NEFROLOGIA. Vol. XVI. Suplemento 3. 1996 Avances en el estudio de la regulación de la síntesis de NO en la célula mesangial M. Saura, C. Zaragoza, R. Martínez-Dalmau, D. Pérez-Sala y S. Lamas Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid. INTRODUCCIÓN En los últimos años, la célula mesangial ha sido objeto de intenso estudio en cuanto a su capacidad para producir óxido nítrico (NO) en determinadas condiciones. Esta sustancia actúa como un importante mediador biológico que regula gran cantidad de funciones en diversos tejidos 1. Desde 1990 se sabe que las células mesangiales, al igual que las células musculares lisas, son capaces de sintetizar NO tras ser tratadas con citoquinas o lipopolisacárido bacteriano 2, 3. La vía genéricamente más aceptada para esta síntesis inducida de NO transcurre a través de la expresión de novo de una isoforma inducible de la óxido nítrico sintetasa (NOSi), enzima que cataliza la síntesis de NO a partir de la L-arginina. La expresión de la NOSi produce la liberación de grandes cantidades de NO, que ejerce funciones citotóxicas y citostáticas. Desde el punto de vista fisiopatológico es importante resaltar que el NO sintetizado en el glomérulo h a sido relacionado con la regulación de algunos procesos de gran relevancia homeostática, como la regulación de la hemodinámica renal y glomerular, la secreción de renina, el feedback túbulo-glomerular 4 y la prevención de la trombosis glomerular en situaciones de isquemia o infección 5. Nuestro interés en el estudio de la regulación de la síntesis de NO y expresión de la NOSi en células mesangiales de rata y humanas deriva de los efectos de esta sustancia sobre la fisiología de las células mesangiales. El NO sintetizado por ellas contribuye al mantenimiento de la tasa de filtración glomerular en condiciones basales y actúa de manera autocrina, regulando la respuesta glomerular en condiciones de inflamación y endotoxemia 6. Una relación de los efectos del NO sobre la célula mesangial se muestra en la tabla I. Si bien el NO juega claramente un papel en las alteraciones hemodinámicas del shock séptico 7, la contribución relativa de las células mesangiales desde el punto de vista cuantitativo a la producción total de NO glomerular ha sido discutida por algunos autores, quienes sostienen que las células esencialmente responsables de la síntesis de NO son aquellos macrófagos glomerulares no residentes que infiltran al glomérulo durante el proceso infeccioso 8. Debido a la implicación del NO en la fisiopatología renal, el estudio de la regulación de la NOSi mesangial resulta imprescindible para así comprender el papel de la síntesis de NO en condiciones tanto fis i o l ó g i c a s como fisiopatológicas. Los problemas principales que hemos abordado son: 1 . C a r a c t e r i z a c i ó n molecular y funcional de la N O S i en células mesangiales de rata tratadas con Tabla I. Efectos del NO sobre las células mesangiales Acción Inhibición de la proliferación Mecanismo Inhibición de la RN reductasa Inhibición PDGF GMPc Efecto en la CM Modificación de las respuestas celulares a citoquinas y factores de crecimiento Microcirculación glomerular: Kf y tráfico de macroléculas a través del mesangio Inflamación y daño tisular Disminución del tono mesangiial Citotoxicidad Combinación del NO con radicales del oxígeno Desconocido Inhibición síntesis proteínas de matriz extracelular Modulación de la MEC en enfermedades glomeruales NO: óxido nítrico. RN reductasa: ribonucleótido reductasa. PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetas. Kf: coeficiente de ultrafiltración. MEC: matriz extracelular. Correspondencia: S. Lamas. Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Velázquez, 144. 28006 Madrid La secuencia de cDNA de célula mesangial de rata (fig. 2) está accesible en la base de datos Gene-Bank con el siguiente código de acceso: U-48829. 35 M. SAURA y cols. factor de necrosis tumoral (TNF-) y lipopolisacárido bacteriano (LPS). 2. Estudio de la inhibición de la síntesis de NO en células mesangiales de rata por antiinflamatorios y antioxidantes y sus mecanismos moleculares. 3. Caracterización de la región promotora del gen de la NOSi de rata. 4. Estudios en células mesangiales humanas. Por evidentes razones de espacio, y al haberse publicado o estar en vías de hacerlo la mayor parte de estos estudios, no podemos hacer una descripción exhaustiva de cada uno de estos apartados, limitándonos a destacar los aspectos más relevantes. ESTUDIOS EN CELULAS MESANGIALES DE RATA N u e s t r o s resultados iniciales mostraron que el T N F - y el LPS tienen una actividad sinérgica en c u a n t o a su capacidad para sintetizar NO en las c é l u l a s mesangiales, detectándose un aumento de la síntesis significativo a las 4 horas de exposición, q u e es máximo tras ocho horas de tratamiento. Mediante estudios de RT-PCR (transcripción inversa seguidos de reacción en cadena de la polimerasa), partiendo del RNA total de células mesangiales estimuladas con LPS+TNF-, purificamos y clonamos u n fragmento de 700 pares de bases del cDNA de la NOSi de células mesangiales, cuya secuencia de nucleótidos y aminoácidos es de elevada identidad con la NOSi de las células musculares lisas de rata, sugiriendo que son el producto de la expresión del m i s m o gen (fig. 1). Posteriormente utilizamos este fragmento como sonda para realizar los experimentos de Northern blot. El estudio de la síntesis de NO mediante la acum u l a c i ó n de NO 2­ e n el medio de incubación de las células y de la expresión de RNA mensajero dem o s t r ó que un glucocorticoide típico como la dexametasona inhibía la síntesis y la expresión de la NOSi, si bien para que esta última fuera significativ a era necesario añadir la dexametasona antes de la combinación de estímulos inductora 9. Asimismo pudimos demostrar que el efecto de la dexametason a dependía de la unión al receptor de glucocorticoides, ya que el efecto inhibidor de la dexametasona era bloqueado por un antagonista del mismo, el RU-3486 10. En experimentos encaminados a est u d i a r el posible efecto de la dexametasona sobre la estabilidad del mRNA de la NOSi comprobamos que este agente antiinflamatorio prolongaba la vida media del tránscrito en un 30 %, si bien este fenóm e n o no explica el efecto inhibitorio de la dexam e t a s o n a (Saura y cols., manuscrito en preparación). 36 Fig. 1.--Efectos del tiempo de incubación con pirrolidind itiocarbamato (PDTC) sobre la expresión del mRNA de NOSi en CMR estimuladas con LPS+ TNF-. Las CMR fueron incubadas con vehículo (CT, 24 h), LPS (10 µg/ml, 8 h) + rHuTNF- (100 ng/ml, 8 h ) (L/T), PDTC (100 µM, 24 h) y PDTC (100 µM) a diferentes tiempos (24, 8 y 4 h) + L/T (8 h). A) Autorradiografía de un experimento representativo mostrando la expresión del mRNA de la NOSi y de la -actina. B) Los análisis densitométricos que muestran expresión de NOSi corregidos por la expresión de -actina e s t á n representados debajo. Los resultados muestran la media ± EEM de tres experimentos independientes. * p < 0,05 vs CT; ** p < 0,05 vs L/T. La utilización de un antioxidante, el pirrolidín ditiocarbamato (PDTC), con capacidad relativamente s e l e c t i v a de inhibir la activación de un factor de transcripción, llave de muchas respuestas inflamat o r i a s , el NF-KB, demostró la implicación de este factor en la expresión de la NOSi, algo que ya había sido sugerido para la NOSi presente en macróf a g o s murinos 9 . La activación de este factor de transcripción conlleva la disociación de la subunid a d inhibitoria IKB y el transporte del factor de transcripción al núcleo donde será capaz de unirse a l DNA y activar la transcripción génica. El PDTC es capaz de bloquear la liberación de IKB gracias a su actividad antioxidante y quelante de metales pesados. Además, en contraste con la dexametasona, este agente era capaz de inhibir la síntesis de NO y l a expresión del RNA mensajero de NOSi con un patrón temporal distinto, ya que el tratamiento con REGULACION DE LA SINTESIS DE NO EN LA CELULA MESANGIAL F i g . 2.--Comparación de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos entre la NOS inducible de célula muscular lisa de r a t a y célula mesangial de rata. En el renglón superior se encuentra la secuencia de células mesangiales de rata; el renglón inferior corresponde a la secuencia de las células musculares lisas de rata. A) Alineamiento entre los cDNAs de célula mesangial y célula muscular lisa de rata. Porcentaje de identidad: 97 %. B) Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los cDNAs del gen NO-sintetasa de célula muscular lisa y célula mesangial de rata. Porcentaje de identidad: 95 % y oligonucleótidos marcados conteniendo la secuencia de unión tanto del factor de transcripcion N F - K B como de AP-1 demostraron que ambos se activaban por los mismos estímulos que eran necesarios para la inducción de la NOSi, si bien el pat r ó n temporal era distinto entre sí. Cuando se incluía PDTC 2 horas antes del estímulo se observaba u n a inhibición casi completa de la activacion de NF-KB, un fenómeno que no era tan claro en el caso del pretratamiento con dexametasona. En el caso de AP-1, el PDTC no era capaz de modificar su activación, encontrando un grado variable de inhibición con la dexametasona. En el momento actual nos encontramos pendientes de confirmar estos resultados. U n aspecto importante para poder profundizar en el estudio de la regulación transcripcional de la NOSi de rata se relaciona con el conocimiento detallado de la estructura del promotor del gen en la rata. En este sentido hemos clonado y secuenciado 3 8 0 pares de bases de la región 5 reguladora del gen de rata utilizando una estrategia de PCR a part i r de DNA genómico. El análisis de la misma ha permitido establecer la existencia de diversas region e s consenso de unión a factores reguladores ( S a u r a y cols., manuscrito en preparación). En su mayor parte estas regiones se encontraban presentes en el promotor del gen de la NOSi murina 11, 12 y las regiones consenso de unión al factor NF-KB, así c o m o la caja TATA, se encontraban totalmente conservadas. En esta región limitada no hemos encontrado una zona de posible unión a AP-1, y estamos ampliando la secuencia de estudio en sentido 5 ' para poder encontrar estos hipotéticos elementos. ESTUDIOS EN CELULAS MESANGIALES HUMANAS U t i l i z a n d o células mesangiales humanas en c u l t i v o observamos que para obtener una inducc i ó n significativa en cuanto a la síntesis de NO y e x p r e s i ó n de la NOSi es necesaria la combinac i ó n de 2 o más citoquinas y lipopolisacárido. E s t e hecho se correlaciona con algunas observac i o n e s publicadas en la literatura, donde parece q u e la regulación transcripcional de la NOSi hum a n a es significativamente diferente de la murina y prob a b l e m e n t e de la de rata. Es posible que a lo larg o de la evolución la especie humana haya desar r o l l a d o mecanismos de respuesta diferenciales a n t e citoquinas proinflamatorias o productos de l a pared microbiana. En estos mismos estudios 37 PDTC cuatro horas después de añadir TNF- y LPS s e g u í a produciendo una inhibición significativa (fig. 2). Las señales intracelulares que controlan la expresión del mRNA de la NOSi no son bien conocidas. El estudio de la región promotora de otros genes relacionados con respuesta inflamatoria, y posteriormente el aislamiento y caracterización de la región p r o m o t o r a del gen de NOSi murino y humano, aportaron pruebas de que determinados factores de t r a n s c r i p c i ó n , como NF-KB y quizás AP-1, particip a n en la activación de este gen. Algunos experim e n t o s preliminares de retardo en gel utilizando extractos nucleares de células mesangiales de rata M. SAURA y cols. s o b r e la propia expresión de la NOSi (Saura y Pérez-Sala, en preparación). CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS En definitiva, nuestros estudios contribuyen a profundizar en algunos aspectos de la regulación de la expresión de la NOSi en células mesangiales de rata, pudiendo establecer un modelo de trabajo de la misma (fig. 3). Nuestros próximos pasos están encaminados a comprobar parte de estas hipótesis mediante la transfección de células mesangiales con diferentes construcciones del promotor de la NOSi de rata, una caracterización molecular más amplia de éste y la disección más precisa de la participación de NF-KB y AP-1 en los mecanismos inhibitorios de la dexametasona y el pirrolidín ditiocarbamato. Agradecimientos y observaciones Marta Saura y Carlos Zaragoza son becarios de la Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo. Este trabajo ha sido financiado con cargo al proyecto de la DGICYT PB 93-0044. Bibliografía 1. Nathan C: Nitric oxide as a secretory product of mamalian cells. FASEB J 6:3051-3064, 1992. 2. Pfeilschifter J, Mulsch RPA, Fandrey J, Vosbeck K y Busse R: I n t e r l e u k i n 1 a n d tumour necrosis factor i n d u c e a macro- phage-type of nitric oxide synthase in rat renal mesangial cells. Eur J Biochem 203:251-255, 1992. 3. Shultz PJ, Archer SL y Rosenberg ME: Inducible nitric oxide synthase mRNA and activity in glomerular mesangial cells. Kidney Int 46:683-689, 1994. 4. Raij L y Baylis C: Glomerular actions of nitric oxide. Kidney Int 48:20-32, 1995. 5. S h u l t z PJ y Raij L: Endogenously synthesized nitric oxide p r e v e n t s endotoxin-induced glomerular thrombosis. J Clin Invest 90:1718-1725, 1992. 6. Pfeilschifter J, Kunz D y Mülh H: Nitric oxide: an inflammat o r y mediator of glomerular mesangial cells. Nephron 64:518-525, 1993. 7. T h i e m e r m a n n C: The role of the L-arginine: nitric oxide p a t h w a y in circulatory shock. Adv Pharmacol 2 8 : 4 5 - 7 9 , 1994. 8. C a t t e l l V y Cook HT: Nitric oxide: role in the physiology a n d pathology of the glomerulus. Exp Nephrol 1 : 2 6 5 - 2 8 0 , 1993. 9. Saura M, López S, Rodríguez Puyol M, Rodríguez Puyol D y L a m a s S: Regulation of inducible nitric oxide synthase exp r e s s i o n in rat mesangial cells and isolated glomeruli. Kidney Int 47:500-509, 1995. 10. S a u r a M, Rodríguez-Puyol M, Rodríguez-Puyol D y Lamas S: Papel de los glucocorticoides en la regulación de la actividad y la expresión de la óxido nítrico sintetasa inducible e n células mesangiales de rata. Nefrología X V : 4 5 6 - 4 6 3 , 1995. Figu. 3.--Modelo hipotético del mecanismo propuesto para la regulación de la NOSi en CMR. Tanto LPS como TNF- serían capaces en nuestro sistema celular de activar NF-KB induciendo su translocación al núcleo y también de inducir la actividad del factor AP-1. Estos dos efectos pueden estar mediados por los r a d i c a l e s intermediarios del oxígeno (ROI). Una vez en el núcleo, el NF-KB se uniría a su secuencia consenso de la región r e g u l a d o r a de la NOSi, que es idéntica a la presente en el promotor de ratón, y AP-1 podría interaccionar en este mismo s i t i o o en posibles sitios de unión AP-1 que no han sido encontrados en el fragmento de la región 5' clonado. A su vez, l a dexametasona, a través de la unión a su receptor, puede interferir en los procesos de activación de la NOSi mediante la i n t e r a c c i ó n del RG activado con estos dos factores de transcripción y,afectando al mismo tiempo a la estabilidad del mRNA de la NOSi. p u d i m o s comprobar que una linfoquina antiinflam a t o r i a , la interleuquina-13, inhibe la expresión d e la NOSi y la síntesis de NO de manera depend i e n t e del tiempo y concentración 1 3 . La import a n c i a de estos resultados se encuentra en el hecho de que esta linfoquina es un mediador e n d ó g e n o que es expresado en el organismo dur a n t e enfermedades mediadas por anticuerpos y h a sido aislada en un modelo animal de glomerulonefritis. Finalmente, estamos estudiando en estas mismas células el posible efecto de donadores exógenos de N O y de tetrahidrobiopterina, un cofactor crítico para activar las NOS 14, sobre la síntesis de NO y 38 AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA REGULACION DE LA SINTESIS DE NO EN LA CELULA MESANGIAL 11. L o w e n s t e i n CJ, Alley EW, Raval P, Snowman AM, Snyder S H , Russell SW y Murphy WJ: Macrophage nitric oxide synthase gene: two upstream regions mediate the induction b y interferon and lipopolysaccharide. Proc. Natl Acad Sci USA 90:9730-9734, 1993. 12. X i e QW, Whisnant R y Nathan C: Promoter of the mouse g e n e encoding calcium-independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon gamma and bacterial lipopolisacharide. J Exp Med 177:1779-1784, 1993. 13. S a u r a M, Martínez-Dalmau R, Pérez-Sala D y Lamas S: I n t e r l e u k i n - 1 3 inhibits nitric oxide synthase in human mesangial cells. Biochem J 313:641-646, 1995. 14. M a r l e t t a MA: Nitric oxide synthase structure and mechanism. J Biol Chem 268:12231-12234, 1993. 39