NEFROLOGIA. Vol. XV. Suplemento 2. 1995 BIOLOGIA MOLECULAR Análisis del DNA III: Mapping genético y mapping físico Departamento de Anatomía Patológica. Universidad de La Laguna. Tenerife. Department of Pediatrics and Genetics. UCSF (San Francisco,-USA). E. Salido ANALISIS DNA III El conocimiento de la localización exacta de un gen determinado dentro del genoma es un paso muy importante para llegar a conocer la relación existente entre este gen y un fenotipo concreto. La actividad enfocada a localizar un gen en el genoma, conocida como «gene mapping» es una de las áreas de más rápido crecimiento en Medicina en el momento presente. Esto se debe en parte a que se pueden aislar genes asociados a enfermedades en virtud de su mera posición en el genoma, sin necesidad previa de identificar y purificar las proteínas alteradas en dichas enfermedades, sin conocer ni siquiera las rutas metabólicas o defectos bioquímicos implicados. Esta estrategia posicional1 ha sido muy fructífera en el esclarecimiento de las bases moleculares de enfermedades y es conocida también como «Genética Reversa» (fig. 1). Entre las enfermedades renales cuyo gen responsable está siendo definido mediante una estrategia posicional se encuentran la enfermedad poliquística renal autosómica dominante (ADPKD) 2 (que será tratada en un número futuro de NEFROLOGÍA), la enfermedad de Hippel-Lindau 3, la fiebre mediterránea familiar 4 , varias formas de esclerosis tuberosa 5 , 6 , y los síndromes de Rubinstein-Taybie 7 y de Alaguille 8. Para otras enfermedades con repercusión renal, el gen responsable ya ha sido clonado, haciendo uso de esta estrategia posicional en mayor o menor medida. Este es el caso del tumor de Wilms 9 (no todos los casos) y una serie de síndromes ligados al cromosoma X, tales como el de Alport 10, el de Lowe 11, el de Kallman 12 y la diabetes insípida nefrogénica 13. La información sobre la posición de genes a lo largo de los cromosomas humanos es relevante no sólo para llegar al aislamiento final de genes de interés sino también para un diagnóstico y consejo genéticos. Existen esfuerzos internacionales dedicados a construir un mapa genético que permita finalmente catalogar todos los genes del hombre y las enfermedades asociadas a los mismos. Esencialmente disponemos de dos vías para ordenar genes a lo largo de cromosomas mapping genético y mapping físico. 1. MAPPING GENETICO Consiste en la estimación de la tendencia de dos genes a segregarse juntos (ligamento) durante la meiosis en estudios de familias. La meiosis resulta en gametos haploides que tienen un solo ejemplar de cada pareja de cromosomas (fig. 2). Los alelos de loci en cromosomas no-homólogos (cromosomas homólogos son los componentes de una pareja de cromosomas) se segregan, es decir pasan a las células haploides, independientemente durante la meiosis (fig. 3), mientras que los alelos de loci próximos entre sí, en el mismo cromosoma, tienden a heredarse «en bloque» (ligados). Pero no todos los alelos en un mismo cromosoma se heredan ligados debido a la existencia de recombinación (cross-over) (fig. 2), un mecanismo base de la variabilidad genética. La distancia entre dos loci se puede estimar analizando el comportamiento de los mismos genes durante un número de meiosis y determinando, en términos estadísticos, qué grado de ligamiento existe entre ellos. Este método no proporciona unidades físicas de distancia (kb: kilobase, mil pares de bases; Mb: megabase, un millón de pares de bases...) sino unidades de recombinación genética: se dice que la distancia entre dos genes es un centimorgan (1 cM) si se detecta recombinación entre ellos en el 1 % de las meiosis estudiadas. Ahora bien, cuanto más próximos estén dos genes a lo largo del cromosoma, menos será el porcentaje de recombinaciones observadas. Mientras que los procedimientos de mapping físico son cruciales a la hora de clonar genes y determinar sus secuencias, el gran interés suscitado por los estudios de ligamiento genético deriva de que, además de ser el primer paso en la clonación de muchos genes, constituye una herramienta diagnóstica excelente. Mediante análisis de ligamiento genético se pueden diagnosticar los estados de portador y enfermo no sólo de enfermedades cuyo gen responsable ha sido clonado, sino también de aquellas muchas otras en que aún no conocemos la secuencia del gen afecto. Correspondencia: Dr. Eduardo Salido Ruiz. Departamento de Anatomía Patológica. Facultad de Medicina (Universidad de La Laguna). 44 BIOLOGIA MOLECULAR ANIMA; TRANSGENICO LOCALIZACION DEL GEN DENTRO DEL CENOMA CLASICA ` I DEFINICION DE LA FUNCION ANORMAL MAPEO \-, `\CLONACION / PURIFICACION l4 Fig. 1.-Diagrama de las estrategias funcional (clásica) y posicional (reversa) para la clonación de genes responsables de enfermedades. A B A B Metafase I... -Telofase ll 0 A a 4 a Profase I (Sinapsis) b 0 a CrOSSing-OW b Fig. 14.-Efecto negativo del desconocimiento de la fase en el análisis del ligamiento. El pedigree de una familia con enfermedad autosómica dominante investigada con un marcador muy próximo al gen responsable no permite conocer la fase cuando sólo contamos con DNA de los padres y los hijos (A): tan probable es que el alelo 7 esté en cis con la mutación (E), como que lo esté el alelo 2. Si el primer caso es cierto (E-1), los tres hijos serían recombinantes, mientras que si la fase es E-2, ninguno de los hijos sería recombinante. Si asumimos la fase E-2 (con una probabilidad, a priori, 1/2), la probabilidad de que exista ligamiento (para 0 = 0, no recombinantes) entre marcador y gen responsable es el producto de las probabilidades de cada genotipo encontrado: P(Ee) x P(ee) x P(Ee) = 1/2 x 1/2 x 1/2 = 1/8. Como esta es una de las dos posibles fases, la probabilidad de ligamiento es 1/2 x 1/8 = 1/16. La probabilidad de no-ligamiento (0 = 0,5) es P (Ee y 1,2) x P(ee y 1,1) x P(Ee y 1,2). Puesto que en este caso (no-ligamiento) existe segregación independiente, P(Ee y 1,2) = P(Ee) x P(1,2) = 1/4. Por tanto, P (no ligamiento) = 1/4 x 1/4 x 1/4 x/164. Si calculamos el cociente de las probabilidades = 1/16 entre 1/64 = 4. Por tanto, el LOD, Z = log 4 = 0,6. Supongamos que tenemos acceso al DNA de los abuelos (B), y podemos establecer que la fase es E-2 con seguridad. Ahora, P (ligamiento) = 1/8 y el cociente de las probabilidades = 1/8 entre 1/64 = 8, por lo que Z = 0,9. ciones significativas en los datos obtenidos. El método estadístico diseñado para comprobar lo significativo de aparentes asociaciones fenotipo-genotipo es el análisis de la probabilidad de ligamiento 2 4 . Análisis de la probabilidad de ligamiento Con un programa de ordenador (LINKAGE, por ejemplo) se calcula cómo de probable es que se den los resultados observados en el estudio fenotipo-genotivo de la familia si el marcador utilizado (M) está a una distancia genética entre 0 y 50 cM del gen responsable de la enfermedad (E), es decir para fracciones de recombinación (0) entre 0 y 0,5. Estas probabilidades, calculadas para cada valor de 0, se comparan con la probabilidad de que se den los resultados observados si no existiera ligamiento entre M y E, es decir que la distancia entre M y E fuese tan grande que se segregarían independientemente en la meiosis resultando en un 50 % de gametos recombinantes (0 = 0,5). La división de la probabilidad de ligamiento partido por la probabilidad de no ligamiento (odds ratio) se calcula para cada valor posible de 0 y se presenta como el logaritmo decimal del cociente, lo que se denomina valor LOD (log odds) o Z. Valores positivos de Z sugieren que existe ligamiento entre M y E, con tanta mayor probabilidad cuanto mayor sea Z. En cada familia analizada, los valores Z obtenidos al realizar los cálculos para cada valor de 0 varían en torno a un punto donde Z es máximo: existe una probabilidad máxima de ligamiento si M y E se encuentran a esa distancia genética (valor 0 para el que Z es máximo). No es raro que los valores para los que Z es máximo varíen algo entre distintas familias, pero como Z es un logaritmo se puede calcular la suma de los Z para cada 0 en tantas familias genéticamente homogéneas como sea posible. En la práctica se acepta que un valor Z > 3 es evidencia 53