NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 2, 1994 BIOLOGIA MOLECULAR Y NEFROLOGIA Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica A. Hernández, P. Martín Vasallo*, A. Torres y E Salido Laboratorio de Medicina Interna y Biología Molecular, Departamento de Medicina Interna, Universidad de La Laguna. * Laboratorio de Biología del Desarrollo. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de La Laguna. ESQUEMA GENERAL DE LA EXPRESION DE UN GEN Para comprender bien los fundamentos de los métodos de estudio de la expresión génica, como son el Northern blot, el ensayo de protección de RNAsas y la estrategia RT-PCR, creemos necesario recordar el proceso de la expresión génica (fig. 1). Pueden encontrarse revisiones bien detalladas sobre esto en otras fuentes especializadas 1,2 . La actividad de un gen comienza con la transcripción, proceso que consiste en la síntesis de una molécula de RNA mediante el copiado de una porción de una de las hebras del DNA (una unidad de transcripción) que se extiende desde una secuencia génica denominada promotor hasta el terminador. La reacción es catalirada por una RNA polimerasa y comprende eventos complejos, aún no bien conocidos, de desenrollamiento del DNA, reconocimiento de secuencias consenso del promotor, presencia de factores proteicos de transcripción 3, etc. El primer producto de la transcripción es un transcrito primario, una molécula que rápidamente comienza a ser procesada por las ribonucleasas (RNAsas) nucleares. Uno de los primeros eventos del procesamiento ocurre en la región 3' del transcrito y consiste en un corte específico realizado por una endoRNAsa y la adición en ese lugar de una secuencia de poli-adenosina (extremo poli-A) catalizada por la pali-A-palimerasa utilizando ATP como sustrato. Aunque no todas, la mayoría de las moléculas de RNA que darán lugar a una proteína llevan en su extremo 3' esa cola poli-A, cuya longitud oscila entre 50 y 200 nucleótidos. Al parecer, su función primordial es aumentar la estabilidad del RNA en el citoplasma 2,8 ;pero, al margen de su función biológica, la presencia de este Correspondencia: Dr. Armando Torres Ramírez Servicio de Nefrología. Hospital Universitario de Canarias. Ofra, s/n. La Cuesta. La Laguna. 38320 Santa Cruz de Tenerife. Fig. 1.-Flujo de información de DNA a RNA y proteína para un hipotético gen con .3 exones. segmento poli-A es crucial para la clonación de genes 6 y será también de gran utilidad para el procedimiento RT-PCR. La secuencia de bases de un gen y los aminoácidos del producto génico no son colineales, sino que los genes poseen secuencias intermedias de DNA no traducibles a proteína, los intrones, que representan como promedio el 75 % de la longitud del gen. Así pues, el transcrito primario es procesado de un modo 145 A. HERNANDEZ y cols extraordinariamente preciso mediante cortes y empalmes que eliminan las secuencias correspondientes a los intrones: proceso de «splicing» 4. La reacción es catalizada por endoRNAsas que localizan secuencias específicas, y el resultado es el R N A m e n s a j e r o (mRNA) maduro, que únicamente contiene los exones. Como veremos, para el estudio de la expresión mediante el procedimiento RT-PCR es importante conocer, si es posible, la secuencia nucleotídica completa del gen, o por lo menos disponer de una información mínima en lo que se refiere a la localización y tamaños aproximados de exones e intrones. El mRNA maduro es sustancialmente más largo de lo necesario para codificar solamente su proteína. Un mRNA de tamaño medio tiene aproximadamente 1.000 - 2.000 bases de largo y existen en él dos tramos no traducibles a proteína o UTR («untranslated region»): a) 5' UTR o región «leader», generalmente corta ( < 100 bases). b) 3' UTR o región «trailer», por lo general bastante larga (incluso de 1 . 0 0 0 - 2 . 0 0 0 bases en algunos mensajeros de gran tamaño). Este último tramo no traducible es digno de tener en cuenta en el método RT-PCR y conviene conocer su tamaño, y a ser posible su secuencia, en el gen cuya expresión queremos estudiar. Finalmente, una vez que el mRNA maduro pasa al citoplasma tiene lugar la síntesis proteica, un proceso muy complejo, con multitud de eventos, en el que participan los tres tipos de RNA celulares (tRNA, rRNA, mRNA), varias proteínas estructurales (ribosómicas) y factores proteicos de traducción 1. Es obvio que la expresión génica no es necesariamente un proceso automático una vez se ha iniciado, sino que existen unos niveles de control intermedios que van desde la activación de la estructura del gen (p. ej., por la respuesta generada por una acción hormonal) hasta los procesos postraduccionales (como la eliminación de secuencias peptídicas pre y pro por acción de proteasas, o la regulación de la glicosilación en las proteínas que lo requieren) 5. No en todos los genes se controla su expresión mediante cada uno de los niveles potenciales de control, sino que para cada gen existe un conjunto particular de eventos que controlan la expresión. ESTUDIO DE LA EXPRESION CENICA Estrictamente, el término expresión génica abarca desde la activación del gen hasta que la proteína madura se ha localizado en el lugar adecuado y realiza su función, de tal manera que dicha proteína contribuye a la expresión del fenotipo celular. Este hecho puede ser abordado por técnicas de análisis de pro146 teínas («binding» molecular, RIA, ELISA, western blot, inmunohistoquímica). Además, si la proteína es un enzima se puede estudiar su grado de expresión titulando su actividad enzimática. Sin embargo, es un hecho generalmente aceptado que la abundancia de un mRNA y el número de moléculas por célula de ese transcrito se correlaciona con el nivel de síntesis de la proteína correspondiente. Por esta razón, en la práctica, el grado de expresión de un gen puede ser estudiado con gran aproximación mediante detección y/o cuantificación de los mRNAs funcionales del citoplasma, y los métodos de e s t u d i o utilizados (Northern blot, protección de RNAsa, RT-PCR e hibridación in situ) se basan en su c a p a c i d a d para detectar mRNAs específicos y no productos proteicos. Como ya se ha dicho, existen diferentes niveles de control de la expresión. Al parecer, la expresión génica específica de tejido y la expresión regulada durante el desarrollo están sometidas en gran parte a control transcripcional 3, pero existen muchos genes, sobre todo los que codifican productos que son utilizados y degradados muy rápidamente, en los que predominan los procesos postranscripcionales de control 8 , por ejemplo, alteración de la vida media de los mRNAs por un cambio en su tasa de degradación. Es decir, la concentración de mRNAs funcionales disponibles para traducción a proteína depende no sólo de la tasa de síntesis de mRNA, sino también de la estabilidad relativa del mRNA una vez en el citoplasma. Cuando se detecta un incremento o reducción del nivel de un mRNA en el estado estacionario en respuesta a un estímulo particular, se puede precisar si esto ocurre por mecanismos transcripcionales. Este estudio se hace habitualmente mediante el ensayo de «runo l f » nuclear, en el que, aislando primero los núcleos y suministrando nucleótidos radiactivos como precursores del RNA recién transcrito, se detectan y cuantifican los mRNAs de interés sintetizados durante un per í o d o de tiempo controlado 9 . Esto da un índice directo de la tasa de transcripción del gen, y si el ensayo no muestra cambios en la transcripción del mensaje, la variación en su nivel se atribuye usualmente a cambios en la estabilidad del mRNA. Finalmente, la hibridación in situ es otra poderosa herramienta para detectar transcritos que, a diferencia del Northern blot, permite localizar el mRNA en áreas de tejido y determinar también la cantidad relativa del mensajero in situ. EXTRACCION DEL RNA CELULAR La posibilidad de aislar RNA lo más intacto posible es esencial tanto para el clonado de genes como para ANALISIS DEL RNA el análisis de la expresión génica. El éxito de cualquier extracción de RNA es totalmente dependiente de la eliminación de toda posible contaminación de ribonucleasas (RNAsas) que degradan el RNA durante y después de la extracción, provocando bajos rendimientos de RNA de longitud completa. Las ribonucleasas son enzimas muy resistentes y de gran actividad catalítica 10 : a) son marcadamente resistentes al calor, manteniendo incluso una considerable actividad tras un ligero calentamiento; b) son activas dentro de un amplio rango de pH; c) usualmente no requieren cofactores para su actividad; c) algunas, como las RNAsas pancreáticas, se renaturaliran fácilmente después de un tratamiento con agentes desnaturalizantes (p. ej., urea). El contenido de RNAsas endógenas varía con el tejido que se estudia: páncreas y bazo son tejidos con muy altos contenidos de RNasas, mientras que riñón, hígado e intestino tienen niveles menores, aunque no despreciables. Un problema adicional es que el contenido de mRNA en cualquier tejido es muy bajo: una célula típica de mamífero contiene aproximadamente 10-5 ug de RNA total, del que tan sólo 1-5 % corresponde a mRNA 11, De ese mRNA, aproximadamente el 50 % lo constituyen clases de mensajeros presentes en un número de copias < 10 por célula 1. Por esta razón, una pequeña contaminación de RNasas, tanto endógena (del propio tejido) como exógena (del material utilizado, soluciones, manos, polvo, etc.), puede suponer un problema serio, por lo cual se deben tomar algunas precauciones. Precauciones y metodología general A diferencia del DNA, el RNA es muy inestable una vez obtenido el tejido, por la presencia de las RNasas celulares. Por ello resulta crítica la congelación del tejido o su rápida homogeneización en la solución desnaturalizante. Una fuente potencialmente grande de contaminación con RNasas son las manos del investigador por las células epidérmicas que se liberan continuamente. Es por ello obligado el uso de guantes tanto al realizar la extracción como al preparar las soluciones. De fundamental importancia para una extracción de RNA intacto con éxito es la ejecución de todas las fases tan rápidamente como sea posible, ya que esto elimina riesgos de contaminación. Los recipientes a utilizar deben ser de plástico y estériles, y si se quiere trabajar con recipientes de cristal es necesario calentarlos a 250º C durante 24 horas o más (ni siquiera el autoclavado nos garantiza la inactivación de ribonucleasas) 10,11. Hay que trabajar, además, con soluciones libres de RNasas contaminantes, y esto se consigue tratándolas previamente con DEPC. El DEPC (dietil pirocarbonato) es un agente alquilante que reacciona covalentemente y de modo inespecífico con las proteínas, pero es muy reactivo con los sitios activos de las RNasas, inactivándolas muy eficaz, aunque no absolutamente. El DEPC sobrante puede reaccionar con el RNA y es preciso eliminarlo autoclavando las soluciones antes de utilizarlas; así, el DEPC se descompone en etanol y CO2 que son volátiles. Una vía para eliminar la degradación de RNA durante la extracción es desnaturalizar todas las proteínas celulares, incluyendo las RNasas. Se utilizan pot e n t e s agentes caotrópicos, como las sales d e g u a n i d i o . Desde hace tiempo 12 se sabe que las proteínas se desnaturalizan y, por tanto, pierden su actividad a concentraciones 4M de cloruro de guanidio, en contraste con la estructura secundaria de los ácidos nucleicos, que casi no se ve afectada. La eficacia del tiocianato de guanidio (GTC) es aún mayor y su uso es prácticamente universal en todos los métodos de extracción de RNA 10,11,13,14. Como ejemplo de su efectividad baste decir que la vida media de la RNasa A pancreática es de 3 minutos en 8M urea y de sólo unos 5 segundos en tiocianato de guanidio 4M13. La solución en que el tejido debe ser homogeneizado debe tener 4M GTC, además de detergentes (como el SDS o el sarcosil) que ayudan a romper membranas celulares y desnaturalizar proteínas, y agentes reductores (como el 2-mercapto-etanol) que contribuyen también a la desnaturalización proteica mediante la rotura de puentes disulfuro (típicos de las RNasas). Tras el homogeneizado del tejido y la desproteinización del RNA con agentes desnaturalizantes hay que aislar físicamente el RNA del resto de componentes celulares. Existen dos procedimientos fundamentales para realizar esta separación: 1 . Ultracentrifugación en gradiente de densidad: basada en la mayor densidad del RNA respecto al resto de los componentes celulares. 2. Extracción fenólica: basada en la propiedad de los ácidos nucleicos de ser más solubles en soluciones acuosas que en solventes orgánicos. Separación del RNA mediante ultracentrifugación En este método las células son lisadas mediante un triturador de aspas o de émbolo en una solución que contiene 4M CTC. El RNA es entonces sedimentado centrifugando a alta velocidad en un gradiente de cloruro de cesio (CICs). La densidad del RNA (> 1,8 g/ml) es mayor que la del resto de componentes celulares y mayor también que la del CICs 5,7 M (1 ,1-1 ,2 g/ml). El resultado es que durante la sedimentación 147 A. HERNANDEZ y cols. fundamentales Sobrenadante Proteínas Residuos celulares DNA RNA ! i Gradiente de CICs Este método de extracción de RNA presenta varias ventajas: a) Requiere muy pocas manipulaciones, lo cual elimina el riesgo de contaminaciones esporádicas con RNasas y requiere poco tiempo. b) Proporciona RNAs muy poco degradados a partir de muchas fuentes y es el método de elección para tejidos con altos niveles de RNasa endógena (p. ej.: páncreas). c) El rendimiento es bueno (unos 200 ug RNA a partir de 108 células), y la pureza en mRNA es bastante alta porque pequeños RNAs (tRNA y rRNA 5S) tienen menor densidad y no sedimentan con él. También la contaminación con DNA es mínima. Sin embargo, el hecho de que se requiera una centrifuga a alta velocidad limita el número de muestras que pueden prepararse al mismo tiempo. Este método es preferido para elaboración de genotecas de cDNA en las que se requiere RNA de alta pureza e integridad. Separación del RNA mediante extracción fenólica Probablemente los métodos más comunes para extracción de ácidos nucleicos son los que utilizan fenol 10 . El principio básico de la extracción fenólica es la desproteinización del homogeneizado celular (solución acuosa que contiene los ácidos nucleicos) y la eliminación de los componentes no hidrosolubles mediante una separación de fases con distinta solubilidad. En primer lugar, se efectúa la homogeneización del tejido mediante el procedimiento más conveniente (con triturador de aspas, de émbolo o, si el volumen de tejido es pequeño, mediante ultrasonidos). Se añade un volumen de fenol y, tras una intensa agitación, se centrifuga la mezcla, dando como resultado la separación de dos fases (fig. 2B): a) una fase inferior orgánica (fenólica) que contiene lípidos, proteínas y fragmentos subcelulares varios, y b) una fase superior acuosa (menos densa) que contiene polisacáridos, ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles, quedando la mayor parte de las proteínas en la interfase debido a su contenido en aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos. En esta separación, el fenol suele usarse en combinación con cloroformo para aumentar la eficiencia de la extracción: la alta densidad del cloroformo y su capacidad para disolver lípidos y proteínas proporciona fases acuosas menos contaminadas. También es importante acidificar ligeramente el buffer de homogeneizado: a un pH 5-6, el DNA es selectivamente retenido en la fase orgánica y la interfase, dejando el RNA en la fase acuosa. Transferida la fase acuosa a un tubo Fig. 2.-Separación fisica del RNA del resto de los componentes celulares: A) Resultado de la ultracentrifugación del homogeneizado en un colchón de CICs. B) Resultado de la fenolización del homogeneizado en el método de extracción fenólica. los distintos componentes celulares van quedando a distintas alturas en el tubo, mientras que el RNA forma un pellet en el fondo (fig. 2A). El fluido sobrenadante es luego cuidadosamente retirado con una pipeta Pasteur y el RNA es purificado posteriormente mediante precipitación con etanol y centrifugación. Es importante en este método homogeneizar bien el tejido porque esto rompe el DNA nuclear y evita la formación de una red impenetrable de DNA en el colchón de CICs que podría bloquear la sedimentación del RNA hacia el fondo del tubo de centrífuga. Con este fin también se suele utilizar una jeringa con una aguja fina para hacer pasar el homogeneizado. En la tabla I se muestra una variante del conocido método de Chirgwin y cols. 13, pero otras variantes son igualmente válidas 9 - 1 1 . Tabla I. Protocolo resumido del método de extracción de RNA por ultracentrifugación en gradiente de CICs (modificado de 9). 1. Homogeneizar el tejido en CTC, Tris-CIH, 2-ME. 2. Añadir sarcosil y centrifugar a 5.000 g, 10 min. 3. Hacer pasar el sobrenadante por una jeringa. 4. Colocarlo en un colchón de CICs y centrifugar a 30.000 g, 15 h. 5. Lavar el pellet con etanol y resuspender en Tris-EDTA. 6. Precipitar con etanol y centrifugar. 7. Lavar de nuevo con etanol y resuspender en agua tratada con DEPC. 148 ANALISIS DEL RNA Acidos nucléicos polisacáridos Sales Proteínas 1 Además, ha probado ser particularmente útil para aislar RNA de muestras tan pequeñas como suspensiones de 10 6 células o 3 mg de tejido. Una vez extraído el RNA del tejido, células aisladas o en cultivo, pasamos a describir los distintos métodos de detección de los mRNAs específicos. Fase acuosa N O R T H E R N BLOT El «northern blot» es el método más usado para el estudio de la expresión génica. Para realizar un northern blot, una vez extraído el RNA, debe ser fraccionado en función de sus tamaños en gel desnaturalizante de agarosa, transferido a un filtro de nitrocelulosa y sondado. Lípidos Fase orgánica El gel de agarosa/formaldehído Fig. 2B. nuevo, las etapas siguientes están destinadas a purificar cada vez más el RNA mediante precipitaciones a baja temperatura con alcoholes (como etanol e isopropanol) y centrifugaciones secuenciales, produciendo un «pellet» cada vez más libre de contaminantes (polisacáridos, sales, etc). Varios son los métodos de extracción fenólica de RNA desarrollados desde los años 60, pero en la actualidad el método de fenol caliente de Feramisco 11 y el de fenol-cloroformo de Chomczynski 1 4 (tabla II) son quizás los más extendidos. Ambos métodos tienen rendimiento y pureza de RNA similares (aunque menores que en el método con ultracentrífuga). Con ambos pueden manipularse muchas muestras simultáneamente; sin embargo, el método de Chomczynski tiene la ventaja de ser más rápido que el de fenol caliente y, al tener menos etapas de manipulación, la posibilidad de degradación es menor, por lo que suele considerarse como el método de elección. El gel de agarosa/formaldehído es un sistema sencillo de electroforesis desnaturalizante que permite, con buena resolución, la separación por tamaños del RNA de cadena simple. Para proteger las muestras de las RNasas debemos mantener el material para su realización en agua con DEPC al 1 % durante unas horas; esto incluye el aparato de electroforesis horizontal, peines y material auxiliar. Dada la toxicidad del DEPC y del formaldehído, es conveniente realizar el proceso en campana de seguridad de gases. Se cargan entre 5 y 20 microgramos de RNA por pocillo, a los que previamente se les ha añadido el tampón de carga con formamida, formaldehído, bromuro de etidio, colorante para seguir la electroforesis y glicerol o sacarosa que aumente la viscosidad de la muestra y evite su difusión en el tampón de electroforesis. Antes de cargar la muestra debe ser calentada (hervida un minuto, por ejemplo) para separar las distintas hebras de RNA que aleatoriamente pudieran haber hibridado parcialmente entre sí. El gel se «corre» a bajo voltaje (unos 40-50 voltios) durante las horas que sea necesario y que, obviamente, dependen del tamaño del gel. Un procedimiento alternativo usa concentraciones más bajas de formaldehído y la electroforesis se lleva a cabo en menos de dos horas. Tabla ll. Protocolo resumido del método de extracción de RNA con fenolcloroformo (modificado de 14). 1. Homogeneizar el tejido en solución D (GTC, citrato, sarcosiI y 2-ME). 2. Añadir acetato sódico, fenol y cloroformo. Agitar. 3. Centrifugar y recoger la fase acuosa. 4. «Pelletear» con isopropanol 2 veces. 5. Lavar con etanol. 6. Resuspender el RNA en agua tratada con DEPC. Transferencia del RNA al filtro de nitrocelulosa Una vez obtenido el gel, se enjuaga con solución salina SSC 10X, para eliminar el formaldehído, y a continuación se coloca el sistema de transferencia como aparece en la figura 3, empapando previamente papel Whatman 3MM en la solución anteriormen149 A. HERNANDEZ y cols. tura y fuerza iónica (SSCPE) según el grado de homología de la sonda con el RNA de la muestra. Como referencia, cuando el DNA de la sonda es de la misma especie (sonda humana, RNA humano), podemos lavar 2 horas a 65º C, 0,1X SSCPE, 0,1 % SDS, y cuando son de especies diferentes (rata y humana, por ejemplo) 55º C y entre 0,2 y 0,5X SSCPE pueden considerarse como variaciones correctas. Una vez lavado el filtro, se deja secar entre papel Whatman y se coloca para la autorradiografía. La exposición varía de horas a días, dependiendo de la calidad de la sonda y cantidad del mensaje buscado. Interpretación de un northern blot Con el northern blot podemos saber si un gen se expresa o no, cuántos mensajes tiene (especies de mRNA), qué tamaño tiene cada especie y con qué intensidad se expresa (abundancia de mRNA). Estas respuestas se obtienen para cada tejido del que hemos colocado RNA, que puede ser a su vez muestra de diversas etapas del desarrollo (fig. 4). En el caso de la (Na,K)-ATPasa, la diversidad en la expresión de las isoformas en los distintos tejidos y distintas etapas del desarrollo nos sugiere que la subunidad alfa de esta proteína pudiera tener diversas formas de actuación y estar sometida a distintos sistemas de regulación según las necesidades durante el desarrollo o de acuerdo con la fisiología particular de un determinado órgano. Fig. 3.-Montaje para la transferencia de RNA (Northern blotj mediante capilaridad. te dicha utilizado y humedeciendo con agua la nitrocelulosa. El dispositivo de la figura 3 debe dejarse montado durante 12 horas a temperatura ambiente. La transferencia se lleva a cabo por capilaridad. Transcurrido este período, desmontamos el sistema, lavamos el filtro y, para fijar el RNA a éste, lo colocamos entre varias hojas de papel Whatman 3MM, lo envolvemos en papel de aluminio y lo secamos en horno a 80º C durante 2 horas. Cuando miramos la nitrocelulosa con luz UV veremos en las carreras de RNA dos manchas más grandes; son los rRNA de 18 y 28s, qu e debemos marcar en el filtro para tener como referencias del tamaño de los mensajes. El rRNA 18s tiene 2,0 kb y el rRNA 28s 5,1 kb. Una vez que hemos tratado el filtro con alguna solución de prehibridación o hibridación, estas manchas desaparecen; por ello es importante marcar estas referencias en este momento. ENSAYO DE PROTECCION DE RNASA (RPA) Entre los métodos de análisis de RNA existen dos técnicas basadas en reacciones de hibridación en solución: el ensayo de la nucleasa S1 y el ensayo de protección de RNasa (RPA). Dado que los fundamentos de ambos procedimientos tienen muchos puntos en común, describiremos la técnica más usada, el RPA, y finalmente se hará un comentario breve acerca del ensayo con nucleasa S1 El RPA se basa en dos principios (fig. 5): 1) la obtención de sondas de RNA complementario (cRNA, anti-sense), mediante reacciones de transcripción in vitro; 2) las ribonucleasas A y Tl digieren RNA monocadena, pero no duplexes de RNA. Por tanto, si una sonda de cRNA es hibridada en solución con el mRNA a analizar y posteriormente se digiere la mezcla con RNasas A y/o Tl, las moléculas de la sonda que hayan formado híbridos quedarán «protegidas» de la digestión con RNasas. Si la hibridación se llevó a cabo en exceso molar de sonda, el número de moléculas de cRNA protegidas será un fiel reflejo del número de moléculas de mRNA, por lo que el RPA es un test cuantitativo de análisis de RNA. Hibridación con la sonda, lavados del blot y autorradiografía Una vez tratado el filtro con la solución de prehibridación, se incuba con la sonda marcada radiactivamente por cualquiera de los métodos conocidos 11,15 no habiendo diferencias esenciales entre los procedimientos de hibridación de northern y southern. Los lavados del filtro después de la hibridación se realizan en SSCPE y 0,1 % SDS, variando la tempera150 ANALISIS DEL RNA etapas del desarrollo; en el margen izquierdo, los marcadores 28s y 18s, que nos servirán de referencia para el tamaño, yen el margen derecho, la isoforma a que correponden los datos obtenidos (alfa-l, alfa-2 y alfa-3). La isoforma a l f a - l presenta una única especie de mensaje, de 4,5 kb, la alfa-2 tiene dos mensajes, uno de 4,3 kb y otro de 6 kb y la alfa-3 uno de 4,5 kb. El cerebro del feto parece que sólo expresa la alfa-l, el neonato y el adulto expresan Fig. 4.-Northern blot de las isoformas alfa-l, alfa-2 y alfa-3 de esta subunidad de la (Na,K)-A TPasa de rata en cerebro, corazón, rinón e hígado yen tres etapas de desarrollo: fetal, neonatal y adulta En la parte superior de la figura observamos la lectura de los tejidos y k fig. 5.-Esquema de RPA. las muestras son hibridadas en solución con la sonda de cRNA (marcada -*-, con cola de plásmido-), de modo que es protegida en la porción complementaria al mRNA por aquella muestras que contengan el transcrito de interés. Tras d i g e s t i ó n con RNasa, Ia electroforesis en acrilamida revela una banda de tamaño algo inferior al cRNA sin tratar con RNasa sólo si existe mRNA específico en la muestra. Las calles reflejan, de i z q u i e r d a a derecha: 1) control con cRNA pero sin RNasa; 2) muestra con mRNA complementario a la sonda; 3) control con tRNA en lugar de mRNA; 4) control sin muestra. la alfa-2; el del neonato, sólo la alfa-l, y el adulto, alfa-l y alfa-í. El riñón del feto expresa las isoformas 1 y 2 de la subunidad alfade la (Na,K)-ATPasa, el del recién nacido la 1y la 3 y el del adulto, las tres isoformas, aunque la forma predominantemente renal es la alfa-l. Los niveles de expresión hepáticos so" muy bajos; só- las tres isoformas, aunque con mayor intensidad, la predominante, es la alfa-2. En el corazón fetal se expresa la alfa-l y, ligeramente, lo el hígado del neonato expresa las tres isoformas; el del adulto sólo la alfa-3. Un elemento clave en la realización del RPA consiste en generar sondas de cRNA marcadas a alta actividad específica. Para ello, el cDNA de interés ha de ser clonado en un vector de expresión (pGEM, pBluescript, pET, etc.) en orientación anti-sense con respecto al promotor de la RNA polimerasa. Este plásmido es posteriormente linearizado mediante digestión con enzima de restricción cuya diana se localice a unas 100-500 bp desde el promotor (cortando bien dentro del cDNA o distal a él, en el vector). De este modo aseguramos que las moléculas de RNA generadas mediante transcripción in vitro usando el plásmido linearizado como molde tengan una longitud homogénea. Las condiciones para la transcrip- ción in vitro fueron optimiradas por el grupo de Maniatis 1 6 haciendo uso de RNA polimerasa de bacteriófago previamente purificada por otros 17. En la actualidad disponemos comercialmente de RNA polimerasas de distintos bacteriófagos (SP6, T7 y T3) que presentan una alta especificidad por sus respectivas secuencias promotoras. Este hecho facilita el que a partir de un mismo plásmido, en el que el cDNA esté clonado entre los promotores de SP6 y T7 (figura 6), por ejemplo, sea posible generar in vitro tanto cRNA (sonda complementaria al mRNA) como mRNA en sí, dependiendo de que utilicemos la RNA polimerasa, cuyo promotor está «anti-sense» o «sense», respectivamente, en relación al cDNA. Una vez preparada la sonda de cRNA, de longitud homogénea, se procede a hibridarla en fase líquida, con soluciones del RNA fisular sometido a estudio (tabla III). Como control negativo se suele utilizar tRNA de levadura. El fundamento de la técnica RPA reside en que las RNasas A y Tl digieren solamente RNA monocadena, mientras que en los híbridos 151 A. HERNANDEZ y cols Fig. 6.-Esquema de la síntesis de cRNA mediante transcripción in vitro (izquierda). Dependiendo del promotor usado en la transcripción, se puede sintetizar bien cRNA (anti-sense) o mRNA (sense); en el ejemplo ilustrado a la derecha, el promotor T7 genera RNA anti-sense, mientras que el SP6 genera RNA sense mRNA-cRNA la sonda de cRNA queda protegida de la digestión enrimática. Generalmente, las sondas de Tabla III. Protocolo de RPA (modificado de 9). 1. Preparar sonda de cRNA marcada con 32P mediante transcripción in vitro, ver «análisis del DNA I » ) . 2. Digerir el cDNA, usado como molde en la transcripción in viro, con DNasa libre de RNasa. 3. Extracción fenólica y precipitación con etanol en presencia de acetato amónico. Resuspender pellet en pequeño volumen de H 20 (50 µ l , tratado con DEPC) y repetir la precipitación. Resuspender en 50 µl y contar 1µl en contador de centelleo. 4. Precipitar 10 ug RNA motivo de estudio. En un tubo control, precipitar una cantidad similar de tRNA. 5. Resuspender pellets de RNA en 30 uI solución de hibridación (80 % Formamida, 40 mM PIPES pH 6,4,400 mM NaCI, 1 mM EDTA) que contenga un total de 0,5 10 cpm de sonda. 6. Desnaturalizara 85 ºC durante 5 minutos. 7. Hibridar a 45 ºC durante toda la noche. La temperatura de hibridación óptima puede variar según temperatura de la sonda. 8. Añadir 350 µl de mezcla con RNasa (10 mM Tris HCI, pH 7,5, 300 mM NaCI, 5 mM EDTA, 40 µg/ml RNasa A, 2 µg/ml RNasa T1-opcional-) e incubara 70 ºC durante 30-60 minutos. 9. Añadir 20 µl de 10 % SDS y 5 µl de 10 mg/ml proteinasa K. Incubara 37 ºC durante 15 minutos. 10. Extracción fenólica y precipitación con etanol en presencia de 10 ug de tRNA (carrier). 11. Resuspender pellets en solución de carga de RNA (con 80 % formamida) y someter a electroforesis en gel de acrilamidaurea. 12. Autorradiografia y cuantificación (densitometría o contaje de bandas). * Alternativamente 11 ) en a la elertroforesis se puede resuspender el pellet (punto H2O y colocar alícuotas en filtros GF/c, que se someten a contaje previo lavado con soluciones de tricloroacético, para eliminar los nucleótidos no incorporados y productos de digestión de la sonda. cRNA producidas in vitro incluyen una pequeña cola de secuencia que no es propia del inserto (cDNA de interés) sino del vector de expresión (distancia entre el inicio de transcripción y la diana de restricción donde el cDNA fue clonado). Este hecho añade un ventajoso control. interno al ensayo: si la digestión con RNasas procedió normalmente, la sonda de cRNA debe disminuir ligeramente de tamaño, ya que sólo las secuencias complementarias a mRNA son protegidas. En el control hibridado con tRNA de levadura, la sonda es degradada por las RNasas completamente. Uno de los problemas más frecuentes con el RPA es que la digestión con RNasas sea parcial, lo que resulta en un alto fondo inespecífico, con señal incluso en el control con tRNA. La causa más frecuente de este problema no es que la RNasa esté fracasando (aunque sería una posibilidad a investigar) debido a que se trata de un enzima muy estable. Es más frecuente que altos fondos inespecíficos se deban a que, durante le preparación de la sonda de cRNA, la digestión del plásmido después de la transcripción in vitro, sea incompleta. Como consecuencia, este cDNA co-purifica con la sonda y la protege de la digestión con RNasas sin necesidad de que exista mRNA específico en el medio. Este problema se suele solucionar con el uso de DNasa 1 en buen estado, prolongando la incubación durante varias horas. Otras veces es preciso purificar la sonda de cRNA mediante electroforesis en gel de acrilamida para librarnos del cDNA. Otro problema encontrado con relativa frecuencia en el RPA es que la sonda de cRNA tenga un tamaño 152 ANALISIS DEL RNA variable, lo que da lugar a que se observen múltiples bandas protegidas en la autorradiografía. La causa de estas sondas incompletas puede deberse a contarninación con RNasas o a paradas de la RNA polimerasa antes de llegar al final. Hay que tener presente que en esta técnica trabajamos con RNA o RNasas en distintas fases de la misma y es fundamental que no contaminemos con RNasas las muestras, las sondas, la solución de hibridación, etc. Los parones de la RNA polimerasa durante la transcripción in vitro se asocian a determinadas secuencias en el cDNA y se ven favorecidos por la baja concentración de nucleótido-trifosfato marcado. La mejor manera de evitarlos es diseñando sondas cortas, de menos de 500 bp (cDNAs de 100-300 bp dan transcritos de tamaño muy homogéneo). El análisis con nucleasa S1 comparte el esquema fundamental con el RPA, pero en este caso la sonda utilizada es de DNA monocadena, y el enzima que se utiliza para digerir la sonda que no haya sido protegida por mRNA es la nucleasa S1, una endonucleasa que corta DNA monocadena (no-apareado). El análisis con nucleasa S1 goza de múltiples aplicaciones en el estudio de la organización exón-intrón de genes y en la definición de regiones promotoras y del punto de inicio de transcripción. También se puede utilizar para cuantificar un mRNA de interés, pero en este sentido el RPA es preferible porque la sonda es más fácil de preparar y se consiguen marcados más h o m o g é n e o s y de mayor actividad específica. A d e m á s , la digestión de sonda no protegida con RNasas en el RPA es más eficaz y segura que la digestión con nucleasa S1, que es más sensible a cambios de temperatura, concentraciones enzimáticas y dependiente de pH bajo. Fig. 7.-Etapas implicadas en la detección de mRNA por RJ-PCR. Nótese que en la etapa de PCR s ó l o se amplifica un cDNA especifico mediante una adecuada pareja de primers METODO RT-PCR La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es un método para amplificar de un modo eficiente y rápido fragmentos de DNA mediante Taq DNA polimerasa. Puesto que la PCR produce una amplificación, para detectar un mRNA celular bastaría con someterlo a este proceso y, por poco abundante que fuera, podría al final visualizarse con un método de tinción adecuado. Sin embargo, la Taq polimerasa sólo es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de DNA, y es necesario entonces generar primero una cadena de DNA complementario (cDNA) a partir del mRNA mediante una DNA polimerasa dependiente de RNA, enzima conocida como transcriptasa inversa o RT (Reverse Transcriptase). En conjunto (fig. 7), el método RT-PCR (llamado así por el paso de transcripción inversa previo a la PCR), o RNA-PCR, consiste primero en una extracción de RNA a partir del tejido en el que se quiere estudiar la expresión de un mensajero. Teniendo en cuenta que existirá al final una etapa de amplificación específica, no es necesario que el RNA tenga un alto grado de pureza ni que la cantidad de RNA sea grande, de modo que los métodos de extracción fen ó l i c a son bastante adecuados y permiten estudiar gran cantidad de muestras simultáneamente. El siguiente paso es la síntesis de una cadena de cDNA a partir del mRNA mediante una RT. Para ello se aprovecha la presencia de la cola poli(A) de los mensajeros y se utiliza como cebador un oligonucleótido sin153 A. HERNANDEZ y cols. tético de polideoxitimidina (oligo[dT]) que se une a las colas de poIi(A) Puesto que esta cola es una característica casi universal en los distintos tipos de mRNAs, tendremos entonces una muestra de moléculas de cDNA representativa de los tipos de mensajeros expresados en ese tejido. Seguidamente se toma de esa solución una alícuota y se somete a una reacción de PCR utilizando una pareja de cebadores o «primers» específica del mRNA de interés, y si la eleccion de los primers y de las temperaturas del proceso han sido adecuadas, tendremos en torno a 106 moléculas de DNA idénticas correspondientes a un fragmento del mRNA específico que queremos detectar. La detección de este producto amplificado se realiza mediante electroforesis en gel. Hay que destacar el hecho de que tras la transcripción inversa disponemos de una mezcla de cDNAs representativos de las distintas especies de mRNA'S celulares y que podemos tomar de ahí alícuotas para estudiar por PCR diferentes transcritos simultáneamente (siempre que elijamos para cada mensajero una pareja específica de primers). Síntesis de cDNA Tras la extracción de RNA es necesario fabricar cDNA que pueda servir de sustrato para la PCR. Esto se consigue mediante una enzima extraída originariamente de ciertos retrovirus, la transcriptasa inversa (RT), que utiliza como molde una molécula de RNA a la que se ha unido un pequeño fragmento de DNA que actúa como cebador (en nuestro caso, oligo-dT de unos 15 nucleótidos de longitud). La enzima copiará sólo los mRNA (que son los únicos que poseen extremo poli[A]) y lo hará en sentido 3'-5' del mRNA. Dependiendo de lo óptimas que sean las condiciones de la reacción, el cDNA será de longitud más o menos completa (según acabe más o menos cerca del extremo 5' del mRNA) (fig. 8A). Sin embargo, para el método RT-PCR la calidad de la síntesis de cDNA no necesita ser tan alta como la requerida para la construcción de genotecas de cDNA. Aunque haya muy poca abundancia de cadenas de cDNA de longiud completa («full length cDNA»), éste es un hecho irrelevante, ya que bastará conque la síntesis progrese hasta la región a la que luego se unirán los dos primers durante la PCR, y las cadenas de cDNA que no lleguen a esa zona se perderán durante la amplificación. Tampoco es necesario generar mediante la RT una segunda cadena de cDNA complementaria a la primera, como ocurre para la construcción de genotecas de cDNA, ya que esa cadena será generada por la Taq polimerasa durante el primer ciclo de la PCR. Existen dos tipos de transcriptasas inversas disponibles comercialmente: a) la de MMLV(Moloney Muri154 Fig. 8.-A) Para poder detectar un mensajero por PCR basta con que la síntesis de su cDNA progrese hasta el lugar de unión a los primers; el resto se perderán. 6) Formas de cebar la reacción de síntesis de cDNA. ne L e u k e m i a V i r u s ) , y b ) la d e A M V (Avian Myeloblastosis Virus). Ambas funcionan in vitro bajo condiciones similares y tienen aproximadamente la misma eficiencia, de modo que la elección de la enzima no parece ser crucial para el éxito del método RT-PCR 19. Aunque la calidad de estas enzimas es generalmente buena, la cantidad de RNasa contaminante varía con el proveedor y es necesario incluir en la reacción potentes inhibidores de RNasas como v a n a d y l - r i b u n u c l e ó s i d o s o RNasin, que por su alta especificidad por las RNasas no afectan a la RT (10, p. 24). Para más detalles sobre los requerimientos de la reacción se pueden consultar otros textos 10,11. En la tabla IV se muestra un protocolo típico de transcripción inversa para RT-PCR. Una especial atención merece el cebador (primer) utilizado para la transcripción inversa. Existen al menos tres formas de cebar la reacción (fig. 8B): con «random primers» (hexanucleótidos con secuencias al azar), con oligo (dT) o con un oligonucleótido esp e c í f i c o . El uso de un cebador específico de un mRNA se evita casi siempre, ya que el cDNA resultante no puede ser usado como molde para estudiar