LA CICLOSPORINA A ORIGINA ESTRÉS OXIDATIVO Y DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN CÉLULAS TUBULARES RENALES
CYCLOSPORIN A CAUSES OXIDATIVE STRESS AND MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION IN RENAL TUBULAR CELLS
Jaime Pérez de Hornedo, Gabriel de Arriba, Miryam Calvino Fernández, Selma Benito Martínez, Trinidad Parra Cid
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Benito Martínez, T Parra Cid.</p><p class="elsevierStylePara">Unidad de Investigación y Sección de Nefrología<span class="elsevierStyleSup">*</span> del Hospital Universitario de Guadalajara. <span class="elsevierStyleSup">*</span>Departamento de Medicina. Universidad de Alcalá de Henares. </p><p class="elsevierStylePara">Dirección para la correspondencia:</p><p class="elsevierStylePara">Trinidad Parra Cid.</p><p class="elsevierStylePara">Unidad de Investigación.</p><p class="elsevierStylePara">Hospital Universitario de Guadalajara.</p><p class="elsevierStylePara">C/ Donante de sangre s/n.</p><p class="elsevierStylePara">19002. Guadalajara. España.</p><p class="elsevierStylePara">Tel: 00-34-949-209216.</p><p class="elsevierStylePara">FAX: 00-34-949-209216.</p><p class="elsevierStylePara">e-mail: <a href="mailto:trpaci@sescam.jccm.es" class="elsevierStyleCrossRefs">trpaci@sescam.jccm.es</a></p><p class="elsevierStylePara">RESUMEN: </p><p class="elsevierStylePara">Estudiamos el efecto de la ciclosporina A (CsA) sobre la estructura y función mitocondrial en células LLC-PK1. Las células se incubaron durante 24 horas con CsA 1mM y se analizó la producción de anión superóxido, contenido de NAD(P)H, oxidación de cardiolipina y potencial de membrana mitocondriales; además se estudió la formación de radicales libres y el contenido de glutation reducido intracelular.</p><p class="elsevierStylePara">Nuestros resultados demuestran que la CsA provocó un aumento del anión superóxido mitocondrial de modo paralelo al descenso de NAD(P)H; además, se produjo oxidación de la cardiolipina de la membrana interna y un descenso del potencial de membrana mitocondrial. Finalmente, observamos un aumento de la producción de radicales libres intracelulares y un descenso del glutation reducido.</p><p class="elsevierStylePara">En conclusión, la CsA produce modificaciones importantes en la fisiología y estructura mitocondrial con aumento de la síntesis de especies reactivas de oxígeno y descenso de la capacidad antioxidante que puede justificar la toxicidad celular de la droga.</p><p class="elsevierStylePara">Palabras clave: Ciclosporina A, mitocondria, especies reactivas de oxígeno, anión superóxido, cardiolipina.</p><p class="elsevierStylePara">SUMMARY: Cyclosporin A causes oxidative stress and mitochondrial dysfunction in renal tubular cells.</p><p class="elsevierStylePara">Reactive oxygen species (ROS) have been implicated in cyclosporin A (CsA) nephrotoxicity. As mitochondria are one of the main sources of ROS in cells, we evaluated the role of CsA in mitochondrial structure and function in LLC-PK1 cells.</p><p class="elsevierStylePara">We incubated cells with CsA 1 µM for 24 hours and studies were performed with flow citometry and confocal microscopy. We studied mitochondrial NAD(P)H content, superoxide anion (O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span>) production (MitoSOX Red), oxidation of cardiolipin of inner mitochondrial membrane (NAO) and mitochondrial membrane potential (DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3)). Also we analyzed the intracellular ROS synthesis (H<span class="elsevierStyleInf">2</span>DCF-DA) and reduced glutation (GSH) of cells.</p><p class="elsevierStylePara">Our results showed that CsA decreased NAD(P)H and membrane potential, and increased O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> in mitochondria. CsA also provoked oxidation of cardiolipin. Furthermore, CsA increased intracellular ROS production and decreased GSH content.</p><p class="elsevierStylePara">These results suggest that CsA has crucial effects in mitochondria. CsA modified mitochondrial physiology through the decrease of antioxidant mitochondrial compounds as NAD(P)H and the dissipation of mitochondrial membrane potential and increase of oxidants as O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span>. Also, CsA alters lipidic structure of inner mitochondrial membrane through the oxidation of cardiolipin. These effects trigger a chain of events that favour intracellular synthesis of ROS and depletion of GSH that can compromise cellular viability.</p><p class="elsevierStylePara">Nephrotoxic cellular effects of CsA can be explained, at least in part, through its influence on mitochondrial function.</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara">Keywords: Cyclosporin A, mitochondria, NAD(P)H, superoxide anion, cardiolipin, reactive oxygen species.</p><p class="elsevierStylePara">INTRODUCCIÓN.</p><p class="elsevierStylePara">La ciclosporina A (CsA) es una droga inmunosupresora ampliamente utilizada para la prevención del rechazo del trasplante, así como en el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes (1, 2). Su principal efecto secundario es la nefrotoxicidad, que puede ser aguda o crónica (3). La toxicidad aguda suele aparecer en las primeras semanas de tratamiento y se manifiesta por deterioro de función renal, siendo la mayoría de las veces reversible al reducir la dosis del fármaco (4). La toxicidad crónica produce una alteración progresiva de la función renal e histológicamente se observan lesiones arteriolares, fibrosis intersticial y atrofia tubular (5, 6).</p><p class="elsevierStylePara">Los mecanismos fisiopatológicos de la nefrotoxicidad por CsA han sido muy estudiados y se han implicado varios mediadores como el sistema renina-angiotensina aldosterona, factor activador de las plaquetas, endotelina y eicosanoides (7-9). Nosotros hemos demostrado que la CsA aumenta la síntesis glomerular y la excreción urinaria de tromboxano en ratas, sugiriendo que este eicosanoide puede tener un papel relevante en la afectación renal (10).</p><p class="elsevierStylePara">También existen estudios que implican a las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la nefrotoxicidad provocada por la CsA (11-14). Nuestro grupo ha demostrado que los glomérulos aislados de ratas tratadas con CsA mostraron un aumento de la síntesis de anión superóxido (O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span>) y de agua oxigenada (H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>) y este fenómeno sucedió de un modo paralelo al deterioro de función renal que sufrieron los animales (10, 11). Además, cuando les suministramos el antioxidante vitamina E (Vit E) en la dieta, se evitó el deterioro de función renal y el aumento de ROS glomerular (10, 11). En experimentos realizados en células mesangiales humanas confirmamos que la CsA aumenta la síntesis in vitro de ROS y que la preincubación con Vit E neutraliza este efecto (12, 13).</p><p class="elsevierStylePara">Nuestra hipótesis postula que la CsA aumenta la producción ROS que, probablemente a través de la peroxidación de lípidos de membrana, condicionan la liberación de vasoconstrictores como el tromboxano A<span class="elsevierStyleInf">2</span> originando, en última instancia, deterioro de función renal (10-16).</p><p class="elsevierStylePara">No obstante, hasta el momento no se han establecido los mecanismos íntimos por los que se produce el aumento de ROS en respuesta al tratamiento con CsA. Como las mitocondrias constituyen una de las principales fuentes de ROS en las células, nuestro objetivo ha sido investigar los efectos de la CsA sobre la función y estructura mitocondriales en células tubulares proximales porcinas (LLC-PK1) y su relación con la producción de ROS.</p><p class="elsevierStylePara">MATERIAL Y MÉTODOS.</p><p class="elsevierStylePara">1.- Cultivos celulares.</p><p class="elsevierStylePara">Se utilizaron células LLC-PK1 cultivadas en placas de 6 ó 24 pocillos (según se fueran a analizar por citometría de flujo o microscopía confocal) hasta un 80% de confluencia. Las células crecieron en un incubador a 37ºC con CO<span class="elsevierStyleInf">2</span> al 5% en medio de cultivo RPMI suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (STF) y con antibióticos (ampicilina 125 mg/ml, cloxacilina 40 mg/ml y gentamicina 125 mg/ml). Al alcanzar la confluencia se frenó el crecimiento de los cultivos sustituyendo el medio por otro de igual composición pero con 0.5% de STF. Las células fueron tratadas durante 24 horas con CsA diluida en RPMI (a partir de una solución de CsA en etanol 10<span class="elsevierStyleSup">-2</span> M) para obtener una concentración final de 1 mM. Las células controles fueron tratadas solamente con etanol. Los resultados se expresaron en Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (UAF).</p><p class="elsevierStylePara">2.- Estimación del contenido mitocondrial de NAD(P)H.</p><p class="elsevierStylePara">La cantidad de NAD(P)H está en relación con el estado redox del complejo I de la cadena de transporte electrónico mitocondrial y la oxidación del mismo refleja la liberación de electrones hacia moléculas de oxígeno provocando una interrupción del flujo normal de la cadena respiratoria y la síntesis de moléculas de anión superóxido (O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span>). Las células emiten autofluorescencia azul de modo proporcional a su contenido en moléculas de NAD(P)H cuando son excitadas con un láser ultravioleta (360 nm)(17). En nuestros experimentos, las células tratadas con CsA fueron tripsinizadas y resuspendidas en RPMI 0.5% y se adquirieron en un sorter (Facscan Plus, Becton Dickinson). Se analizó su autofluorescencia utilizando un filtro de paso de banda centrado en 450 nm tras excitación con el láser ultravioleta.</p><p class="elsevierStylePara">3.- Producción mitocondrial de anión superóxido (O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span>).</p><p class="elsevierStylePara">El O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> es el principal radical libre formado en la mitocondria. Su síntesis se determinó mediante microscopía confocal (Olympus XL) utilizando la sonda fluorescente MitoSOX Red (Molecular Probes, Leiden, Holanda). La sonda atraviesa libremente las membranas celulares y es oxidada específicamente por el O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> (18). Las células LLC-PK1 fueron incubadas directamente en las placas con 1 ml de solución de Hanks (HBSS, CaCl<span class="elsevierStyleInf">2</span> 140 mg/dl, MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span>-6H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O 10 mg/dl y MgSO<span class="elsevierStyleInf">4</span>-7H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O 10 mg/dl) y MitoSOX Red 5 mM durante 10 minutos y se lavaron dos veces. Se analizaron excitándolas con un láser de 530 nm y recogiendo la fluorescencia de emisión con un filtro de 580 nm.</p><p class="elsevierStylePara">4.- Peroxidacion lipídica mitocondrial.</p><p class="elsevierStylePara">La cardiolipina (CL) es el principal componente lipídico de la membrana interna mitocondrial y contribuye a mantener la estructura del orgánulo (19, 20). Las células se incubaron con 1 ml de RPMI con 0.5% STF en presencia del fluorocromo afín por la cardiolipina NAO (10-N-nonyl naranja de acridina, Molecular Probes), a una concentración de 100 nM durante 10 minutos a 37ºC. Tras dos lavados y excitación con un láser de 488 nm se detectó su fluorescencia a 530 nm mediante citometría de flujo.</p><p class="elsevierStylePara">5.- Estudio del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm).</p><p class="elsevierStylePara">El ΔΨm es consecuencia del paso de electrones a través de la cadena respiratoria, y su interrupción provoca una disminución del mismo. El DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3) es un sustrato lipofílico catiónico (3,3¿-diethyloxacarbocyanine iodide, Molecular Probes) que se emplea para detectar cambios en el potencial de membrana (21). Difunde libremente al citosol celular y se acumula preferentemente en las mitocondrias que tienen potencial de membrana activo, emitiendo fluorescencia a 530 nm y a 575 nm; su emisión fluorescente disminuye cuando se produce alteración del potencial de membrana mitocondrial. La suspensión de células LLC-PK1 se incubó en 0.5 ml de RPMI con 0.5% STF que contenía DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3) a una concentración final de 50 nM durante 15 minutos a 37ºC y CO<span class="elsevierStyleInf">2</span> al 5%. Tras lavar dos veces, las células se analizaron mediante citometría de flujo empleando los detectores de fluorescencia correspondientes.</p><p class="elsevierStylePara">6.- Producción de radicales libres intracelulares.</p><p class="elsevierStylePara">Se utilizó H<span class="elsevierStyleInf">2</span>DCF-DA (2¿,7¿-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Molecular Probes) que es una sonda no fluorescente que difunde libremente al interior celular como consecuencia de sus propiedades lipofílicas. Una vez en el citosol, las esterasas hidrolizan su enlace éster convirtiéndola en una sustancia hidrófoba (H<span class="elsevierStyleInf">2</span>DCF) incapaz de escapar del compartimento citosólico. Su molécula oxidada (DCF) es altamente fluorescente, por lo que permite identificar la presencia de oxidantes en el citosol mediante la medición de la fluorescencia que emiten las células tras excitación con un láser de 488 nm y que recogen los detectores correspondientes a la emisión de la fluorescencia a 530 nm (22).</p><p class="elsevierStylePara">7.- Estimación del contenido celular de Glutation reducido (GSH).</p><p class="elsevierStylePara">Uno de los principales antioxidantes celulares es el GSH. Los compuestos de la familia de los bimanos son reactivos derivados de tioles (23), esencialmente no fluorescentes, hasta que atraviesan la membrana plasmática por difusión pasiva, y forman compuestos fluorescentes azules al unirse a moléculas de glutation intracelular y a proteínas que contienen tioles. En nuestros experimentos hemos utilizado como sustrato el monobromobimano (mBBr, Molecular Probes) a una concentración final de 20 mM en 1 ml de RPMI. Las células se incubaron con el reactivo en baño de agua a 37ºC durante 10 minutos y después de dos lavados se analizaron mediante microscopía confocal tras ser excitadas con un láser ultravioleta a 405 nm.</p><p class="elsevierStylePara">8.- Análisis estadístico.</p><p class="elsevierStylePara">Los resultados numéricos se presentan como la media ± una desviación estándar de al menos tres experimentos. Se compararon las medias mediante test parámetricos (t de Student) o no paramétricos (test de Friedman) y se consideraron estadísticamente significativos valores de p inferiores a 0.05.</p><p class="elsevierStylePara">RESULTADOS.</p><p class="elsevierStylePara">La CsA provocó un descenso de NAD(P)H celular. Los valores de las medias de fluorescencia fueron de 55 ± 12.3 y de 41.5 ± 11.3 (UAF) para control y CsA 1mM respectivamente (p < 0.05). Los datos de cuatro experimentos están resumidos en la Figura 1.</p><p class="elsevierStylePara">Por otro lado, la CsA provocó un aumento de la fluorescencia por célula (39,3 ± 2,9 UAF) respecto de las células control (18,3 ± 2,4 UAF) tras incubación con MitoSOX Red, lo que indica un aumento de la producción de O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> mitocondrial (Figura 2).</p><p class="elsevierStylePara">Las células tratadas con CsA mostraron una fluorescencia a 530 nm tras incubación con NAO de 159.2 ± 116 UAF mientras que las controles tuvieron una fluorescencia de 239.1 ± 60.4 UAF (Figura 3). En el histograma se observan dos poblaciones celulares, una con alta y otra con baja fluorescencia (M1). La subpoblación M1, que representa células con alto contenido en cardiolipina oxidada, fue de un 80% en las células tratadas con CsA y de un 47% en las controles (Figura 3).</p><p class="elsevierStylePara">La CsA indujo un descenso de la fluorescencia verde (223.6 ± 125.5 UAF, Figura 4b) emitida tras incubar las células con DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3) respecto a las células control (481.3 ± 170.8 UAF, Figura 4a). Además, se pueden distinguir dos subpoblaciones celulares en función de la fluorescencia verde: las de valores más bajos (cuadrante inferior izquierdo) representa el 60% de las células tratadas con el fármaco y el 27% de las controles. Finalmente, la CsA propició la aparición de una tercera población de aproximadamente un 15% del total (marcada con línea discontinua) que tiene una fluorescencia verde intermedia; estas células además presentan fluorescencia roja disminuida, lo que podría indicar una mayor susceptibilidad a despolarizarse.</p><p class="elsevierStylePara">Los experimentos con DCFH-DA revelaron un aumento de la fluorescencia en las células tratadas con el fármaco (4211 UAF por célula, Figura 5b) respecto a las controles (1997 UAF por célula, Figura 5a) como consecuencia de la oxidación del sustrato por un aumento de la producción de radicales libres intracelulares. Finalmente, la tinción con monobromobimano (mBrB) mostró un mayor contenido de tioles reducidos (GSH) en las células control (2863 UAF por célula, Figura 5c) respecto a las tratadas con CsA (631 UAF por célula, Figura 5d). </p><p class="elsevierStylePara">DISCUSIÓN.</p><p class="elsevierStylePara">Se ha demostrado que la nefrotoxicidad inducida por CsA se debe, al menos en parte, a la producción de ROS (10, 11, 14, 16). Los mecanismos moleculares por los que la CsA produce ROS no son bien conocidos, pero se ha considerado que su formación podría favorecerse por la acción del fármaco sobre sistemas como el citocromo P450, NADPH oxidasa o xantina oxidasa o bien como consecuencia de la disminución de los sistemas antioxidantes intracelulares (24). Como una de las fuentes fisiológicas principales de ROS son las mitocondrias, nuestro estudio se planteó con el fin de definir el posible papel de la mitocondria en la nefrotoxicidad inducida por CsA. De hecho, en condiciones normales, se estima que el 1-2% del oxígeno de la cadena respiratoria se convierte en O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> (25). Las mitocondrias disponen, no obstante, de un complejo sistema de antioxidantes capaces de detoxificar estos ROS (25). Entre ellos se encuentran enzimas (como la superóxido dismutasa, glutation peroxidasa, catalasa, glutation reductasa o glutation NADP transhidrogenasa) y otras moléculas de menor tamaño (como glutation, NAD(P)H, vitaminas E y C) que combinadas constituyen un eficaz sistema antioxidante (26). La acción de estos componentes está integrada de forma que el O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> liberado en la cadena respiratoria es metabolizado por la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD-Mn) a peróxido de hidrógeno y éste a su vez es detoxificado por la glutation peroxidasa intra y/o extramitocondrial (27-29). La glutation peroxidasa se mantiene reducida gracias al glutation, que a su vez es reducido por la NADH y NAD(P)H por la NADP-transhidrogenasa (27).</p><p class="elsevierStylePara">Hemos demostrado que la CsA produce un aumento de la producción mitocondrial de O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> y que este aumento es paralelo al descenso de NADPH, molécula fundamental en el mantenimiento del estado reducido del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial y cuyo descenso está relacionado con diferentes modelos de muerte celular (30, 31). Experimentos realizados en mitocondrias aisladas, han sugerido que el descenso de NADPH podría ser secundario a la oxidación de enzimas involucrados en su síntesis como la deshidrogenasa o citrato sintasa mitocondriales (32). El aumento de O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> también ha sido descrito por otros autores en células tubulares y endoteliales (24, 33, 34). Aunque los mecanismos íntimos por los que se produce este efecto no son bien conocidos, se ha sugerido que podría activar el enzima NADPH oxidasa (33).</p><p class="elsevierStylePara">También demostramos que la CsA aumentó los ROS intracelulares del mismo modo que han evidenciado otros autores (24, 35, 36). Además, produjo una reducción del contenido celular de tioles reducidos, fenómeno que puede ser determinante en el metabolismo celular, ya que muchas proteínas contienen grupos tioles y que su oxidación, con formación de puentes disulfuro, puede provocar alteraciones de su estructura tridimensional y funcionalidad (37). Por otro lado, el GSH mantiene reducida en condiciones normales la enzima glutation-peroxidasa (27, 29) y este hecho contribuye a disminuir la capacidad antioxidante celular.</p><p class="elsevierStylePara">Las consecuencias del aumento de O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> pueden ser muy nocivas para la célula, ya que es altamente reactivo y puede oxidar con mucha facilidad moléculas adyacentes (25). La CL es el principal lípido constituyente de la membrana interna mitocondrial y contribuye a la estabilización de la misma a través de sus interacciones con las proteínas y los complejos de la cadena respiratoria (38-40). Su alto contenido en ácidos grasos insaturados y su proximidad a los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial la hacen particularmente susceptible al daño oxidativo por ROS (41-44). Nuestros experimentos han demostrado que la CsA alteró la emisión de fluorescencia de NAO, sustrato que se une de forma específica a la CL, sugiriendo la oxidación de la misma. También observamos un aumento del porcentaje de células con alto contenido de cardiolipina oxidada. Este hecho puede tener consecuencias trascendentales sobre la fisiología y estructura mitocondriales. Uno de los efectos más precoces deriva de que la CL oxidada se une con menos afinidad al citocromo c, propiciando la liberación del mismo al espacio intermembrana mitocondrial (45). Por otro lado, la oxidación de la CL afecta a varios complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, alterando el flujo electrónico a través de ellos (20). Como existe un mecanismo acoplado al transporte de electrones, que consiste en la traslocación de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, tampoco se generará el gradiente electroquímico imprescindible para la síntesis de ATP mitocondrial, comprometiéndose también el metabolismo energético celular (19).</p><p class="elsevierStylePara">Nuestros resultados, utilizando DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3) corroboran esta hipótesis y demuestran que la CsA produjo un descenso del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y un aumento del porcentaje de células despolarizadas. Hallazgos similares han sido descritos por otros autores en diferentes modelos celulares (24, 36). Así, en monocitos humanos se ha demostrado que la CsA provoca despolarización de la membrana mitocondrial y aumenta el porcentaje de células despolarizadas a lo largo del tiempo, de un modo paralelo al aumento de síntesis de ROS (36). La CsA también provocó un aumento de la liberación del citocromo c mitocondrial al citosol, sugiriendo que produce una apertura de los denominados poros de transición de permeabilidad mitocondrial (PTPM) (36). Éstos son estructuras no totalmente definidas que parecen formarse en lugares de contacto de las membranas mitocondriales externa e interna (37, 46-48). Se ha descrito que su apertura puede condicionar la liberación de factores proapoptóticos mitocondriales como el citocromo c (37, 45, 48). Así, se ha demostrado que paralelamente a inducir despolarización de la membrana mitocondrial, la CsA aumentó la actividad de la caspasa 3 y aparecieron marcadores sugestivos de apoptosis celular (positividad para anexina y fragmentación de DNA) (24, 36). La apertura de los poros además, originaría un desacoplamiento de la cadena respiratoria y la interrupción de la trasferencia de electrones por la liberación del citocromo c con un aumento añadido de la producción de O<span class="elsevierStyleInf">2</span><span class="elsevierStyleSup">.-</span> (49). Con dosis más elevadas, la CsA puede originar incluso disrupción de la membrana plasmática, liberación de LDH y, en ultima instancia, necrosis celular (36, 50).</p><p class="elsevierStylePara">Estudios previos han demostrado que la CsA provoca apoptosis celular, aunque los mecanismos íntimos no se conocen completamente (51). Una hipótesis plausible es que el daño mitocondrial provocado por la CsA, con apertura de PTPM, despolarización mitocondrial, oxidación de cardiolipina y eventual liberación de citocromo <span class="elsevierStyleItalic">c</span> al citoplasma tiene un papel relevante en el desencadenamiento de la apoptosis (45).</p><p class="elsevierStylePara">En definitiva, nuestros resultados sugieren que la CsA provoca un aumento de ROS en la mitocondria y que a su vez, la mitocondria se ve afectada por este aumento, originándose oxidación de la cardiolipina de la membrana interna y alteración del potencial de membrana, fenómenos que pueden tener consecuencias sobre la estructura (formación de PTPM y liberación de citocromo c) y función mitocondrial (afectación de la cadena respiratoria y síntesis de ATP) (52). El daño mitocondrial puede a su vez condicionar la puesta en marcha de eventos que conducen a apoptosis o necrosis celular.</p><p class="elsevierStylePara">Aunque todavía no se ha demostrado claramente en humanos que la nefrotoxicidad por CsA u otros fármacos pueda revertirse con antioxidantes exógenos, nuestros experimentos abren nuevas vías de conocimiento que pueden ayudar a conocer mejor el papel de los ROS en la toxicidad celular renal.</p><p class="elsevierStylePara">AGRADECIMIENTOS.</p><p class="elsevierStylePara">Este estudio ha sido posible gracias a una ayuda de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha (04065-00). J Pérez de Hornedo, M Calvino Fernández y S Benito Martínez han disfrutado de becas de la Fundación Francisco Cobos, la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha (03017-00) y Schering Plough, respectivamente.</p><p class="elsevierStylePara">BIBLIOGRAFÍA.</p><p class="elsevierStylePara">1. Calne RY, White DJ, Thiru S, Evans DB, McMaster P, Dunn DC, et al. 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Análisis del contenido de cardiolipina mitocondrial.</p><p class="elsevierStylePara">La CsA disminuye la fluorescencia verde de NAO respecto a las células controles 1.7 veces (p<0.05) y aumenta el porcentaje de células con alto contenido en cardiolipina oxidada (M1).</p><p class="elsevierStylePara">FIGURA 4. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial.</p><p class="elsevierStylePara">Tras marcaje con DIOC<span class="elsevierStyleInf">2</span>(3), las células tratadas con CsA (b) experimentaron una disminución de 2.2 veces del valor medio de fluorescencia a 530 nm (green) respecto a las controles (a) (p<0.05). Se marca con línea discontinua una subpoblación con fluorescencia a 530 nm intermedia y fluorescencia a 575 nm (red) disminuida (células con mayor tendencia a despolarizarse).</p><p class="elsevierStylePara">FIGURA 5. Radicales libres intracelulares.</p><p class="elsevierStylePara">En el panel superior se observa que la CsA (b) provocó un aumento de la fluorescencia emitida por DCFH-DA respecto a las células control (a).</p><p class="elsevierStylePara">En el panel inferior se muestra que la tinción con monobromobimano (mBrB) reveló un mayor contenido en tioles reducidos en células controles (a) respecto a células tratadas con CsA (b).</p> " "pdfFichero" => "P1-E260-S132-A4805.pdf" "tienePdf" => true "PalabrasClave" => array:2 [ "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec430389" "palabras" => array:1 [ 0 => "Ciclosporina A, mitocondria, especies reactivas de oxígeno, anión superóxido, cardiolipina" ] ] ] "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec430390" "palabras" => array:1 [ 0 => "Cyclosporin A, mitochondria, NAD(P)H, superoxide anion, cardiolipin, reactive oxygen species" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "resumen" => array:2 [ "es" => array:1 [ "resumen" => "Estudiamos el efecto de la ciclosporina A (CsA) sobre la estructura y función mitocondrial en células LLC-PK1. 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Our results showed that CsA decreased NAD(P)H and membrane potential, and increased O2.- in mitochondria. CsA also provoked oxidation of cardiolipin. Furthermore, CsA increased intracellular ROS production and decreased GSH content. These results suggest that CsA has crucial effects in mitochondria. CsA modified mitochondrial physiology through the decrease of antioxidant mitochondrial compounds as NAD(P)H and the dissipation of mitochondrial membrane potential and increase of oxidants as O2.-. Also, CsA alters lipidic structure of inner mitochondrial membrane through the oxidation of cardiolipin. These effects trigger a chain of events that favour intracellular synthesis of ROS and depletion of GSH that can compromise cellular viability. Nephrotoxic cellular effects of CsA can be explained, at least in part, through its influence on mitochondrial functionalism. 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| 2023 Agosto | 57 | 36 | 93 |
| 2023 Julio | 94 | 34 | 128 |
| 2023 Junio | 109 | 24 | 133 |
| 2023 Mayo | 127 | 39 | 166 |
| 2023 Abril | 64 | 19 | 83 |
| 2023 Marzo | 61 | 27 | 88 |
| 2023 Febrero | 51 | 32 | 83 |
| 2023 Enero | 71 | 35 | 106 |
| 2022 Diciembre | 75 | 50 | 125 |
| 2022 Noviembre | 116 | 31 | 147 |
| 2022 Octubre | 91 | 41 | 132 |
| 2022 Septiembre | 77 | 44 | 121 |
| 2022 Agosto | 83 | 44 | 127 |
| 2022 Julio | 73 | 54 | 127 |
| 2022 Junio | 59 | 31 | 90 |
| 2022 Mayo | 89 | 41 | 130 |
| 2022 Abril | 95 | 40 | 135 |
| 2022 Marzo | 47 | 41 | 88 |
| 2022 Febrero | 91 | 34 | 125 |
| 2022 Enero | 69 | 36 | 105 |
| 2021 Diciembre | 71 | 43 | 114 |
| 2021 Noviembre | 81 | 42 | 123 |
| 2021 Octubre | 75 | 61 | 136 |
| 2021 Septiembre | 79 | 38 | 117 |
| 2021 Agosto | 79 | 38 | 117 |
| 2021 Julio | 49 | 34 | 83 |
| 2021 Junio | 46 | 18 | 64 |
| 2021 Mayo | 66 | 30 | 96 |
| 2021 Abril | 157 | 59 | 216 |
| 2021 Marzo | 99 | 32 | 131 |
| 2021 Febrero | 117 | 34 | 151 |
| 2021 Enero | 60 | 29 | 89 |
| 2020 Diciembre | 53 | 14 | 67 |
| 2020 Noviembre | 50 | 14 | 64 |
| 2020 Octubre | 74 | 21 | 95 |
| 2020 Septiembre | 54 | 11 | 65 |
| 2020 Agosto | 54 | 17 | 71 |
| 2020 Julio | 76 | 20 | 96 |
| 2020 Junio | 74 | 18 | 92 |
| 2020 Mayo | 81 | 17 | 98 |
| 2020 Abril | 145 | 13 | 158 |
| 2020 Marzo | 79 | 17 | 96 |
| 2020 Febrero | 78 | 24 | 102 |
| 2020 Enero | 87 | 33 | 120 |
| 2019 Diciembre | 66 | 20 | 86 |
| 2019 Noviembre | 73 | 22 | 95 |
| 2019 Octubre | 77 | 13 | 90 |
| 2019 Septiembre | 53 | 19 | 72 |
| 2019 Agosto | 60 | 18 | 78 |
| 2019 Julio | 53 | 16 | 69 |
| 2019 Junio | 62 | 13 | 75 |
| 2019 Mayo | 51 | 22 | 73 |
| 2019 Abril | 104 | 47 | 151 |
| 2019 Marzo | 48 | 14 | 62 |
| 2019 Febrero | 25 | 26 | 51 |
| 2019 Enero | 34 | 16 | 50 |
| 2018 Diciembre | 49 | 39 | 88 |
| 2018 Noviembre | 46 | 15 | 61 |
| 2018 Octubre | 63 | 11 | 74 |
| 2018 Septiembre | 44 | 19 | 63 |
| 2018 Agosto | 35 | 17 | 52 |
| 2018 Julio | 45 | 7 | 52 |
| 2018 Junio | 31 | 10 | 41 |
| 2018 Mayo | 40 | 12 | 52 |
| 2018 Abril | 46 | 8 | 54 |
| 2018 Marzo | 39 | 13 | 52 |
| 2018 Febrero | 29 | 6 | 35 |
| 2018 Enero | 28 | 7 | 35 |
| 2017 Diciembre | 35 | 8 | 43 |
| 2017 Noviembre | 47 | 8 | 55 |
| 2017 Octubre | 28 | 10 | 38 |
| 2017 Septiembre | 36 | 12 | 48 |
| 2017 Agosto | 32 | 13 | 45 |
| 2017 Julio | 43 | 16 | 59 |
| 2017 Junio | 47 | 14 | 61 |
| 2017 Mayo | 46 | 13 | 59 |
| 2017 Abril | 36 | 9 | 45 |
| 2017 Marzo | 40 | 7 | 47 |
| 2017 Febrero | 33 | 3 | 36 |
| 2017 Enero | 21 | 6 | 27 |
| 2016 Diciembre | 72 | 6 | 78 |
| 2016 Noviembre | 86 | 7 | 93 |
| 2016 Octubre | 91 | 14 | 105 |
| 2016 Septiembre | 138 | 7 | 145 |
| 2016 Agosto | 233 | 6 | 239 |
| 2016 Julio | 160 | 4 | 164 |
| 2016 Junio | 147 | 0 | 147 |
| 2016 Mayo | 137 | 0 | 137 |
| 2016 Abril | 112 | 0 | 112 |
| 2016 Marzo | 83 | 0 | 83 |
| 2016 Febrero | 117 | 0 | 117 |
| 2016 Enero | 127 | 0 | 127 |
| 2015 Diciembre | 138 | 0 | 138 |
| 2015 Noviembre | 103 | 0 | 103 |
| 2015 Octubre | 122 | 0 | 122 |
| 2015 Septiembre | 94 | 0 | 94 |
| 2015 Agosto | 95 | 0 | 95 |
| 2015 Julio | 103 | 0 | 103 |
| 2015 Junio | 59 | 0 | 59 |
| 2015 Mayo | 83 | 0 | 83 |
| 2015 Abril | 39 | 0 | 39 |
| 2015 Febrero | 1257 | 0 | 1257 |
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