-kinasa (PI 3-kinasa) (fig. 1). La PI 3-kinasa fosforila a su vez varias proteínas siendo una de ellas el Glucotransportador GLUT 4. Tras su activación, GLUT 4 emigra hasta la membrana celular donde realiza el transporte activo de glucosa (fig. 1) 4. Ratones KO para moléculas implicadas en la señalización de la insulina Esta tecnología permite disponer de ratones a los que se les ha suprimido las dos copias (homocigotos nulos) o sólo una (heterocigotos nulos) de un determinado gen involucrado en la cascada de señalización de la insulina. El fenotipo resultante debe reflejar la función in vivo del gen deleccionado. La introducción del sistema Cre/loxP permite generar ratones con déficit genéticos tejido específicos, expandiendo aún más las posibilidades de esta aproximación al estudio de la DM tipo 2 5. a) Ratones KO para el IR5. Los ratones homocigotos nulos (IR-/-) desarrollan una forma severa de DM con cetoacidosis y elevación de los niveles de 113 E. SALIDO y cols. Tabla I. Genes candidatos en la diabetes tipo 2 Genes de la producción de insulina Reguladores del desarrollo cel. cél. HNF-1 HNF-4 IPF-1 (IDX1) Reguladores de transcripción insulina Isl-1 CDX3 Reguladores de la secreción insulina Subunid. canal K (Kir6.2) Canal K KCNJ3 Canal K KCNJ7 Receptor sulfonilurea Glucagon Receptor glucagon Receptor del peptido glucagon-like Recept. polipéptido inhibidor gástrico Proteína reguladora de glucokinasa Amilina Procesamiento de la insulina Convertasa de prohormonas 2 Metabolismo de la glucosa en cél. Glicerofosfato dehidrog.mitoc. GPD2 Piruvato kinasa (PKM) Transportador de glucosa GLUT2 Hexokinasa 1 (HK1) Genes de la acción de la insulina Sustrato del receptor de insulina IRS1 Fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K) Glucogenosintasa (GYS1) Inhibidor 2 de proteinfosfatasa tipo 1 (PPP1R2) Protein serin-treonin fosfatasa 1 (PPP1CB) Transportador de glucosa 4 (GLUT4) Hexokinasa II Fructosa bifosfatasa Fosfofructosa kinasa hepática Fosfoenolpiruvato carboxikinasa Piruvato kinasa (PKL) Genes de la ingesta / adiposidad Leptina (ob) Tubby (TUB) Receptor B colecistokinina Genes de inhibidores de acción de la insulina Hormona crecimiento Proteína ras-relacionada RAD1 TNF TNF Genes del metabolismo lipídico Proteína unión ácidos grasos 2 (FABP2) Lipasa sensible a hormonas Lipoprotein lipasa Triglicérido lipasa hepática Receptor de VLDL Apolipoproteina CII Apolipoproteina A2 Spolipoproteina B Proteína de transferencia de esteres de colesterol Ligamiento a algunos fenotipos intermedios No asociación No ligamiento No asociación No ligamiento No asociación. No ligamiento Ligamiento débil No ligamiento No ligamiento Ligamiento débil Asociación microsatélite a DMt2. No ligamiento No ligamiento No ligamiento No ligamiento No ligamiento Tendencia a ligamiento Asociación entre polimorfismo cambio Aa y DMt2. Controversia estudios de ligamiento Asociación controvertida (en homocigosis) Asociación polimorfismo ­ DMt2. No ligamiento No asociación No ligamiento No asociación. No ligamiento Asociación polimorfismo en algunos DMt2. No ligamiento No ligamiento No ligamiento Tendencia a ligamiento No ligamiento MODY-3. Estudios DMt2 en Finlandia. MODY1. No observada en DMt2. No ligamiento MODY4. Polimorfismo no asociado a DMt2. No ligamiento No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento Asociación entre polimorfismo silente y DMt2. No ligamiento. No ligamiento Asociación entre polimorfismo cambio Aa y DMt2 Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento Asociación entre polimorfismo cambio Aa y DMt2 Asociación entre microsatélite y DMt2. No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento No ligamiento Polimorfismos no asociados a DMt2. No ligamiento No ligamiento 114 PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LA DIABETES Tabla II. Polimorfismos asociados a la diabetes tipo 2 Gen PPARG IRS1 INS INSR FABP2 TNF ABCC8 (SUR) ADRB2 ADRB3 KCNJ11 PON2 GYS1 GCGR IAPP polimorfismo Pro12Ala Gly972Arg -23A/T Val985Met Ala54Thr -238A/G C/T exon22 Gln27Glu Trp64Arg Glu23Lys Ala148Gly Met416Val Gly40Ser Ser20Gly referencia Nat Genet 20:284, 1998 J Clin Endocrinol Metab 81:1657, 1996 Diabetes 49:126, 2000 J Clin Endocrinol Metab 84:1002, 1999 J Clin Invest 95:1281, 1995 Diabetologia 41:430, 1998 Diabetes 45:825, 1996 Diabetologia 42:98, 1999 N Engl J Med 333:348, 1995 Diabetologia 41:1511, 1998 J Clin Endocrinol Metab 82:3373, 1997 Diabetologia 40:947, 1997 Nat Genet 9:299, 1995 Diabetes 45:1279, 1996 Fig. 1.--Esquema simplificado de la cadena de señalización intracelular de la insulina. La unión de la insulina a su receptor en la membrana celular produce la fosforilación de los sustratos proteicos de dicho receptor (IRS-1 e IRS-2). Una vez fosforiladas, estas proteínas se unen a otras moléculas efectoras continuando la señalización intracelular en dos direcciones principales: 1) la activación de la cascada ras/MAPKinasa, la cual juega un importante papel en la acción mitogénica de la insulina; y 2) activando la enzima fosfatidilinositol 3-kinasa (PI 3-kinasa), que interviene a su vez en la fosforilación y translocacion del glucotransportador GLUT-4, el cual emigrará hasta la membrana celular para facilitar el transporte activo de glucosa hacia el interior de la célula. Finalmente, la PI 3-kinasa intervendrá también en la activación de la glucógeno sintetasa a través de la cascada de la S6-kinasa. Estimulación del transporte de glucosa Ejercicio GLUT-4 Receptor insulina INSULINA Tirosin-fosforilación traslocación PI-3K IRS ADP ATP IRKT Complejo RAS S6 Kinasa Vesículas GLUT-4 Transcripción genes Glucógeno sintetasa Glucosa6-P Glucógeno triglicéridos y AGL; estas alteraciones llevan a la muerte de estos animales hacia la primera semana de vida. Los heterocigotos nulos (IR+/-) mantienen unos niveles de insulina normales y su glucemia tras una sobrecarga intraperitoneal de glucosa también se mantiene normal. Algunos autores han detectado una elevación de los niveles de insulina a los 4-6 meses de vida, y dependiendo del trasfondo genético de los ratones, puede aparecer diabetes franca en aproximadamente un 10% de los animales. b) Ratones KO para IR a nivel muscular 6. Estos ratones muestran una reducción > 95% de la expresión del IR a nivel muscular de manera específica. Estos animales desarrollan un síndrome metabólico caracterizado por exceso de tejido adiposo y elevación de los triglicéridos y AGL; sin embargo, tanto los niveles de glucosa e insulina como el test de tolerancia a la glucosa son normales. Estos hallazgos sugieren que la RPI a nivel muscular puede contribuir a la alteración del metabolismo lipídico en la DM tipo 2, pero hace falta que esta alteración se manifieste en otros tejidos para que se afecte el metabolismo de la glucosa. c) Ratones KO para IR a nivel de la célula 5. Estos animales muestran una pérdida selectiva de la secreción de insulina en respuesta a la glucosa, y desarrollan un deterioro progresivo de la tolerancia a la glucosa. La demostración de que en el proceso de secreción de la insulina se promueve la transcripción de su propio gen a través de una activación de IR, IRS2, y PI 3-kinasa, justifican este hallazgo. En suma, un defecto en la señalización de insulina a nivel de la célula pancreática puede contribuir al defecto secretor observado en la DM tipo 2. d) Ratones KO para IR a nivel del hígado 6. Estos animales desarrollan una RPI severa junto con intolerancia a la glucosa. Sin embargo, a los cuatro meses de edad la hiperglicemia en ayunas desapa115 E. SALIDO y cols. rece. Por tanto, la RPI aislada a nivel hepático puede producir defectos en la homeostasis de la glucosa pero que no son suficientes para inducir diabetes. e) Ratones KO para IRS-15. Los ratones IRS-1 -/desarrollan RPI a nivel de músculo y tejido adiposo exclusivamente. A nivel hepático IRS-2 es usado como sustrato alternativo, de forma que la señalización y efectos de la insulina a este nivel se mantienen intactos. Estos animales desarrollan un síndrome X, es decir, hipertensión, exceso de grasa, e hipertrigliceridemia. Sin embargo, no desarrollan diabetes franca puesto que existe una hiperplasia de células pancreáticas que mantiene una secreción adecuada de insulina. Esto refuerza la hipótesis de que para que se produzca diabetes tipo 2 no es suficiente con que exista una RPI sino que debe añadirse un segundo defecto, la merma en la secreción de insulina. e) Ratones KO para IRS-2 5. El fenotipo de estos ratones se caracteriza por una intolerancia a la glucosa marcada y progresiva. La RPI se centra a nivel hepático, manteniéndose normal el efecto de la insulina a nivel del músculo y del adipocito. Es importante resaltar que estos ratones, al contrario de lo que ocurre con los IRS-1 -/-, no muestran una hiperplasia compensadora de células pancreáticas sino que su número se reduce en un 17%. Por tanto, una mutación simple puede inducir tanto una RPI como una deficiencia de la célula , como se observa en la DM tipo 2. Además, estos experimentos demuestran que el IRS-2 juega un papel central en el desarrollo de la célula y en su compensación en situaciones de RPI. f) Ratones heterocigotos nulos combinados para IR, IRS-1, e IRS-2 6. La base genética de la DM tipo 2 es oligo o poligénica, por lo que resulta especialmente interesante explorar los efectos que sobre la acción y secreción de la insulina tienen la suma de pérdidas parciales de función a diferentes niveles en la señalización de la insulina. Así, el porcentaje de animales que desarrollan diabetes es de 5% para IR +/-, 20% para IR/IRS-1 +/-, 17% para IR/IRS-2 +/-, y 40% para los heterocigotos triples IR/IRS-1/IRS-2 +/. Aunque la proporción de animales que desarrollan diabetes es similar entre los heterocigotos dobles (IR/IRS-1 +/- y IR/IRS-2 +/-), existen diferencias metabólicas apreciables. Así, los animales IR/IRS-1 +/desarrollan una RPI severa a nivel de músculo, tejido adiposo, e hígado, asociada a una hiperplasia compensadora de células . En cambio, los IR/IRS2 +/- desarrollan una RPI severa a nivel hepático, mientras que la hiperplasia de células es sólo discreta. Estos hallazgos demuestran que la haploinsuficiencia de IRS-1 afecta preferentemente la señalización de la insulina a nivel de músculo y tejido adiposo, mientras que la de IRS-2 la afecta a nivel de hígado y células . Finalmente, los ratones hete116 rocigotos triples (IR/IRS-1/IRS-2 +/-) desarrollan RPI extrema en el músculo, tejido adiposo, e hígado, asociada a una hiperplasia compensadora de células robusta, pero insuficiente. En la tabla III se resume la localización de los defectos en la acción de la insulina en los distintos tejidos, el estado de la célula y su secreción de insulina, y el fenotipo resultante para todos los modelos de ratones KO mencionados más arriba. Como resumen, el modelo de ratones KO para el IR y sus sustratos (IRS-1 e IRS-2) permite concluir: a) La suma de mutaciones (o de polimorfismos) que produzcan defectos sutiles de la función de proteínas a diferentes niveles de la señalización de la insulina reproducen claramente el fenotipo de la DM tipo 2. Por tanto, se aporta una hipótesis de partida convincente sobre la susceptibilidad oligo o poligénica a la DM tipo 2 en el hombre. b) Este modelo también aporta una demostración práctica de la heterogeneidad genética de la DM tipo 2 pues mutaciones (o polimorfismos) en diferentes genes pueden dar lugar al mismo fenotipo de DM tipo 2, pero por distintos mecanismos. c) Por último, también se pone en evidencia la existencia de otros modificadores genéticos pues no todos los animales con los defectos en la señalización de la insulina mencionados más arriba desarrollan diabetes. PREDISPOSICIÓN GENÉTICA PARA EL DESARROLLO DE NEFROPATÍA EN LA DIABETES MELLITUS La nefropatía diabética (ND) es una complicación frecuente en ambos tipos de DM (tipos 1 y 2) y constituye la principal causa de morbi-mortalidad en estos pacientes 7. Al mismo tiempo, representa la etiología más importante de entrada en diálisis en países industrializados, que se acentúa en ciertas poblaciones 8. Como en otros procesos multifactoriales, debe existir una interacción de factores ambientales y genéticos. El hecho de que sólo un 30-40% de los pacientes diabéticos desarrollen ND, o que el estricto control glucémico no evite completamente su aparición sugieren que existe una predisposición genética 9. Estudios de agregación familiar basados en la asociación de alelos específicos, así como el análisis de frecuencias de polimorfismos en grupos de casos y controles, también apoyan esta hipótesis 10. Varios sistemas fisiológicos participan en los mecanismos involucrados en el desarrollo de ND, y actualmente están identificados los polimorfismos de los genes que codifican las proteínas que intervienen en los mismos. Se ha realizado un número importante de estudios de asociación para testar la contribución de estos polimorfismos al desarrollo de ND. Breve- PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LA DIABETES Tabla III. Trastornos metabólicos para diferentes ratones knock-out para el receptor de insulina (IR) y para los sustratos del receptor (IRS-1 e IRS-2) Animales IR -/IR-/- Muscular IR-/- Célula IR-/- Hígado IRS-1 -/IRS-2 -/IR/IRS-1 +/IR/IRS-2 +/IR/IRS-1/IRS-2 +/Acción Insulina Músculo Defectuosa Defectuosa Normal Normal Defectuosa Normal Defectuosa Normal Defectuosa Acción Insulina Hígado Defectuosa Normal Normal Defectuosa Normal Defectuosa Defectuosa Defectuosa Defectuosa Acción Insulina Tejido Adiposo Defectuosa Normal Normal Normal Defectuosa Normal Defectuosa Normal Defectuosa Secreción Insulina/Célula Hiperinsulinemia Normoinsulinemia Respuesta a glucosa deteriorada Hiperinsulinemia Hiperinsulinemia Hiperplasia Célula Hiperinsulinemia Masa reducida de células Hiperinsulinemia Hiperplasia célula Discreta hiperinsulinemia Discreta hiperplasia célula Hiperinsulinemia Hiperplasia célula (insuficiente) Fenotipo Diabetes Severa Síndrome metabólico Diabetes leve Diabetes leve Síndrome X Diabetes leve-severa Diabetes 20% Diabetes 17% Diabetes 40% -/- Homocigotos nulos; +/- Heterocigotos nulos. mente, comentaremos a continuación las asociaciones más relevantes y los mecanismos biológicos a través de los cuales se desarrollaría esta complicación. Sistema renina-angiotensina (SRA) El SRA juega un papel decisivo en los procesos adaptativos hemodinámicos y morfológicos que se originan tras una pérdida de nefronas. Concretamente, la angiotensina II es la responsable directa de la hipertensión intraglomerular de las nefronas supervivientes, así como de la activación del factor nuclearkB, que controla la transcripción de genes implicados en la respuesta inflamatoria y el crecimiento celular 11. El resultado final es la hipertrofia de células mesangiales, glomeruloesclerosis y fibrosis intersticial, hallazgos frecuentes en la ND. Asimismo, la hiperglucemia actúa sinérgicamente con la angiotensina II agravando esta situación 12. Finalmente, la importancia del SRA en el desarrollo de la ND se hace más evidente con el efecto renoprotector del bloqueo farmacológico de este sistema con inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina (ECA) o antagonistas del receptor AT1 de la angiotensina II 13. La identificación del gen de la ECA ha permitido detectar un polimorfismo que se basa en la insercióndeleción (I/D) de 287 pares de bases en el intron 16, condicionando que los individuos con genotipo DD presenten mayores niveles tisulares y circulantes de angiotensina II 14. Dado que las concentraciones intrarrenales de angiotensina II son sumamente mayores que las plasmáticas 11, pacientes con el genotipo «desfavorable» (DD) tendrían, potencialmente, más riesgo de desarrollar ND que el resto (ID/II). A pesar de estas evidencias, la asociación entre ND y el genotipo DD en ambos tipos de diabetes es confusa y controvertida. Dos meta-análisis que analizan todos los trabajos publicados durante los años 1994-1997 lo confirman: sólo 7 de 23 estudios encuentran una asociación positiva 15, 16. Algunas diferencias en las características fenotípicas de selección entre casos y controles justifican esas discrepancias. Muchos pacientes con microalbuminuria fueron incluidos como casos, y es conocido que no todos los diabéticos con esta alteración desarrollan insuficiencia renal. Otro factor confundente pudo ser la variabilidad étnica y racial. De hecho, en poblaciones caucasianas con DM tipo 1 y 2, no se encontró una clara asociación entre este polimorfismo y la ND 15, 16. Por el contrario, en pacientes asiáticos con DM tipo 2, el riesgo global de ND fue superior cuando estaban presentes los genotipos DD o ID (OR, 1,88; IC 95% 1,42-2,85) 16. En la misma línea, estudios posteriores a estos meta-análisis han ratificado las diferencias raciales de esta asociación 17, 18. Estas diferencias pueden justificarse por la existencia de un desequilibrio de ligamiento de este polimorfismo con el gen responsable de la ND, o alternativamente, que sea necesaria una interacción con polimorfismos genéticos del SRA como el del angiotensinógeno. En este sentido, Marre y cols.19 encontraron una mayor severidad de la ND en pacientes con genotipo DD y el genotipo desfavorable del angiotensinógeno (TT), producto probablemente, de niveles más elevados de este péptido. Otros polimorfismos candidatos para la aparición de la ND Otros genes distintos al SRA también pueden par117 E. SALIDO y cols. ticipar en el desarrollo de ND. La disfunción endotelial es un fenómeno común en pacientes diabéticos y esto puede contribuir a la aparición de ND y ateromatosis prematura. El polimorfismo a-deleción/b-inserción (27 pares de bases) del gen de la óxido nítrico sintasa endotelial se ha asociado con el riesgo de sufrir ND avanzada en la DM tipo 1. Esto se acentúa si dicho polimorfismo se encuentra en desequilibrio de ligamiento (análisis de haplotipo) con el polimorfismo del promotor T-786C del mismo gen 20. Recientemente se ha observado que los portadores de la a-deleción en el intron 4 de este gen presentan una reducción del 20% en los metabolitos plasmáticos del óxido nítrico, lo que facilitaría la disfunción endotelial 21. En el modelo animal, esto acelera la progresión de la ND, presumiblemente por una potenciación de los efectos vasculares de la angiotensina II 22. Indudablemente, estos hallazgos requieren en el futuro la confirmación en humanos. El inhibidor del activador del plasminógeno (PAI1) interviene en los mecanismos de la fibrinolisis y el metabolismo de la matriz extracelular, y su actividad se potencia con la angiotensina II. La ND se caracteriza por expansión mesangial y ensanchamiento de la membrana basal. Por tanto, el polimorfismo del gen del PAI-1 ha sido también propuesto como un factor de riesgo de esta complicación en diabéticos tipo 2 23. Las proteínas G intervienen, ubicuamente, en los procesos de transporte intracelular y transmembrana como la bomba de sodio. De ahí que un polimorfismo (C825T) en el exon 10 del gen que codifica la subunidad -3 de las proteínas G, haya sido relacionado con la hipertensión arterial. En un trabajo reciente, la presencia del alelo T fue, sorprendentemente, más frecuente en pacientes añosos con ND que en aquellos enfermos en diálisis sin DM tipo 2 24. No se sabe aún el mecanismo biológico de tal asociación, pero es posible que la progresión de la ND sea el reflejo del daño vascular provocado por la hipertensión en estos pacientes. Hay ciertas evidencias de que en pacientes diabéticos pudiera existir una predisposición genética para un manejo anómalo del sodio. Estudios previos han mostrado que diabéticos tipo 1 con ND tienen una mayor actividad de la bomba Na-H+ y del contra-transporte Na-litio, que aquéllos sin enfermedad renal 25. Por tanto, es probable que la predisposición genética a la hipertensión arterial esté ligada a la DM y el desarrollo posterior de ND. EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS EN LA DIABETES MELLITUS: TERAPIA CELULAR Y GENÉTICA Una de las áreas de mayor expansión predecible 118 en los próximos años será la investigación en métodos celulares y moleculares para corregir los defectos básicos detectados en la DM. Aunque en sus inicios evolucionaron independientemente, es lógico que las medidas terapéuticas futuras conjuntarán aproximaciones de trasplante celular y de transferencia génica con el fin de corregir el déficit absoluto o relativo de insulina que subyace en la DM. Es más, en la medida que los programas genéticos que determinan la diferenciación celular sean conocidos, se hará posible la modificación del fenotipo de células accesibles a la manipulación genética para transformarlas en células capaces de llevar a cabo la función necesaria: secreción de insulina regulada por los niveles de glucosa. Investigaciones en células progenitoras (stem cells) En los últimos años se ha producido un avance espectacular en el aislamiento de células progenitoras (stem cells) capaces de diferenciación in vitro e in vivo en diferentes tipos celulares. Utilizando células totipotenciales embrionarias (ES) de ratón transfectadas con un marcador que permite la selección in vitro, controlado por el promotor de la insulina, un grupo de Alicante ha conseguido aislar células ES con capacidad de producir insulina 26. Es previsible que con la reciente liberalización de la investigación en células ES humanas, una estrategia similar permita producir células capaces de diferenciarse in vitro en células productoras de insulina humana. Evidentemente, junto a la ventaja potencial de disponer de una fuente abundante de células proliferadas in vitro, el uso de líneas celulares establecidas conllevaría los mismos problemas de respuesta inmune frente a tejidos alogénicos que el trasplante de islotes pancreáticos. Por tanto, paralelamente se tienen que perfeccionar métodos para proteger las células secretoras de insulina del ataque por el sistema inmune. Una posible aproximación en este sentido sería la manipulación genética de estas líneas celulares para minimizar su dotación de moléculas de histocompatibilidad. Otra fuente de células progenitoras que puede resultar útil en la terapia de la DM, y que no se vería afectada por los problemas ético-legales de la investigación con células ES, son las células progenitoras de médula ósea. Los logros alcanzados en el aislamiento de este tipo de células, sumado a la capacidad futura de dirigir la diferenciación celular in vitro hacia células capaces de secretar insulina, puede hacer de esta estrategia una realidad terapéutica próxima. En esta estrategia resulta especialmente atractiva la posibilidad del autotransplante, en el que el propio paciente es el donante de células progenitoras, evitando los problemas del aloinjerto. Durante los últimos PERSPECTIVAS DE FUTURO EN LA DIABETES años hemos asistido a numerosas demostraciones experimentales de la plasticidad de las células progenitoras aisladas de adultos, con frecuencia tirando por tierra esquemas histogenéticos clásicos. Así, por ejemplo, se ha demostrado que células progenitoras neurales pueden dar lugar a progenitoras hematopoyéticas, que las células progenitoras hematopoyéticas pueden generar células progenitoras hepáticas (células ovales) y musculares, e incluso que las progenitoras musculares pueden generar células hematopoyéticas 27. Las posibles aplicaciones terapéuticas de estos conocimientos básicos son fáciles de imaginar, y en los próximos años empezarán a materializarse en soluciones concretas para una amplia gama de patologías, empezando quizá por una que podría beneficiar a millones de individuos como es la DM. Investigaciones en terapia génica Una alternativa al uso de células progenitoras de un origen u otro, es la modificación de la expresión génica de células autólogas de tejidos accesibles a la manipulación genética. Para que un tipo celular pueda cumplir las funciones esenciales de la célula pancreática, son precisos al menos los siguientes requisitos: 1. Transcripción del gen de la proinsulina, regulada por los niveles de glucosa. 2. Procesamiento proteolítico normal de la proinsulina a insulina, ya que la proinsulina carece de actividad reguladora de glucemia. 3. Secreción de insulina dependiente de los niveles de glucosa. La regulación dependiente de los niveles de glucosa requiere, por tanto, que las células seleccionadas para expresar el gen de la insulina dispongan de un sistema sensor de la glucemia. En la célula del islote pancreático este sistema se basa en dos componentes esenciales: el transportador de glucosa GLUT2 y la glucokinasa. La búsqueda de células accesibles a la manipulación genética y que compartan elementos básicos necesarios para la producción de insulina con la célula del islote se ha apoyado en conocimientos embriológicos clásicos. De hecho, se ha descrito la conversión en epitelio pancreático (metaplasia pancreática) de otros epitelios derivados del mesodermo 28. A medida que se van conociendo los genes cruciales en el programa de diferenciación celular, es posible dirigir una subpoblación de células hacia el fenotipo de célula pancreática mediante transferencia génica. Por ejemplo, la transferencia del gen PDX-1, implicado en el desarrollo del páncreas y en la regulación de la expresión del gen de la insulina 29, es capaz de dirigir un porcentaje importante de hepatocitos hacia la producción de insulina 30. El origen embriológico común de hígado y páncreas a partir del mesodermo parece la base lógica en la que fundar la investigación en hepatocitos como posibles dianas de manipulacion genética encaminada a la producción de insulina. Los hepatocitos son un tipo celular muy atractivo para la transferencia génica, ya que son una diana abundante para la que se han generado vectores de terapia génica muy eficaces, tanto basados en elementos virales como no virales. Además, recientemente se ha avanzado mucho en el aislamiento de células progenitoras de hepatocitos, algunas de ellas derivadas de la médula ósea, que pueden ser manipuladas genéticamente in vitro antes de ser inyectadas para que se diferencien en hepatocitos. Los hepatocitos disponen de los componentes esenciales del sensor de la glucemia, pero carecen de las proteasas específicas necesarias para procesar la proinsulina en insulina (convertasas PC1 y PC3). Las limitaciones impuestas por el necesario procesamiento de la proinsulina han sido abordadas creando modificaciones del gen de la proinsulina que sean procesadas por convertasas ubicuas, presentes en el hepatocito, tales como la furina 31. También mediante la tecnología del DNA recombinante se pueden crear variantes del gen de la insulina que no necesiten dicho procesamiento para ser metabólicamente activas. Por ejemplo, recientemente se ha descrito el uso de un gen de insulina monocadena que no necesita procesado por convertasas y que tiene el 20-40% de la actividad de la insulina natural 32. Colocando esta variante del gen de la insulina bajo el control del promotor del gen de la piruvato-kinasa (LPK), que está regulado por los niveles de glucosa, estos autores consiguieron una producción del análogo de insulina por parte de hepatocitos que se asemeja bastante a una regulación fisiológica. No obstante, a diferencia de las células del islote, que almacenan gránulos con insulina y pueden responder de inmediato, la respuesta conseguida con el gen artificial en hepatocitos es más lenta, ya que requiere la transcripción del gen y la síntesis proteica. Es de esperar que trabajos futuros refinen el sistema para permitir una secreción de insulina o análogos de la misma más fisiológica. A pesar de que la modificación de la expresión génica en hepatocitos cuenta con ventajas prácticas (accesibilidad y desarrollo de vectores de terapia génica), otras células pueden proporcionar una liberación de insulina más parecida a la que realiza la célula pancreática. Por ejemplo, las células K del tracto digestivo, productoras de GIP, tienen una cinética de secreción parecida a la célula del islote, respondiendo rápidamente tras la ingesta de glucosa y retornando a niveles basales en un par de horas 33. No sólo la expresión géni119 E. SALIDO y cols. ca, sino también la secreción inmediata de GIP almacenado en gránulos en la célula K 34 responden a niveles de glucosa. Además, estas células expresan glucokinasa, un enzima crucial en el sensor de glucosa, por lo que son un buen tipo celular donde inducir la expresión de insulina. De hecho, la expresión de un gen de insulina humana en tracto gastrointestinal de ratones transgénicos bajo el control del promotor del gen de GIP ha demostrado ser capaz de corregir la diabetes inducida por est r e p t o z o c i n a 35. BIBLIOGRAFÍA 1. Taylor SI: Deconstructing type 2 diabetes. Cell 97: 9-12, 1999. 2. Almind K, Inoue G, Pedersen O, Kahn CR: A common amino acid polymorphism in insulin receptor substrate-1 causes impaired insulin signaling. J Clin Invest 97: 2569-2575, 1996. 3. Almind K, Doria A, Kahn CR: Putting the genes for type II diabetes on the map. Nat Med 7: 277-279, 2001. 4. Alper J: New insights into type 2 diabetes. Science 289: 3739, 2000. 5. Kadowaki T: Insights into insulin resistance and type 2 diabetes from knockout mouse models. J Clin Invest 106: 459465, 2000. 6. Kido Y, Burks DJ, Withers D, Bruning JC, Kahn CR, White MF, Accili D: Tissue specific insulin resistance in mice with mutations in the insulin receptor, IRS-1, and IRS-2. J Clin Invest 105: 199-205, 2000. 7. Rossing P, Hougaard P, Borch-Johnsen K, Parving HH: Predictors of mortality in insulin dependent diabetes: 10 year observational follow-up study. BMJ 313: 779-784, 1995. 8. Ritz E, Rychlik I, Locatelli F, Halimi S: End-stage renal failure in type 2 diabetes: A medical catatrophe of worldwide dimentions. Am J Kidney Dis 34: 795-808, 1999. 9. Krolewski AS: Genetics of diabetic nephropathy: evidence for major and minor gene effects. Kidney Int 55: 1582-1596, 1999. 10. Pettitt DJ, Saad MF, Bennet PH, Nelson RG, Knowler WC: Familial predisposition to renal disease in two generations of Pima indians with type II (non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetología 33: 438-443, 1990. 11. Klahr S, Morrisey J: Angiotensin II and gene expression in the kidney. Am J Kidney Dis 31: 171-176, 1998. 12. Wolf G, Ziyadeh FN: The role of angiotensin II in diabetic nephropathy: emphasis on non hemodynamic mechanisms. Am J Kidney Dis 29: 153-163, 1997. 13. Andersen S, Tarnow L, Rossing P, Hansen BV, Parving HH: Renoprotective effects of angiotensin II receptor blockade in type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy. Kidney Int 57: 601-606, 2000. 14. Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F: An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest 86: 1343-1346, 1990. 15. Tarnow L, Gluud C, Parving HH: Diabetic nephropathy and the insertion/deletion plymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene. Nephrol Dial Transplant 13: 1125-1130, 1998. 16. Kunz R, Bork JP, Fritsche L, Ringel J, Sharma AM: Association between the angiotensin-converting enzyme-insertion/deletion polymorphism and diabetic nephropathy: a metodological appraisal and systematic review. J Am Soc Nephrol 9: 1653-1663, 1998. 17. Kuramoto N, Iizuka T, Ito H, Yagui K, Omura M, Nozaki O, Nishikawa T, Tsuchida H, Makino H, Saito Y, Kanatsuka A: Effect of ACE gene on diabetic nephropathy in NIDDM patients with insulin resistance. Am J Kidney Dis 33: 276-281, 1999. 18. Solini A, Giaccheti G, Sfriso A, Fioretto P, Sardu C, Saller A, Tonolo G, Maioli M, Mantero F, Nosadini R: Polymorphisms of angiotensin-converting enzyme and angiotensinogen genes in type 2 diabetic sibships in relation to albumin excretion rate. Am J Kidney Dis 34: 1002-1009, 1999. 19. Marre M, Jeunemaitre X, Gallois Y, Rodier M, Chatellier G, Sert C, Dusselier L, Kahal Z, Chaillous L, Halimi S, Muller A, Sackman H, Baunduceau B, Bled F, Passa P, Alhenc-Gelas F: Contribution of genetic polymorphis in the renin-angiotensin system to the development of renal complications in insulindependent diabetes. J Clin Invest 99: 1585-1595, 1997. 20. Zanchi A, Moczulski DK, Hanna LS, Wantman M, Warram JH, Krolewski AS: Risk of advanced diabetic nephropathy in type 1 diabetes is associated with endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism. Kidney Int 57: 405-413, 2000. 21. Tsukada T, Yokoyama K, Arai T, Takemoto F, Hara S, Yamada A, Kawaguchi Y, Hosoya T, Igari: Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO meatabolite levels in humans. Biochem Biophys Res Commun 245: 190-193, 1998. 22. Shultz PJ, Schorer AE, Raij L: Effects of endotelium-derived relaxing factor and nitric oxide on rat mesangial cells. Am J Physiol 258: F162-F167, 1990. 23. Wong TY, Poon P, Szeto CC, Chan JC, Li PK: Association of plasminogen activator inhibitor-1 4G/4G genotype and type 2 diabetic nephropathy in Chinese patients. Kidney Int 57: 632-638, 2000. 24. Blüthner M, Schmidt S, Siffert W, Knigge H, Nawroth P, Ritz E: Increased fequency of G-protein 3-subunit 825 T allele in dialyzed patients with type 2 diabetes. Kidney Int 55: 1247-1250, 1999. 25. Fogarty DG, Krolewski AS: Genetic susceptibility and the role of hypertension in diabetic nephropathy. Curr Opin Nephrol Hyperten 6: 184-191, 1997. 26. Soria B, Roche E, Berna G, Leon-Quinto T, Reig JA, Martin F: Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49: 157-162, 2000. 27. Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science 287: 14421446, 2000. 28. Slack JM: Developmental biology of the pancreas. Development 121: 1569-1580, 1995. 29. MacFarlane WM, McKinnon CM, Felton-Edkins ZA, Cragg H, James RF, Docherty K: Glucose stimulates translocation of the homeodomaine transcription factor PDX-1 from the cytoplasm to the nucleus in pancreatic cells. J Biol Chem 274: 1011-1016, 1999. 30. Ferber S, Halkin A, Cohen H, Ber I, Einav Y, Goldberg I, Barshack I, Seijffers R, Kopolovic J, Kaiser N, Karasik A: Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nat Med 6: 568-572, 2000. 31. Thulé PM, Liu J, Phillips LS: Glucose regulated production of human insulin in rat hepatocytes. Gene Ther 7: 205-214, 2000. 32. Lee HC, Kim SJ, Kim KS, Shin HC, Yoon JW: Remission in models of type 1 diabetes by gene therapy using a singlechain insulin analogue. Nature 408: 483-488, 2000. 33. Cataland S, Crockett SE, Brown JC, Mazzaferri EL: Gastric inhibitory polypeptide (GIP) stimulation by oral glucose in man. J Clin Endocrinol Metab 39: 223-228, 1974. 34. Kieffer TJ, Buchan AM, Barker H, Brown JC, Pederson RA: Release of gastric inhibitory polypeptide from cultured canine endocrine cells. Am J Physiol 267: E489-496, 1994. 35. Cheung AT, Dayanandan B, Lewis JT, Korbutt GS, Rajotte RV, Bryer-Ash M, Boylan MO, Wolfe MM, Kieffer TJ: Glucose-dependent insulin release from genetically engineered K cells. Science 290: 1959-1962, 2000. 120